Extracto
ABCG2 humano, un miembro de la superfamilia de unión a ATP casete transportador, juega un papel clave en la resistencia a múltiples fármacos y la protección de las células madre del cáncer . ABCG2-knockout no tuvo ningún efecto adverso aparente sobre el desarrollo, la bioquímica y la vida de los ratones. Por lo tanto, ABCG2 es un objetivo interesante y prometedora para el desarrollo de agentes quimio-sensibilizar para un mejor tratamiento de los cánceres resistentes a los medicamentos y para la eliminación de las células madre del cáncer. Anteriormente, se informó de un nuevo inhibidor de dos modos de acción ABCG2, PZ-39, que induce la degradación ABCG2 además de inhibir su actividad. En este manuscrito, nos informan de nuestros recientes progresos en la identificación de dos grupos diferentes de inhibidores de ABCG2 con una inhibición de la única función ABCG2 (estática) y el otro induce la degradación ABCG2 en lisosoma además de inhibir su función (dinámica). Por lo tanto, la degradación inducida por inhibidores de ABCG2 puede ser más común de lo que se había previsto anteriormente y de la investigación de los inhibidores de la dinámica que inducen la degradación ABCG2 puede proporcionar una forma más eficaz de sensibilización de la MDR mediada ABCG2 en la quimioterapia del cáncer.
Visto : Peng H, J Qi, Dong Z, Zhang JT (2010) dinámica
vs
estático ABCG2 Inhibidores de sensibilizar a las células de cáncer resistentes a los medicamentos. PLoS ONE 5 (12): e15276. doi: 10.1371 /journal.pone.0015276
Editor: Wenqing Xu, de la Universidad de Washington, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Septiembre, 2010; Aceptó 3 de noviembre de 2010; Publicado: December 7, 2010
Derechos de Autor © 2010 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA113384 y CA120221 (JTZ) y por una beca de la Fundación Showalter (ZD). Jing Qi es un destinatario del Departamento de Defensa de Cáncer de Mama Programa de Investigación postdoctoral. Hui Peng está apoyado, en parte, por NNSF de China de la subvención No. 30873083. Los donantes no participó en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ABCG2 es un miembro de la casete de unión a ATP (ABC) transportador superfamilia y la sobre-expresión de ABCG2 se ha demostrado que causa. resistencia a múltiples fármacos (MDR) en líneas celulares de cáncer de modelo y que se correlaciona con mal pronóstico, tanto en pacientes adultos con cáncer y leucemia infantil y de mama (para una revisión ver [1], [2], [3]). A diferencia de la mayoría de los otros miembros de la superfamilia de transportadores ABC, tales como P-glicoproteína (MDR1 /ABCB1), ABCG2 se considera como un medio transportador que consta de un dominio de unión a nucleótidos (NBD) en amino terminal y un dominio que atraviesa la membrana (MSD) a carboxilo terminal. Tiene, por lo tanto, ha pensado que existir y funcionar como un homo-dímero. Sin embargo, la evidencia reciente mostró que ABCG2 puede existir y funcionar como un orden superior de oligómero que consiste en 8-12 subunidades idénticas [4], [5] y los sitios de oligomerización es probable encuentran en el MSD [6].
en el proceso de apuntar para sensibilizar MDR mediada por ABCG2, un número de inhibidores de ABCG2 se han descubierto recientemente [7], [8], [9], [10], [11], [12] además de la anteriormente las identificadas como Fumitremorgina C (FTC) (para una revisión ver [2]). Uno de estos inhibidores ABCG2, PZ-39, fue muy eficaz y distintivo de otros, tales como FTC con la capacidad de causar la degradación de lisosoma dependiente de la proteína ABCG2 [7].
A fin de determinar si inducida por inhibidores de ABCG2 la degradación es única para PZ-39, hemos probado otros inhibidores de la ABCG2 generados durante nuestra selección inicial que dio lugar a la identificación de PZ-39. Se encontraron dos tipos de inhibidores de ABCG2 con una inhibición de la actividad ABCG2 solamente (estática) y la otra actividad ABCG2 inhibiendo así como la inducción de la degradación a través de ABCG2 lisosoma (dinámico). Estos hallazgos sugieren que la inducida por inhibidores de la degradación ABCG2 en lisosoma puede ser más común de lo que previamente se ha anticipado e investigar aún más los inhibidores dinámicas que inducen la degradación ABCG2 en lisosoma puede proporcionar una manera más eficaz de sensibilizar ABCG2 mediada por MDR en la quimioterapia del cáncer.
resultados
Hay dos tipos de inhibidores de ABCG2
Anteriormente, se informó de que la proyección racional de los representantes de los diferentes tipos de bibliotecas de compuestos de Especificaciones (www.specs.net) condujo a la identificación de un inhibidor de ABCG2 actuar de dos modos PZ-39 [7]. Durante el cribado inicial, varios otros inhibidores ABCG2, que son estructuralmente diferentes de PZ-39 y sus derivados (Fig. 1), también se identificaron y su actividad para inhibir el eflujo de fármaco ABCG2 mediada ha sido confirmado utilizando células HEK293 con sobreexpresión de ABCG2 ectópico (HEK293 /ABCG2) (Fig. 2A). Para determinar si estos inhibidores también poseen la propiedad de actuar de dos modos, primero a prueba el efecto de estos inhibidores en ABCG2 expresión mediante el análisis de Western blot. Como se muestra en la Fig. 2B, tres de los cuatro nuevos inhibidores (PZ-8, 34, y 38) junto con PZ-39 expresión ABCG2 inhibición mientras PZ-16 no lo hace. Junto con nuestra anterior conclusión de que la FTC inhibe la única actividad ABCG2 [7], llegamos a la conclusión de que es probable que existan dos tipos de inhibidores que inhiben ABCG2 con una única actividad ABCG2 mientras que el otro inhibiendo la actividad y expresión de ABCG2.
