Extracto
La quimioterapia se utiliza comúnmente en los tratamientos contra el cáncer, sin embargo, sólo el 25% de los cánceres son sensibles y una proporción significativa desarrolla resistencia. El supresor de tumores p53 es crucial para el desarrollo del cáncer y la terapia, pero ha sido menos susceptibles a aplicaciones terapéuticas debido a la complejidad de su acción, que se refleja en 66.000 documentos que describen su función. Aquí nos proporcionan un enfoque sistemático para integrar esta información mediante la construcción de un modelo lógico a gran escala de la interactoma p53 usando extensa base de datos y la integración de la literatura. El modelo contiene 206 nodos que representan los genes o proteínas, de entrada daño en el ADN, la apoptosis y la senescencia celular salidas, conectadas por 738 interacciones lógicas. Las predicciones de los
in silico
knock-out y el análisis del modelo de estado estacionario fueron validados mediante búsquedas en la literatura y
in vitro
experimentos basados. Identificamos una regulación al alza de Chk1, ATM y ATR vías p53 en células negativas y otros 61 predicciones obtenidas mediante pruebas eliminatorias que imitan las mutaciones. La comparación de modelos de simulación con los datos de microarrays demostró una tasa significativa de predicciones acertadas que oscilan entre el 52% y el 71% dependiendo del tipo de cáncer. Los factores de crecimiento y receptores de FGF2, IGF1R, PDGFRB y TGFA fueron identificados como factores que contribuyen de forma selectiva para el control de U2OS osteosarcoma y el crecimiento de células de cáncer de colon HCT116. En resumen, ofrecemos la prueba de principio de que este modelo versátil y predictivo tiene un enorme potencial para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la identificación de vías en pacientes individuales que contribuyen al crecimiento del tumor, la definición de una subpoblación de pacientes que respondieron "altos" y la identificación de los cambios en las vías que conduce a resistencia a la quimioterapia
Visto:. Tian K, R Rajendran, Doddananjaiah M, Krstic-Demonacos M, Schwartz JM (2013) Dinámica de daño en el ADN inducido a Caminos del cáncer. PLoS ONE 8 (9): e72303. doi: 10.1371 /journal.pone.0072303
Editor: Peter Csermely, Universidad de Semmelweis, Hungría
Recibido: 20 de mayo de 2013; Aceptado: 9 Julio 2013; Publicado: 4 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tian et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias Universidad de Manchester propiedad Intelectual para la financiación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la proteína p53 ha sido una de las proteínas más estudiadas desde su descubrimiento en 1979. desempeña un papel central en la regulación de la supervivencia celular y el desarrollo del cáncer; mutaciones de p53 se encuentran en más de 50% de los tumores humanos y alteraciones o falta de la función de p53 se ha relacionado con la mayoría de tipos de células cancerosas. La proteína p53 actúa como un factor de transcripción que regula la expresión de un gran número de genes aguas abajo por mecanismos complejos [1]. Tiene efectos anti-proliferativos tales como la detención del ciclo celular, apoptosis, y la senescencia celular en respuesta a diversas señales de estrés. Además, p53 es un nodo crítico de la circuitería celulares implicados en la respuesta fisiológica a los factores de crecimiento o estímulos oncogénicos anormales. Post-translacional modificaciones, las interacciones proteína-proteína y la estabilización de proteínas se encuentran para ser niveles cruciales de control de la actividad de p53.
Sin embargo, a pesar de su papel fundamental p53 ha sido menos susceptibles de aplicaciones terapéuticas que otros genes o proteínas diana que se utilizan con éxito en tratamientos contra el cáncer [2]. La comprensión de los mecanismos de la vía de p53 tiene tanto interés académico y comercial para el diseño de nuevas terapias contra el cáncer y la selección de los candidatos más seguros medicamento contra el cáncer [3]. Una de las principales razones por las que ha sido tan difícil de explotar nuestro conocimiento de p53 para aplicaciones terapéuticas es de hecho la complejidad de su acción. Hay más de 66.000 documentos sobre p53 en la literatura científica, y sin embargo, aún están lejos de comprender los detalles de su función. Esta observación requiere un enfoque más sistemático para integrar esta gran cantidad de información en representaciones coherentes que permitan una mejor comprensión de los mecanismos que regulan el nivel de los sistemas la función de p53.
