Extracto
Antecedentes
La enfermedad facial del tumor del diablo (cáncer facial del demonio) es un cáncer que amenaza clonal único marsupial carnívoro más grande del mundo, el demonio de Tasmania (
Sarcophilus harrisii
) de extinción. Este tipo de cáncer transmisible se hace pasar entre los demonios individuales mediante la implantación de células durante las interacciones sociales. El tumor se presentó en una célula de Schwann de un solo diablo hace más de 15 años y desde entonces se ha expandido por clonación, sin mostrar signos de senescencia replicativa; en marcado contraste con una célula somática que muestra una capacidad finita para la replicación, conocido como el "límite de Hayflick".
Metodología /Principales conclusiones
En el presente estudio se investiga el papel de la longitud de los telómeros , medida como Telomere Copy Number (TCN), y la expresión de la telomerasa y shelterin gen, así como la actividad de la telomerasa en el mantenimiento de la hiperproliferación de las células tumorales Devil facial (DFT). Nuestros resultados muestran que las células DFT tienen telómeros cortos. Cáncer facial del demonio TCN no difiere entre las regiones geográficas o entre cepas. Sin embargo, TCN ha aumentado con el tiempo. proliferación celular ilimitado es probable que se han logrado a través de la observada sobre regulación de la subunidad catalítica de la telomerasa (
de TERT) y la activación concomitante de la telomerasa. Sobre regulación de la componente central de shelterina, el
TRF1
-intercating factor nuclear 2 (
TINF2
) proporciona un mecanismo para DFT longitud de los telómeros homeostasis. La mayor expresión de ambos
de TERT
y
TINF2
también pueden proteger a las células de DFT de la inestabilidad genómica y aumentar la proliferación tumoral.
Conclusiones /Importancia
células DFT aparecerá para controlar y regular la longitud de los telómeros individuales: los telómeros más cortos, es decir son alargadas por la sobre regulación de los genes relacionados con la telomerasa; telómeros más largos están protegidos de la elongación adicional por miembros del complejo shelterina, lo que puede explicar la falta de variación espacial y la tensión en el número de copias de los telómeros DFT. El aumento longitudinal observado en la expresión de genes en muestras de tejido de DFT y la actividad de la telomerasa en las líneas celulares DFT podría indicar una selección para los tumores más estables con alto potencial proliferativo
Visto:. Ujvari B, Pearse AM, Taylor R, S Pyecroft , Flanagan C, Gombert S, et al. (2012) y la homeostasis del telómero dinámica en un cáncer transmisible. PLoS ONE 7 (8): e44085. doi: 10.1371 /journal.pone.0044085
Editor: Gabriele Saretzki, Universidad de Newcastle, Reino Unido
Recibido: 14 Enero, 2012; Aceptado: 31 de julio de 2012; Publicado: 29 Agosto 2012
Copyright: © Ujvari et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por el Fondo Guiler Eric (Guarde el Recurso demonio de Tasmania): http://www.tassiedevil.com.au/tasdevil.nsf/Grants-&-scholarships/F3F98304778C800ECA2576CB007D1E6B, y el Consejo de Investigación Australiano: http://www.arc.gov.au/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
marsupial carnívoro más grande del mundo, el demonio de Tasmania (
Sarcophilus harrisii
) se ha convertido recientemente en peligro de extinción debido a un cáncer transmisible único, la enfermedad facial del tumor del diablo (cáncer facial del demonio) [1], [ ,,,0],2], [3]. Antes de la aparición de la enfermedad, los demonios eran comunes en toda Tasmania. Sin embargo, desde el primer avistamiento de cáncer facial del demonio en 1996, la enfermedad se ha extendido por todo el estado de la isla, lo que resulta en la disminución de la población de hasta un 90% [3]. La enfermedad se produce ahora en más del 80% del área de distribución geográfica del diablo, y el descenso rápido de la población ha llevado al demonio de Tasmania está catalogado como en peligro de extinción por la legislación internacional (Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza [4]), así como las autoridades nacionales y estatales [ ,,,0],5].