Redes y Sistemas métodos de biología están ofreciendo nuevas y prometedoras herramientas para estudiar complejos mecanismos implicados en el desarrollo de las enfermedades [4].
En modelos in silico
puede integrar grandes conjuntos de interacciones moleculares en representaciones coherentes, susceptibles de pruebas sistemáticas y simulaciones predictivas. Modelos de diversas escalas y complejidad computacional se están desarrollando, a partir de las representaciones de la red cualitativos a cuantitativos modelos cinéticos y estocásticos [5] - [7]. En el caso de p53, la enorme cantidad y la complejidad de las interacciones moleculares implicados hace un modelo cinético a gran escala fuera de su alcance. Sin embargo, una gran cantidad de conocimiento biológico es disponible en p53 que no está en forma de datos de cinética cuantitativa, pero en la forma de la información cualitativa. Por ejemplo, numerosos informes indicaron que ATM (ataxia telangiectasia mutada) afecta a p53 en respuesta al daño de ADN [8]. A pesar de que 1350 publicaciones describen la relación entre la ATM y p53 en PubMed, 57 documentos indican que ATM fosforila p53 y sólo 11 documentos incluyen la información que ATM fosforila y activa p53. Del mismo modo, los ejemplos de genes diana de p53 aguas abajo, tales como Bax (proteína X BCL2-asociado) que controlan el proceso de apoptosis o CDKN1A (quinasa inhibidor 1A dependiente de ciclina (p21, Cip1)) que controlan la detención del ciclo celular están bien estudiados [9], [10]. Sin embargo, la cinética detalladas de sólo un subconjunto de estas interacciones es conocido [11].
Por esta razón, la hipótesis de que nuestra comprensión de la función de p53 puede ser mejorada mediante la integración sistemática de tal conocimiento cualitativo en un gran -scale modelo lógico y consistente. A diferencia de los modelos cinéticos, los modelos lógicos no utilizan ecuaciones cinéticas que representan el mecanismo dinámico detallada de cada interacción individual, pero a diferencia de las redes cualitativos, ellos incorporan información sobre los efectos de las interacciones. Esta información se representa generalmente en forma de lógica booleana: cada nodo (gen /proteína) en el modelo lógico puede tener dos estados determinados, 0 o 1, lo que representa una forma inactiva o activa respectivamente; cada interacción puede tener dos efectos determinados, activación o inhibición del nodo de destino. Las ventajas de los modelos lógicos son que las simulaciones son rápido, incluso para los modelos grandes, que permiten una extensa exploración del espacio de estados de nodos con la identificación de estados estacionarios o atractores de ciclo, y que proporcionan una aproximación de la dinámica no lineal reales de todo el sistema . Por ejemplo, el grupo de Schlatter construyó una red de Boole basado en búsquedas en la literatura y se describe el comportamiento de las dos vías de la apoptosis intrínsecos y extrínsecos en respuesta a diversos estímulos. Su modelo reveló la importancia de los bucles de retroalimentación de diafonía y en el control de las vías de apoptosis [12]. Rodríguez et al. construido una gran red de Boole para la FA /BRCA vía (Anemia de Fanconi /Cáncer de Mama) y simulado la reparación del ADN (ICL entre cadenas cruzadas enlaces). Este modelo revela la relación entre la vía de reparación del ADN activado y defectos en la ruta Fanconi /BRCA [13]
.
En este artículo, se presenta un modelo lógico del sistema de p53 que integra 203 genes /proteínas, ADN entrada daños, la apoptosis y la senescencia celular salidas, conectadas por 738 interacciones lógicas compiladas a partir de las bases de datos existentes y la literatura científica. El modelo, denominado en lo sucesivo PKT206 (PKT de pie para el modelo p53 construido por Kun Tian, y el número que indica la población de proteínas o genes nodos incluidos en el modelo) puede ser utilizado para predecir efectos de las vías de daño ADN sobre el destino celular. Se presenta un análisis funcional de este modelo e investigamos los efectos de los golpes de gracia utilizando el software de CellNetAnalyzer [14]. Varias predicciones producidas por el modelo fueron validados en la literatura externa y nuevos datos experimentales, la adición de nuevas contribuciones a nuestro conocimiento del sistema de p53. El rendimiento del modelo fue probado mediante el análisis de microarrays y nos muestran que la proporción de buenas predicciones sustancialmente superior al de las predicciones al azar, que oscila entre el 52% y el 71%. Se encontró que el modelo PKT206 es una herramienta predictiva prometedor que puede aumentar nuestra comprensión de los complejos mecanismos de las vías de p53 y proporciona un nuevo enfoque para el tratamiento personalizado del cáncer.