cáncer facial del demonio se transmite entre individuos por morder durante las interacciones sociales [6] y se manifiesta en los tumores malignos brutos alrededor de la cavidad oral, con metástasis frecuentes a otros órganos [7], [8]. Debido al hambre, infecciones secundarias y fallos orgánicos, demonios suelen sucumbir a la enfermedad dentro de los 6 meses de aparición del tumor [1], [7]. análisis citogenéticos han revelado que DFTD es causado por una línea celular clonal rogue [9], que es probable derivadas de células del linaje de la cresta neural (células de Schwann) [8], [10]. Aunque cáncer facial del demonio posee un genoma altamente reorganizado, y se caracteriza por el tumor translocaciones complejas y reordenamientos cromosómicos específicos, la línea celular es notablemente (cromosómicamente) estable [9]. Sin embargo, recientemente, cuatro, estrechamente relacionados, pero han sido identificados y cariotipos distintas cepas DFT, lo que sugiere que el tumor está en evolución [11], [12]. A pesar de las cuatro cepas distintas DFT, estudios de genética utilizando marcadores microsatélites y genes inmunes han demostrado que el diablo tumor facial células (DFT) son genéticamente idénticos [10], [13], [14], [15].
Desde su aparición en 1996 [9] DFT células han sido objeto de división continua y propagación en miles de demonios sin agotar su capacidad de replicación y poner en peligro su estabilidad genómica. En contraste, las células somáticas humanas normales muestran una capacidad finita para la replicación, conocido como el "límite de Hayflick" [16]. Es decir, después de un número determinado de divisiones, las células extinguiría su potencial de replicación debido al acortamiento de los telómeros y entrar en un estado conocido como senescencia replicativa. En las enfermedades hiperproliferativas, tales como la génesis de tumores, cuando telómero desgaste alcanza un nivel crítico, las células entran en una etapa de crecimiento de detención conocido como "crisis" [17], [18], [19]. Por arriba-regulación o la reactivación de la enzima transferasa terminal de los telómeros (telomerasa), las células cancerosas son capaces de salir de la situación de "crisis" y mantener los telómeros que son ligeramente más largos que los observados durante la "crisis" [17], [20].
los telómeros son complejos de ribonucleoproteínas en los extremos de los cromosomas eucarióticos esenciales en la regulación de la vida celular [18]. Sus funciones principales son para asegurar la segregación cromosómica correcta durante la mitosis, y para prevenir la fusión cromosómica y la detención del ciclo celular concomitante, causada por el extremo de los cromosomas siendo tratados como ADN de doble filamento se rompe [21]. En los vertebrados, incluidos los demonios de Tasmania, los telómeros se componen de un número variable de repeticiones en tándem (nucleótidos TTAGGG) unidos por un complejo multiproteicos especializada conocida como shelterina [22], [23]. Telomere longitud homeostasis en las células de la línea germinal y tumorales se logra a través del bucle de realimentación negativa del complejo shelterin y la enzima transferasa terminal telómero [24]. La telomerasa se activa en pluripotentes embrionarias y células madre adultas, para detener el telómero desgaste progresivo a través de la adición de TTAGGG repite a hebra 3 'de los cromosomas [24]. La mayoría de las líneas celulares de tumores humanos tienen ajustes de los telómeros estables, que se consiguen mediante la regulación negativa de la telomerasa por el complejo shelterina [25]. El complejo shelterina consta de tres subunidades shelterin:
TRF1, TRF2
y
POT1
, que están interconectadas por tres proteínas adicionales
TPP1, RAP1
y
TINF2
.
TINF2 gratis (
TRF1
-interacting factor nuclear 2, o también llamado
TRF1
proteína nuclear -Interacting 2 (
TIN2
)) ocupa una posición central en el complejo de proteínas, proporcionando un puente entre los subcomponentes de shelterin (para revisión ver [26]). Se ha demostrado que la baja expresión de
TINF2
tiene un efecto desestabilizador en shelterina [27], [28]. Debido al papel central y crítico de
TINF2 de búsqueda: '(
TIN2
) en la estabilidad shelterina elegimos para medir la expresión de este gen, como un proxy de la actividad shelterina.
la acumulación de shelterin a lo largo de la matriz de repetición telomérica previene la telomerasa inducida por alargamiento de los telómeros [23]. estudios de cáncer en humanos han demostrado que la articulación de la regulación de la expresión de la telomerasa y los genes del complejo shelterin pueden facilitar en la estabilización de las células de cáncer mediante la prevención de la activación de las respuestas de daño en el DNA, tales como apoptosis [27]. En aproximadamente el 85% de los cánceres humanos, la actividad telomerasa se ha demostrado que facilita la transformación maligna mediante el mantenimiento de potencial de replicación [29], [30]. En el 10-15% restante de los cánceres, la prevención de la pérdida de los telómeros se consigue en ausencia de actividad de la telomerasa, a través de un mecanismo de recombinación mediada por cambio de molde conocida como el alargamiento de los telómeros alternativa (ALT) [31]. En consecuencia, las células tumorales son capaces de escapar de la apoptosis y por lo tanto mantener la capacidad de replicación infinita.
La línea celular de cáncer facial del demonio ha estado dividiendo y adaptarse al microambiente de cada host diferente por más de 15 años continuos. Por lo tanto esta enfermedad transmitida por clonación ofrece una oportunidad sin precedentes para estudiar la evolución de las células cancerosas y la progresión
in vivo
. Un mayor conocimiento de la homeostasis del telómero en este tipo de cáncer transmisible puede proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo las células DFT lograr y mantener su potencial hiperproliferativa y nos puede ayudar a entender los orígenes, evolución somática y extraordinario éxito de este linaje clonal parasitaria. Por otra parte, tanto
de TERT
y
TINF2
se han sugerido como posibles dianas terapéuticas en el cáncer humano [32], [33] y el aumento de nuestra comprensión de la función de estos genes en la enfermedad facial del tumor del diablo puede abrir nuevas vías para el tratamiento de la enfermedad.
en el presente estudio nos hemos centrado en el papel de la longitud de los telómeros, cuantificada como telómeros número de copias (de ahora en adelante TCN) en la hiperproliferación de las muestras DFT. Como sustitutos de la actividad de la telomerasa en muestras de tejido tumoral se determinó la expresión de la subunidad catalítica de la telomerasa (
de TERT) y uno de los principales componentes de shelterina, el
TRF1
-intercating factor nuclear 2 (
TINF2
). Además, los cambios temporales en la actividad de la telomerasa se cuantificaron en cinco líneas celulares DFT.
Resultados
(a) la longitud de los telómeros de fragmentos de restricción
analiza
fragmento de restricción de los telómeros (TRF) de longitud fue analizado en ambos tumores primarios y metastastatic, así como muestras de bazo de cuatro demonios de Tasmania (un total de 12 muestras). No se pudo asignar la longitud del telómero en todas las 12 muestras como la digestión de restricción producido varios repetidos TRF-frotis, en varias longitudes (entre & lt; 2 kbps hasta & lt; 18 kbps). (Figura 1)
nombres de las muestras representan el momento de la recolección (10 = 2010). números idénticos representan diferentes muestras de tejido recogidas del mismo animal, S representa el bazo y T representa muestras DFT. MWM significa marcadores de peso molecular. CTRL 1 indica ADN bajo control del peso molecular (longitud: 3,2 kpb), CTRL 2 indica el control de ADN de alto peso molecular (longitud: 10,2 kpb). Las muestras de control fueron suministrados en el Kit de Ensayo Telo TAGGG TL y se originó a partir de líneas celulares inmortales.
(b) el número de los telómeros relativa de repetición de copia
En total 65 muestras de tejido recogidas de 17 localidades a través de Tasmania (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, Mt William, Narawntapu, Railton, Ravenswood, reedy, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale y Occidente pino del lápiz, la Figura 2), se incluyeron en el análisis relativo número de copias de los telómeros de repetición. Bazo, pulmón y muestras tumorales mostraron una variación significativa TCN (Kruskal Wallis prueba: T = 17,1, p = 0,0007, DF = 3); con tumores (tanto primarios y metastásicos) que muestra la más baja (media = 3,21 ± 3,28) y el bazo el más alto (media = 12,52 ± 4,62), mientras que las muestras pulmonares mostraron TCN intermedio (media = 8,03 ± 2,04, Figura 3). Un post hoc prueba Conover-Inman (disponible en StatsDirect) no reveló diferencias significativas en TCN entre pulmón y el bazo (P = 0,52), entre los pulmones y la metástasis (P = 0,08), entre los tumores primarios y metástasis (P = 0,52). La misma prueba, sin embargo, reveló una diferencia significativa en la TCN entre los tumores de pulmón y primaria (P = 0,006), entre el bazo y el tumor (p = 0,0001), y entre el bazo y la metástasis (P = 0,01).