Resultados
Construcción modelo
con el fin de organizar el conocimiento de la interactoma p53 en un marco coherente, un modelo lógico del sistema de p53 fue construido (Figura 1, Tabla S1 S1 en el archivo). En este modelo, los nodos representan los genes o proteínas asociadas que interactúan con p53, y los bordes representan las interacciones entre ellos. Se consideran dos tipos de procesos que interactúan: activación o inhibición. En una interacción de activación, el resultado es una inducción de la actividad de nodo (s) de destino, y, en una interacción inhibitoria, el resultado es una represión de la actividad de nodo de destino (s) [14]. Por ejemplo, la inducción de p53 estimula la expresión de MDM2 (Mdm2, p53 E3 ubiquitina proteína ligasa homólogo (ratón)) [15], que está representado por una interacción activación de p53 a MDM2. Al mismo tiempo, la activación MDM2 conduce a la baja regulación de p53, que está representado por la inhibición de una interacción de MDM2 a p53 [16].
programas de interfaz Java fueron creados para extraer interacciones de p53 a partir de la base de datos STRING . A continuación, comisariada manualmente los datos y utilizamos las anotaciones de ontología de genes para conectar la red a la entrada y salida de daño en el ADN de la apoptosis. CellNetAnalyzer se utilizó para el análisis y simulaciones, y los resultados fueron validados a través de encuestas de literatura y enfoques experimentales incluyendo análisis de transferencia de microarrays y occidental.
A pesar de que existen numerosas bases de datos de grabación de interacciones genéticas y proteína-proteína, pocos registro el efecto de la interacción tiene en el nodo de destino. Una excepción notable es la cadena (Herramienta de búsqueda para la recuperación de los genes que interactúan /proteínas) base de datos [17], que distingue entre diferentes modos de acción, incluyendo la activación, inhibición y de unión. registros de interacción de la interactome p53 humana se recuperaron primero automáticamente de la base de datos STRING (ver Material y Métodos). Las interacciones se filtraron mediante la retención de las puntuaciones única de alta confianza como se define por STRING (más de 0,7). Sin embargo, debido a las limitaciones de los métodos de extracción de texto actual en la identificación de modos de acción, se encontró que incluso el grupo de interacciones de alta confianza para contener algunos errores. Para evitar que los datos incorrectos que se incluyeron en el modelo, todos los registros de la interacción fueron por lo tanto manualmente curada mediante encuestas a la literatura asociada y la búsqueda de evidencia adicional. Los ejemplos de los tipos de errores encontrados y detalles de las interacciones que se corrigieron tras el proceso de curación manual se proporcionan en la Tabla 2 y las Figuras S1-S4 en S1 Archivo.
Una pregunta recurrente en la construcción de
modelos in silico
es definir los límites del sistema. Con el fin de obtener una cobertura completa de la interactome p53, sin embargo, mantener el tamaño del sistema dentro de límites aceptables para la simulación, se incluyeron todas las interacciones de alta confianza con genes /proteínas que interactúan directamente con p53, y hemos añadido todas las interacciones entre estos genes /proteínas por no afectar directamente p53. Este proceso asegura que los circuitos de retroalimentación de regulación se incluyeron en el modelo. En algunos casos, diferentes proteínas se combinan en un único nodo que refleja el hecho de que la literatura anterior no distinguía entre ellos: este fue el caso de HRAS (v-Ha-ras, Harvey sarcoma de rata viral homólogo de oncogén), KRAS (V- Ki-ras2, Kirsten sarcoma de rata viral homólogo de oncogén), las ANR (RAS neuroblastoma viral (v-ras) homólogo de oncogén) y RASD1 (RAS, inducida por dexametasona 1), representada como un solo nodo RAS; CCNA1 (ciclina A1) y CCNA2 (ciclina A2) representa como CCNA; CSNK2A1 (caseína quinasa 2, alfa 1 polipéptido) y CSNK2A2 (caseína quinasa 2, alfa primer polipéptido) representado como CSNK2.