la progresión del tumor en el año 2003 representa con trazos, para el año 2005, con puntos y rayas discontinuas y en 2007 con líneas de puntos. Las fechas indican las fechas de progresión del cáncer facial del demonio. abreviaturas Ubicación: Bo = Bothwell, Br = Bronte Park, Bu = Buckland, Fen = Fentonbury, Para = Forestier, Fre = Freycinet, jamón = Hamilton, MTW = Mt William, Na = Narawntapu, Ra = Railton, el Rav = Ravenswood, Re = reedy, S = Sorell, StM = St. Marys, We = Weegena, Wi = Wisedale, WPP = West pino del lápiz.
Las barras de error representan las desviaciones estándar. nombres de las muestras indican el momento de la recolección (06 = 2006 = 07 2007 = 10 2010). números idénticos representan diferentes muestras de tejido recogidas del mismo animal. Número de muestras utilizadas en el análisis: los tumores primarios recogidos en 2006: N = 30, 2007: N = 13 y 2010: N = 8; Metástasis: N = 4, el bazo: N = 5, pulmón: N = 5.
(c) Temporal (longitudinal) y la variación geográfica en la cepa TCN
Una de Kruskal-Wallis prueba reveló una variación significativa temporal en la TCN de las muestras recogidas en 2006, 2007 y 2010 (t = 7,66, p = 0,02; gl = 2) y un post-hoc y una prueba de Conover-Inman reveló diferencias significativas en la TCN entre los años 2006 y 2007 ( P = 0,03) y 2006 y 2010 (p = 0,01), pero no se observó diferencia significativa en la TCN entre los años 2007 y 2010 (p = 0,6). Así pues, la prueba post hoc sugiere un aumento temporal en la TCN (Figura 4).
Las barras de error representan las desviaciones estándar. No se observaron diferencias significativas en el número de copias de los telómeros (TCN) entre los años 2006 y 2007 (p = 0,03) y 2006 y 2010 (P = 0,01), pero no se observó ninguna diferencia significativa en la TCN entre los años 2007 y 2010 (p = 0,6). * Indica diferencias significativas
No obstante, observó ninguna diferencia significativa en la TCN entre las tres regiones geográficas (Este, Centro, Norte-Oeste) (prueba de Kruskal Wallis:. T = 1,75, p = 0,42; gl = 2), ni entre las cuatro cepas diferentes (Kruskal Wallis ensayo:. T = 2,1; p = 0,56; gl = 3)
(d) de TERT y TINF2 expresión
diablo
de TERT
y
TINF2
expresión fue significativamente hasta reguladas en los tumores primarios en comparación con el bazo por un factor promedio de 14.63 P & lt; 0,0001 (Std. Error (sE) que oscila entre 4,5 y 37,8) y 37,86 P & lt; 0,0001 (SE que oscila entre 4,6 a 272,9), respectivamente (Figura 5).
de TERT
y
TINF2
expresión mostraron una variación sustancial entre las muestras tumorales. Nosotros no hicimos, sin embargo, se observó ninguna asociación significativa entre el TCN y
de TERT
o
TINF2
expresión en las muestras tumorales (correlación de Spearman, R = -0,31; p = 0,36, N = 11 ; R = -0,05, P = 0,88, N = 11, respectivamente)
Número de muestras utilizadas en el análisis:. tumores N = 11 y N = bazo 5. líneas horizontales punteadas representan la expresión génica relativa media, diagramas de caja indican el rango de error estándar y barras representan los intervalos de confianza del 95%.