Las células responden a estímulos de estrés, incluyendo numerosos ionizante y la radiación UV (ultravioleta), activación de oncogenes, el calor shock, hipoxia, etc [18]. La respuesta al daño de ADN mediada por p53 está bien estudiado y más clínicamente relevante ya que la mayoría de las estrategias de tratamiento del cáncer implican vías de daño en el DNA. Por lo tanto, el daño del ADN se añadió como una señal de entrada mediante la conexión de la red a un solo nodo de entrada que representa el daño del ADN. Del mismo modo, la apoptosis y senescencia celular se seleccionaron como las salidas mejor estudiados y más clínicamente relevantes entre numerosas otras posibilidades incluyendo la detención del ciclo celular, reparación del ADN y la angiogénesis. Por lo tanto, la red estaba conectado a dos nodos de salida que representan la apoptosis y senescencia. Los enlaces de daño en el ADN y hacia la apoptosis y la senescencia se comisariada utilizando términos de ontología de genes (Tablas S3-S5 S1 en archivos), así como de curación manual adicional. El modelo resultante, denominado PKT206, compuesto por 203 nodos de genes /proteínas, un nodo de entrada (daño en el ADN), dos nodos de salida (apoptosis y senescencia) y 738 interacciones. Las listas completas de genes /proteínas y las interacciones con referencias a la evidencia basada en la literatura se proporcionan en las Tablas S1 y S3-S5 en S1 Archivo.
Estructura del modelo lógico p53
El nodo p53 está conectado a 202 genes o proteínas en la red y participa en interacciones 225 (Figura 2). Cinco capas se pueden distinguir en la red de acuerdo con la relación de nodos a p53: la señal de entrada, el daño del ADN; los nodos de aguas arriba de p53; p53 y MDM2 en sí; los nodos de aguas abajo de p53; y las salidas, la apoptosis y la senescencia. Se encontró que 67 nodos funcionaban como nodos de aguas arriba de p53. Por ejemplo, funciones ATM como un daño en el ADN nodo inducible aguas arriba de p53 [19]; p53 se activa directamente como a través de CHEK2 (kinasa de control 2) sobre regulación [20] - [22]. 146 nodos funcionaban como genes diana de p53, incluyendo genes pro apoptóticas bien estudiadas, tales como [9] BAX y CDKN1A que controla la detención del ciclo celular [23]. 11 genes funcionaban tanto como nodos anterior y posterior de p53 y estuvieron involucrados en dos etapas, ciclos de retroalimentación.
El modelo PKT206 representado por Cytoscape incluye 203 nodos de genes /proteínas, un nodo de entrada (daño en el ADN), dos nodos de salida (apoptosis y senescencia celular) y 738 bordes. conexiones de activación e inhibición se representan mediante flechas azules y rojas, respectivamente. El nodo de entrada estaba marcada por el verde; los nodos anteriores de p53 fueron marcados por el amarillo; p53 y MDM2 fueron marcados por el rojo, los nodos descendentes de p53 fueron marcados por los nodos de color azul y la salida de luz se caracterizaron por la naranja.
Se calculó el grado de conectividad de los 206 nodos de la red (Figura 3). El grado de conectividad de un gen indica el número de interacciones de este gen. El gen p53 fue más conectada, que participó en 225 interacciones en el modelo PKT206. Hubo 30 genes con grado de conectividad entre 10 y 100 y el resto de genes estaban involucrados en menos de 10 interacciones
La distribución de grado de 206 nodos en el modelo se obtuvo mediante el plugin para Cytoscape NetworkAnalyzer.; ambos ejes en la figura están en escala logarítmica.
La red contiene bucles de realimentación 30 de dos etapas en total, con la participación de 14 p53. Algunos de ellos juegan un papel importante en la regulación de p53; por ejemplo, los circuitos de retroalimentación que implica p53, MDM2 y MDM4 (unión MDM4 proteína p53 homólogo (ratón)), que incluyen cinco interacciones: p53 activa MDM2; MDM2 inhibe p53; MDM2 inhibe MDM4; MDM4 activa MDM2 y MDM4 inhibe MDM2 [24]. Los circuitos de retroalimentación juegan un papel crucial en la regulación de p53 y se cree que aumentar la robustez del sistema en respuesta a las perturbaciones [25].