En los tumores, el nivel de expresión de
TINF2
fue significativamente inferior a la de
terc
(dos caras de Mann-Whitney U-test; T = 27, p = 0,03, mediana
TINF2
= 0,51, mediana
de TERT
= 3,58). A pesar de la diferencia en el nivel de expresión se observó una asociación significativa entre el
de TERT
y
TINF2 gratis (correlación de Spearman R = 0.83, P = 0,0017, N = 11). También se detectó una variación temporal significativa en
de TERT
y
TINF2
niveles de expresión tanto como
de TERT
y
TINF2
indicaron un aumento en los niveles de expresión significativamente en 2010 en comparación a 2007 (Dos caras de Mann-Whitney U-test, T = 28, P = 0,0173 y T = 28,5, p = 0,013, respectivamente;
de TERT
mediana de 4,77 y 2,44, respectivamente;
TINF2
mediana de 2,84 y 0,47, respectivamente, Figura 6).
Las barras abiertas representan la expresión de TERT, barras negras representan la expresión TINF2. Número de muestras utilizadas en el análisis: los tumores recogidos en 2007: N = 5 y 2010: N = 6. * representa diferencias significativas (P = 0,0173 y P = 0,013, respectivamente) guía empresas
(e. ) se detectó actividad de la telomerasa ensayo
actividad de la telomerasa en cinco de las muestras de líneas celulares DFT. Por otra parte, se observó un cambio temporal positiva en la actividad de la telomerasa (producto total generado) 2003-2011 (rango de Spearman de correlación, r = -0,9; p = 0,037, n = 5, Figura 7).
Los cinco líneas de células tumorales se originaron a partir de muestras recogidas en 2003, 2006, 2007, 2010 y 2011. Las barras representan errores estándar entre técnicos repeticiones (N = 3).
Discusión
Al igual que muchos humanos tipos de cáncer [34], [35], Devil tumores faciales tienen telómeros más cortos.
expresión de TERT
gen está regulado de 15 veces en células DFT en comparación con las células del bazo, y la actividad de la telomerasa está presente en líneas celulares de DFT. Esta actividad de la telomerasa evita que las células DFT de entrar en senescencia replicativa, y llevado junto con la falta de ADN telomérico extracromosómico (pers Pearse. Com) en cariotipos DFT, apunta hacia la telomerasa regulación, no alargamiento alternativo de los telómeros (ALT), como el principal mecanismo para la inmortalidad DFT [31].
alta expresión de
TINF2
, un regulador negativo de la actividad telomerasa [23], en las células DFT sugiere que el alargamiento de los telómeros está muy regulada en este tipo de cáncer. DFT células parecen vigilar y regular la longitud de los telómeros más cortos individuales es decir, los telómeros se alargan por la actividad de la telomerasa; telómeros más largos están protegidos de la elongación adicional por el complejo shelterina [27].
El aumento de
de TERT
y
TINF2
expresión más probable explicar la falta de variación espacial de la DFT TCN. Además, TCN no difiere entre las cepas de cáncer facial del demonio. Sin embargo, el aumento temporal en
de TERT
y
TINF2
expresión génica y la actividad de la enzima pueden estar unidos con ventaja de crecimiento y el aumento de la progresión tumoral en DFT, como lo es en los cánceres humanos [34], [ ,,,0],36], [37].
Los cortos los telómeros y la regulación de la telomerasa probable que se contrarrestan entre sí. Los telómeros cortos conducen a una mayor inestabilidad genética, pero la activación de la telomerasa facilita el crecimiento del tumor por cualquiera de las inestabilidades cromosómicas que inhiben o más por eludir los puestos de control que reconocen los telómeros disfuncionales [37]. Ya telómero longitudes pueden garantizar el éxito y la supervivencia de las células DFT mediante la estabilización de reordenamientos cromosómicos y la prevención de nuevas inestabilidades genómicas.
Muestras
DFT mostraron consistentemente más bajos TCN en comparación con otros tejidos, pero una considerable (16 veces) entre las muestras se observó variación de TCN. desafíos metodológicos, muy probablemente causado por la interrupción de las repeticiones teloméricas con sitios de restricción (una característica común de los cromosomas marsupiales) [38], nos impidieron la correlación de la variación en el número de copias a la variación en la longitud del telómero.
de TERT
y
TINF2
los niveles de ARN no se asoció con TCN, un hallazgo también observado en otras líneas celulares de cáncer humano [39].