P53 se ha implicado en numerosas respuestas celulares al estrés incluyendo IR (radiación ionizante), UV, activación de oncogenes, y la hipoxia. Para que este modelo sea capaz de predecir el destino celular en respuesta al estrés, que vinculó 20 nodos al daño en el ADN señal de entrada (Tabla S3 en File S1). La mayoría de los enlaces de daño en el ADN son activaciones y sólo 3 son inhibiciones (daño en el ADN inhibe PTTG1 (pituitaria tumor transformando 1), MYC (v-myc, mielocitomatosis homólogo oncogén viral (aviar)) y AURKA (Aurora quinasa A). Del mismo modo , controles de p53 numerosas respuestas celulares al estrés, tales como la detención del ciclo celular, daño en el DNA de reparación, la senescencia y la apoptosis. Hemos encontrado 95 enlaces entre nodos de genes aguas abajo y la apoptosis y 77 nodos interactúan con el nodo de la apoptosis. entre ellos, 18 nodos tanto promovido y evitamos apoptosis, 38 nodos de la apoptosis inducida única y 21 nodos sólo tenían la función anti-apoptótica. Hemos encontrado 52 genes relacionados con la senescencia de 61 enlaces, entre los cuales 28 Promover y 33 impiden la senescencia.
Análisis de dependencias en el modelo p53
dependencias lógicas entre los genes /proteínas están representados por la matriz de dependencia [14], que representa los efectos entre todos los pares de nodos en el modelo. Seis tipos de efectos se definen por CellNetAnalyzer basada en la existencia (o no ) de caminos positivos y negativos entre dos nodos: ningún efecto, factor ambivalente, inhibidor débil, activador débil, inhibidor potente y fuerte activador (ver Métodos para más detalles). Hay 42,436 (206 × 206) elementos de la matriz de dependencia, de los cuales 23.468 corresponden a las interacciones que tienen ningún efecto; 16.540 son factores ambivalentes; 1100 son inhibidores débiles; 1240 son activadores débiles; 33 son inhibidores fuertes y 55 son activadores fuertes (Tabla S6 en S1 File). La mayoría de los elementos de la matriz de dependencia son ningún efecto o factores ambivalentes. El gran número de factores ambivalentes se debe a la complejidad de los efectos de regulación entre los nodos, que se ven afectados por ambos bucles y las vías de retroalimentación positiva y negativa. Por ejemplo, hay dos caminos positivos y negativos de ATM a CHEK2: la trayectoria positiva es una activación directa de CHEK2 por ATM, mientras que el camino negativo es una inhibición indirecta, como ATM activa p53, p53 inhibe MYC, MYC activa E2F1 (E2F factor de transcripción 1), y E2F1 activa CHEK2. Como resultado, la interacción entre estos dos nodos se determina por oposición a la activación y la inhibición de efectos, lo que resulta en que se clasifica como ambivalente (Figura S5 en File S1).
En silico
simulación de efectos de mutación
con el fin de evaluar la capacidad del modelo para predecir PKT206 efectos de perturbación, se realizó
in silico
pruebas knock-out, en el que un nodo particular fue retirado de la red imitando así en los efectos de mutación in vivo. Como el 85% de los genes o proteínas en el modelo PKT206 estaban mal conectado, se seleccionaron p53 y esos 30 genes con más de 10 interacciones para realizar
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knock-out pruebas. Por ejemplo, simulamos una p53 knock-out quitando el nodo de la red de p53 y analizaron los efectos de esta perturbación. Mediante la comparación de la matriz de dependencia después de que el nodo de p53 se eliminó con el caso de tipo salvaje, los cambios en los elementos de matriz revelaron cómo las relaciones entre los nodos se vieron afectados por la eliminación. 11,785 de los 42,025 (205 × 205) elementos de la matriz cambiado como resultado de la eliminación de p53 (Figura 4A). Los cambios importantes se enumeran en la Tabla S1 S7 en Archivo. Los cambios más significativos eran de factores ambivalentes a activadores o inhibidores, lo que refleja el hecho de que p53 juega un papel importante en la modulación de los efectos del sistema. 11 de 31
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pruebas knock-out tenido grandes cambios en la nueva matriz de dependencias cuando se extrajo de un cierto nodo (Tabla S6 en S1 Archivo). 63 predicciones potenciales de los cambios importantes en las células de dependencia se obtuvieron a partir de los 11
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pruebas knock-out (Tabla 1). No hubo grandes cambios de efectos que se encuentran en el otro 20
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ronda pruebas.