Las investigaciones futuras deberían investigar el impacto de variación de la longitud de los telómeros en la aptitud del tumor. ¿Existe una óptima evolución alrededor de la longitud de los telómeros? Qué fuerzas selectivas mantener la longitud del telómero de equilibrio o seleccionar las células tumorales con telómeros más largos? Será aumentado
de TERT,
TINF2
la expresión génica, la actividad de la telomerasa y los telómeros más largos conducen al desarrollo de una forma más estable DFT con mayor crecimiento y potencial proliferativo?
Desde su hace 15 años la primera aparición, cáncer facial del demonio se ha pasado a través de miles de demonios, matando a cerca del 80% de los animales, sin someterse a la senescencia replicativa. por lo tanto cáncer facial del demonio representa uno de los más antiguos de forma natural vivo, y las líneas celulares sometidas a pases de forma continua en la naturaleza. Hemos demostrado que la interacción dinámica entre el complejo de la telomerasa y shelterin es esencial para el éxito de este tipo de cáncer parasitaria, transmisible. Selección ha promovido la progresión de las células DFT con el aumento del número de copia de los telómeros, así como el aumento de la expresión de genes y la actividad de la telomerasa, tanto de que en última instancia pueden dar lugar a un tumor de crecimiento más rápido. Cáncer facial del demonio proporciona un poderoso sistema modelo para entender la génesis tumoral no sólo en la vida silvestre, sino también en los cánceres humanos. Otros estudios se centran en la comprensión del mecanismo exacto de mantenimiento de los telómeros y la regulación en las células DFT conducirán a una mejor comprensión de las estrategias y mecanismos evolutivos subyacentes y mantener el potencial de proliferación ilimitada de las células cancerosas.
Materiales y Métodos
(a) Las muestras
Las muestras de tejido se obtuvieron de 17 localizaciones a través de Tasmania (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, MT William, Narawntapu, Railton, Ravenswood, reedy, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale y Occidente pino del lápiz, Figura 1) por los miembros del Departamento de Industrias primarias, parques, agua y Medio Ambiente (DPIPWE) de cáncer facial del demonio eutanasia afectados demonios y se almacenan a los Laboratorios de Salud Animal (DPIPWE) . La investigación se llevó a cabo con la aprobación de la DPIPWE (Departamento de Industrias Primarias, parques, agua y medio ambiente, Tasmania) animales ética comitte, Ética Animal No: 101 2010/11. Se obtuvieron muestras de tejido de 48 demonios. Tuvimos acceso a bazo y el tumor primario, así como muestras de metástasis de los cuatro demonios. 51 tumores primarios, metástasis cinco, cuatro y cinco de pulmón muestras de ADN de bazo se utilizaron en los análisis (Figura 2).
Con el fin de investigar la variación geográfica /espacial en el número de copias de los telómeros, las muestras se dividieron en tres geográfica regiones (Este = distribución antes de 2003, Centro de distribución = 2003-2005 y el Norte-Oeste = distribución entre 2005-2007) basado en la progresión temporal /espacial de cáncer facial del demonio a través de Tasmania [40]. Hemos tenido información sobre las cepas específicas de 45 muestras tumorales y utilizamos estas muestras para investigar la variación del número de copias de los telómeros entre las cepas DFT.
La variación temporal en las tasas de desgaste de los telómeros se basó en el número de copias observadas en las muestras recogidas en 2006, 2007 , y 2010 (N = 51). Debido a los procedimientos de toma de muestras sólo se pudieron extraer ARN de cinco bazo y 11 (5 de 2007 y el 6 de 2010) muestras de tumores primarios que fueron analizados posteriormente con el Cuantitativo PCR en tiempo real.
La actividad de la telomerasa Los ensayos se realizaron en cinco muestras de líneas celulares lisadas DFT obtenidos de DPIPWE. líneas celulares de tumores se generan y se mantienen en DPIPWE de acuerdo con las descripciones de Pearse et al 2012 [11]. Las cinco líneas de células tumorales se originaron a partir de muestras recogidas en 2003, 2006, 2007, 2010 y 2011.
(b) la extracción de ADN de los telómeros, las mediciones de longitud de fragmentos de los telómeros y la copia número cuantificación
El ADN genómico se aislado de muestras de tejido mediante extracción con fenol-cloroformo. cantidad y calidad del ADN de la muestra se midió usando un espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).