(A) Distribución de los cambios en la matriz de la dependencia de la p53
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ronda en comparación con la de tipo salvaje. El ciclo gris representa ningún efecto elementos, el círculo naranja representa factores ambivalentes, el círculo verde claro representa activadores débiles, el círculo de color rosa representan inhibidores débiles, el círculo rojo oscuro representa inhibidores fuertes, y el círculo de color verde oscuro representa activadores fuertes; la dirección de la flecha representa la dirección de los cambios en el knock-out. (B) la activación de Chk1 (chek1) se incrementa en segundo plano negativo p53. células U2OS que tienen p53 funcional y células SAOS2 que carecen de p53 funcional fueron tratados con 10 etopósido mu M durante 16 horas. Los extractos celulares se analizaron por SDS-PAGE y análisis de transferencia Western usando anticuerpos contra el total de Chk1, ATR y ATM. ATM y ATR fosforilada en Ser 345. Chk1
Hemos confirmado 4 de estos 63 predicciones a través de búsquedas en la literatura, centrándose en los principales cambios causados por la deleción de p53 que se espera que tengan efectos experimentales más fuerte . Por ejemplo, el efecto de daño del ADN en FAS (Fas (superfamilia de receptores de TNF, miembro 6)) cambió de un factor ambivalente en el modelo de p53 de tipo salvaje a un activador fuerte cuando se eliminó p53. El efecto de daño en el ADN en FAS se clasificó como ambivalente en las células de tipo salvaje debido a que hay posibles trayectorias negativas de daño en el ADN a través de FAS MYC y PTTG1, además de un camino positivo directo de daño en el ADN a FAS. Cuando se elimina p53, sólo el camino positivo subsiste. Maná et al. han determinado que en las células p53 menos, los niveles de proteína Fas se encuentra elevado en virtud de daño en el ADN de p53 en comparación con las células de tipo salvaje, que está de acuerdo con nuestra predicción [26]. De manera similar a FAS, el efecto de LATS2 (LATS, gran supresor de tumor, homólogo 2 (Drosophila)) sobre la apoptosis fue cambiado de un factor ambivalente en el modelo de p53 de tipo salvaje a un activador fuerte cuando se eliminó p53. Se encontró que tanto en p53 de tipo salvaje (A549) y las células p53 menos (H1299), LATS2 fue capaz de inducir apoptosis y que la apoptosis se incrementa ligeramente en H1299, medido por PARP y caspasa 9 división [27]. Hemos observado que el efecto de daño del ADN en chek1 (quinasa de punto de control 1) cambió de un factor ambivalente en la p53 de tipo salvaje a un activador fuerte cuando se eliminó p53. Se encontraron niveles de proteína chek1 a ser mayor en p53 - /- las células que en p53 células de cáncer colorrectal + /+ HCT116 tratados por daunorrubicina [28], que también coincide con nuestras predicciones (Tabla 1). Se informó de que KLF4 (Kruppel-como factor de 4 (intestino)) causó más reducción de CCNB1 expresión (ciclina B1) en p53 - /- que en HCT116 p53 + células /+ HCT116 [29] y que coincidía con nuestra predicción del modelo. Sin embargo, se encontró una predicción de los 63 predicciones opuesta a la evidencia de la literatura. La predicción señaló que IFNA1 (interferón alfa 1) aumento de TLR3 (toll-like receptor 3) en las células mutantes p53 p53 en comparación con las células de tipo salvaje. Pero esto era contrario al hecho de reportada por Taura et al. que IFNA1 expuesta al dañar el ADN fármaco 5-fluoro-uracilo (5-FU) reduce la expresión de TLR3 en p53 - /- células HCT116 en comparación con p53 + /+ células HCT116 [30]
Además. validadas a partir de la literatura, se obtuvo
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evidencia experimental basado para apoyar nuevas predicciones del modelo. El modelo predice que, en ausencia de p53 funcional, los efectos de la ATM y ATR (ataxia telangiectasia y Rad3 relacionados) en chek1 haría tanto el cambio de los factores activadores de ambivalentes fuertes. Un análisis de transferencia Western de las células de osteosarcoma humano U2OS que tienen p53 de tipo salvaje, y de las células SAOS2 que tienen p53 no funcional mutante, demostró que chek1 se activa a un grado más alto en el fondo mutante p53 que en el fondo de p53 de tipo salvaje (Figura 4B) validar esta predicción. Además, se observaron niveles más altos y la activación potencial de ATM y ATR quinasas en células p53 menos que en células positivas de p53. Según el modelo, hay dos caminos positivas y negativas entre ATM, ATR, chek1, y p53 en las células de tipo salvaje, y por lo tanto en las células mutantes de p53 se altera este equilibrio (Figura 5). Esto confirma la capacidad de predicción de nuestro enfoque de modelado y tiene consecuencias para el tratamiento de tumores p53 negativos
(A) vías positivas y negativas de ATM /ATR a chek1 en células de tipo salvaje de p53, como se conoce a partir de estudio de la literatura.; (B) las vías positivas y negativas de ATM /ATR a chek1 en células p53 menos. ARF es dependiente de ciclina 2A inhibidor de la quinasa. PPM1D es la proteína fosfatasa 1D. PRB es retinoblastoma 1.
estado de equilibrio análisis lógico
La proteína p53 es conocido para mantener la estabilidad genómica y la ausencia de p53 conduce a la proliferación celular en respuesta al daño de ADN [31] . La ausencia de estabilidad genética provoca la acumulación de mutaciones en células normales y causa cáncer [32]. Con el fin de investigar cómo la pérdida de la estabilidad podría ser capturado por nuestro modelo, se realizó un análisis de estado estacionario lógica comparativa en el modelo p53 de tipo salvaje y
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p53 ronda.
En un estado estacionario lógica (LSS), el estado de cada nodo sigue siendo la misma en el tiempo [33]. Cada nodo puede tener tres estados diferentes: inactivado ( "0"), activa ( "1") o indeterminado ( "NaN"). Se investigaron cuatro escenarios para el análisis de estado estacionario lógica: (1) el daño del ADN se activa en p53 de tipo salvaje de fondo; (2) el daño del ADN no se activa en p53 de tipo salvaje de fondo; (3) el daño al ADN de p53 se activa en el fondo ronda; (4) el daño del ADN no se activa en el fondo p53 knock-out (Figura 6, Tabla 2 y la Tabla S8 en S1 Archivo). La comparación de los estados estacionarios lógicos en diferentes escenarios reveló que un gran número de estados de nodos no cambió con el cambio de la señal de entrada. Este resultado se explica por el gran número de efectos ambivalentes entre los nodos y los bucles de retroalimentación en la red, que hacen que el modelo sólido a las perturbaciones de la señal de entrada. La proporción de determinados estados era 181 de 206 nodos (87,9%) en el escenario (1), 182 de 206 nodos (88,3%) en el escenario (2), 94 de los 205 nodos (45,9%) en el escenario (3) y 95 de los 205 nodos (46,3%) en el escenario (4) (Tabla 2). Estas cifras muestran que casi la mitad de los nodos cuyo estado se determina en la de tipo salvaje, se convierten en no determinada en el
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p53 ronda
Los nodos con el estado "1". Eran representada en verde, los nodos con el estado "NaN" (no determinado) estuvieron representados en color naranja, y los nodos con el estado "0" estuvieron representados en rojo. (A) p53 de tipo salvaje cuando el daño del ADN era "ON"; (B) p53 de tipo salvaje cuando el daño del ADN era "OFF"; (C) mutante P53 cuando el daño del ADN era "ON"; (D) mutante P53 cuando el daño del ADN fue "OFF".
comparar el estado de 202 genes que interactúan con p53 en las células p53 de tipo salvaje en presencia de daño del ADN y los de las células mutantes p53 en la presencia de daño en el ADN, se encontró que sólo 29 genes fueron reguladas, 113 genes no cambian y 60 genes fueron regulados hacia abajo (Tabla 3). El cambio de FEN1 (endonucleasa de solapa específica de estructura 1) estado fue además verificado experimentalmente por Christmann et al, a través de encontrar que FEN1 fue reprimido en células nulas en p53 bajo el daño del ADN [34]. TLR3 se encontró que se redujeron reguladas en las células mutantes de p53 en virtud de los daños del ADN [35].