(c) análisis de los telómeros Fragmentos de Restricción (TRFL)
fragmento de restricción de los telómeros (TRF) de longitud se cuantificó mediante hibridación de transferencia de Southern siguiendo el protocolo descrito en el Telo TAGGG TL Assay Kit (Roche, Indianapolis, IN), el uso de electroforesis de campo constante. Después de digerir el ADN genómico con una mezcla de
Hinf
I y
Rsa I
enzimas de restricción para eliminar la secuencia de ADN-diversa desde el lado centromérica de los telómeros, longitud de los telómeros se analizó en geles de agarosa, que se corrieron durante 4 horas a 5 V /cm. Los fragmentos de LFR se marcaron con una sonda marcada digoxigen, y las imágenes de LFR se desarrollaron posteriormente en una película de alto rendimiento de quimioluminiscencia (Amersham Bioscience, Waukesha, WI).
(d) PCR cuantitativa del número de copias de los telómeros relativa
número de copia repetida de los telómeros relativa se analizó mediante PCR cuantitativa (Q-PCR) como se describe por Cawthon [41]. cebadores específicos de los telómeros fueron adoptados de Cawthon [41], Tel1: 5'-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT -3 '; Tel2, 5'-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA -3 '.
RPLP0 gratis (también llamado
36B4
) gen fue elegido como gen de copia única siguiendo la metodología de Cawthon [41], y la presencia única copia de este gen en el genoma del demonio de Tasmania [42] fue confirmada mediante la búsqueda en el genoma para copias alternativas del gen. No se encontraron otra alternativa
RPLP0
copias o pseudogenes.
RPLP0
cebadores específicos del gen se diseñaron basándose en la secuencia del genoma Demonio de Tasmania [42], utilizando el sitio web Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi),
RPLP0_F
: 5'-CTTCCCGTTCACCAAAGAAG -3 'y
RPLP0_R
: 5'-TGTTCTGGACTGGCAAAGTG -3'. Las reacciones Q-PCR se realizaron en el RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) en 15 l volumen total, que contiene 7,5 l de Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 M adelante y atrás primers (la primer concentraciones óptimas) y 1 l de ADNg (1 ng /l de concentración). condiciones de Q-PCR se establecieron de acuerdo con el protocolo del fabricante: 95 ° C para la desnaturalización 5 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 30 s (temperatura de hibridación). La señal de fluorescencia fue adquirida a la temperatura de recocido. Las curvas de calibración se generaron utilizando serie 01:05 (
RPLP0
) y 1:10 (telómeros) diluciones de una muestra compuesta que contiene partes iguales de ADN a partir de extractos de bazo y tejido tumoral. Todas las diluciones se realizaron por triplicado. Las curvas de calibración tenían un R
2 & gt; 0,985 (
RPLP0
reacción: R
2 = 0,985 y los telómeros de reacción R
2 = 0,997) y contenía al menos cuatro (reacción de los telómeros) o cinco (
RPLP0
reacción) diluciones de la serie de dilución con un rango dinámico lineal de al menos 3 órdenes de magnitud y la eficiencia de la PCR tenían entre 1,3 y 1,1 (respectivamente). Todas las muestras se realizaron por cuadruplicado, y todos los valores de CQ por desconocidos cayeron dentro del rango cuantificable lineal de las curvas de calibración apropiadas. El programa Rest [43] se utilizó para calcular el factor de cambio normalizado del gen diana en comparación con el gen de referencia. Este paquete de programas también corrige las diferentes eficacias de reacción. La significación estadística (P & lt; 0,05).. se determinó por un par Wise fijo Reasignación Aleatorización Test © como se describe por Pfaffl
et al
[43]
expresión de la telomerasa (e) la extracción del ARN y cuantificación de por RNA RT-PCR cuantitativa
fue extraído de muestras de tejido utilizando una combinación de Trizol (Sigma, St. Louis, MO) y Qiagen RNeasy mini kit (Qiagen, Germantown, MD). calidad y la cantidad de ARN se cuantificaron en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). El ADN genómico se eliminó de las muestras de ARN por el kit de DNAsa I AMPD1 (Sigma, St. Louis, MO) y se sintetizó ADNc con el QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Germantown, MD). cebadores específicos del gen de la telomerasa que atraviesan las fronteras exón fueron diseñados en la subunidad catalítica de la proteína diablo
de TERT
gen, utilizar el sitio Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)
de TERT
-F: 5'-TGCTGTAGTCCAGAAGAATGC -3 ', y
de TERT
-R: 5'-TGCAGGGAAGAGGTTTCTTG -3'.