Al comparar el estado de estos 202 genes p53 en células de tipo salvaje en ausencia de daño en el ADN y los de p53 las células mutantes en ausencia de daño en el ADN (Tabla 3), se encontró que 30 genes fueron reguladas, 112 genes se mantuvieron las mismas y 60 genes se redujeron reguladas en las células de tipo salvaje de p53 en ausencia de daño en el ADN. El cambio de 6 nodos fueron verificados por O'Prey et al. [36]. 4 nodos se demostraron como predicciones correctas: los niveles de expresión de FAS (superfamilia de receptores de TNF, miembro 6), TNFRSF10B (factor de necrosis tumoral superfamilia de receptores, el miembro 10b), PERP (PERP, TP53 apoptosis efector) y p53AIP1 (proteína tumoral p53 regulada apoptosis la inducción de la proteína 1), se redujeron regulado de p53 células de tipo salvaje sin daño en el ADN a las células mutantes p53 sin daño en el ADN, mientras que la MDM2 otros 2 nodos y CDKN1A se predijo como sin cambios por la simulación del modelo. Sin embargo, O'Prey et al. observado su regulación por disminución de las células p53 de tipo salvaje y sin daños en el ADN de p53 células mutantes sin daño en el DNA [36]. De acuerdo con los criterios definidos en la sección de métodos, cuatro predicciones eran correctas y los otros dos eran pequeñas predicciones de error.
Al comparar el estado de estos 202 nodos en p53 células de tipo salvaje en presencia de daño en el ADN y los nodos en p53 células de tipo salvaje en ausencia de daño en el ADN (Tabla 3), se encontró que sólo 5 fueron de genes regulados, 185 genes no se cambiaron y 12 genes se redujeron reguladas en las células p53 de tipo salvaje inducida por daño en el ADN.
Comparando el estado de estos 202 nodos en las células mutantes de p53 en presencia de daño en el ADN y los nodos en las células mutantes de p53 en ausencia de daño del ADN (Tabla 3), encontramos que 7 genes fueron reguladas, 181 genes sigue siendo el mismo, y 14 genes se redujeron reguladas en las células mutantes de p53 inducida por daño en el ADN. En conjunto, estos resultados anteriores reflejan el hecho de que p53 ayuda a estabilizar el sistema.
Los cambios en el estado de genes anti-apoptóticos y anti-senescencia se muestran en la Tabla S9 en File S1 y las de pro-apoptótica y genes pro-senescencia se enumeran en la Tabla S1 S10 en archivo. Esta distribución ilustra la razón por la cual la salida de la apoptosis también se activó en p53 células mutantes. La mayoría de estos 56 genes pro-apoptóticos y 39 genes anti-apoptóticos no cambiaron en el mismo tipo de células tratadas por el daño del ADN. La ausencia de p53 causó cambios obvios de ambos genes pro-apoptóticos y anti-apoptóticos una vez que las células se trataron con daño en el DNA. El número de genes pro-apoptóticos y anti-apoptóticos, que son regulados hasta o hacia abajo-regulada aumentó con el agotamiento de p53. Entre los 56 genes pro-apoptóticos, FAS y p53AIP1 fueron reguladas en las células mutantes de p53 cuando son tratados por los daños en el ADN. FGF2 (factor de crecimiento de fibroblastos 2 (básico)) tenía tanto la función pro-apoptóticos y anti-apoptóticos en el modelo PKT206 y que se había reducido regulado en las células de tipo salvaje de p53 o p53 células mutantes en presencia de daño en el ADN. Notablemente, IGF1R (factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor) y PDGFRB (crecimiento del receptor del factor derivado de plaquetas, polipéptido beta) se upregulated en p53 escenarios menos, que junto con los cambios FGF2 destacan de factor mediada por vías de señalización de crecimiento como factor importante que contribuye a la supervivencia de estos tumores. Zhang et al.