TRF1
-interacting factor nuclear 2 (
TINF2
) cebadores fueron diseñados a través de los exones 6 y 7
TINF2
-F: 5'-TTGCCCTGACTCAGTATTGC -3 ', y
TINF2
-R: 5'-GGATCCTGGAAAACTTGCTC -3 '. Dos genes,
GAPDH gratis (
qGAPDH
) y
GUSB gratis (
qGUSB
) fueron utilizados como genes Normaliser siguiendo la descripción de Murchison y col. [ ,,,0],10], [14]:
qGAPDHf
: 5'-GACTCAACCACGTATTCGGCTC -3'and
qGAPDHr
: 5'-ATATGATTCCACCCATGGCAAGTTCAA -3 ';
qGUSBf
: 5'-CTGCTGCCTATTATTTCAAGAC -3'and
qGUSBr
: 5'-CAAGATCCAATTCAGGCTTAG -3 '. Las reacciones Q-PCR se realizaron en el RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) en 15 l volumen total, que contiene 7,5 l de Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 M adelante y atrás primers (la primer concentraciones óptimas) y 1 l de cDNA (5 ng /l de concentración). negativos y cDNA muestras negativas transcriptasa inversa se realizaron junto con las muestras de ADNc como controles para detectar la contaminación de ADN genómico y formaciones de cebador-dímero. condiciones de Q-PCR se establecieron de acuerdo con el protocolo del fabricante: 95 ° C para la desnaturalización 5 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 30 s (temperatura de recocido, AT). La señal de fluorescencia fue adquirida en el AT. Para evaluar la amplificación específica de un análisis de la curva de fusión final (de AT hasta 99 ° C) se añadió bajo medidas de fluorescencia continuas. Las curvas de calibración se generaron utilizando 1:5 serie de diluciones de una muestra compuesta que contiene partes iguales de muestras de cDNA generados a partir de extractos de bazo y tejido tumoral de ARN. Todas las diluciones se realizaron por triplicado. Las curvas de calibración tenían un R
2 & gt; 0,99 (
GUSB
reacción: R
2 = 0,998,
de TERT
reacción: R
2 = 0,990 y
TINF2
reacción: R
2 = 0,993) y contenía al menos cuatro (
de TERT
reacción) o cinco (
GUSB Opiniones y
TINF2
reacciones) de diluciones la serie de dilución con un rango dinámico lineal de al menos 3 órdenes de magnitud y la eficiencia de la PCR tenía entre 0,98 y 1,4 (
GUSB
: 1.1,
de TERT
: 1,4 y
TINF2
: 0,98). Todas las muestras se realizaron por cuadruplicado, y todos los valores de CQ por desconocidos cayeron dentro del rango cuantificable lineal de las curvas de calibración apropiadas. El programa Rest [43] se utilizó para calcular el factor de cambio normalizado del gen diana en comparación con el gen de referencia. Este paquete de programas también corrige para las diferentes eficacias de reacción. La significación estadística (P & lt; 0,05) se determinó por un par Wise fijo Reasignación La asignación al azar Test © como se describe por Pfaffl
et al
[43]
(f) ensayo de telomerasa
telomerasa se midió usando el kit de detección de telomerasa TRAPEZE-RT (Millipore, Bedford, MA). Las células se lisaron en 200 l de tampón CHAPS, y el contenido de proteína se cuantificó usando el Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Partes alícuotas de lisado celular (250 ng de proteína /pocillo) se ensayaron por triplicado. Normas, muestras inactivadas, y las reacciones no plantilla también se incluyeron en el ensayo como controles de calidad. amplificaciones en tiempo real se realizaron con un multicolor en tiempo real sistema de detección de PCR RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD). curva estándar se genera a partir de plantilla de control TSR8 siguiendo las instrucciones del fabricante.