las estructuras químicas se muestran para PZ-8, (12E)-N'-((5-(3,4-dihydro-4-oxo-3-phenylquinazolin-2-ylthio)furan-2-yl)methylene)-2-(4-ethylphenoxy)acetohydrazide; PZ-16, 2- (4- (4-nitrofenoxi) fenil) -2-oxoethyl2- (2- (4- cloro benzamido) acetamido) acetato de etilo; PZ-34, (E) -2- (4-etoxifenil) -N '- (1- (4- (furan-2-carboxamido) fenil) etilideno) quinolina-4-carbohidrazida; PZ-38, (N-(2,5-dimethoxyphenyl)-2-({4-[4-(dimethylamino)benzylidene]-5-oxo-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl}sulfanyl)acetamide); y PZ-39 (N- (4-clorofenil) -2 - [(6 - {[4,6-di (4- morfolinil) -1,3,5- triazin-2-il] amino} -1,3 benzotiazol-2-il) sulfanil] acetamida).
A, la acumulación de mitoxantrona. células /ABCG2 HEK293 fueron incubadas con mitoxantrona durante 30 min en presencia de DMSO (línea fina) o 10 mM compuestos PZ (línea gruesa), seguido por el análisis FACS de nivel de mitoxantrona. B, ABCG2 expresión. células HEK293 /ABCG2 se incubaron con compuestos PZ 3,3 micras o control de DMSO por varias veces seguido por la recolección de las células y análisis de transferencia de Western de ABCG2 se sondaron con anticuerpo monoclonal BXP-21.
supresión de la expresión ABCG2 por las conocidas y existentes inhibidores ABCG2
los resultados anteriores sugieren que la supresión inducida por los inhibidores de la expresión ABCG2 puede ser más común de lo previsto. A fin de probar esta posibilidad, se investigó el efecto de otros dos inhibidores publicados ABCG2 (NSC-168201 y NSC-120668) [12] sobre la expresión ABCG2 utilizando análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 3A, la NSC-168201 y NSC-120668 suprimen efectivamente ABCG2 expresión. Sin embargo, el inhibidor de control ABCG2 FTC no a pesar de los tres inhibidores de mejorar de manera efectiva la acumulación de mitoxantrona en las líneas celulares HEK293 /ABCG2 (Fig. 3B). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la supresión inducida por los inhibidores de la expresión ABCG2 puede ser más común de lo que se ha previsto, y no son, posiblemente, dos grupos de inhibidores ABCG2.
A, ABCG2 expresión. células HEK293 /ABCG2 se trataron con 10 mM de cada uno de los inhibidores conocidos ABCG2 NSC-168201, NSC-120668, o FTC para varias veces seguido de análisis de transferencia de Western de la expresión ABCG2 se sondaron con anticuerpo monoclonal BXP-21. B, la acumulación de mitoxantrona. Las células HEK293 /ABCG2 se incubaron con mitoxantrona durante 30 minutos en presencia de DMSO (línea fina) o 10 mM NSC-168201, NSC-120668, o FTC (línea gruesa) seguido de un análisis FACS de nivel mitoxantrona intracelular.
efecto específico de PZ-34 y PZ-38 en ABCG2 mediada por flujo de salida de mitoxantrona
para investigar más a fondo si estos nuevos inhibidores de suprimir la expresión ABCG2 mediante la inducción de la degradación ABCG2 en lisosoma, se optó por centrarse en PZ -34 y PZ-38 y la primera realizó un análisis detallado de sus efectos sobre la acumulación del fármaco. Como se muestra en la Fig. 4A, ambas PZ-34 y PZ-38 a ~ 4 M aumentar la acumulación de mitoxantrona en un grado similar como el inhibidor ABCG2 bien establecida FTC en células /ABCG2 HEK293. Estos compuestos, sin embargo, no tienen ningún efecto significativo sobre la acumulación de mitoxantrona en las células transfectadas de control con vector (HEK293 /Vec), lo que indica que el efecto de PZ-34 y PZ-38 sobre la acumulación de mitoxantrona es probablemente a través de la inhibición de ABCG2. A continuación, prueba la respuesta de dosis de PZ-34 y PZ-38 en la inhibición de ABCG2 mediada por flujo de salida de mitoxantrona en las células /ABCG2 HEK293 usando citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 4B, el nivel de mitoxantrona intracelular es mucho menor en HEK293 /células ABCG2 comparación con las células HEK293 /Vec debido a flujo de salida de ABCG2 mediada. La adición de PZ-34 y PZ-38 aumenta la acumulación intracelular de mitoxantrona de una manera dependiente de la dosis similar a la FTC.
A, la acumulación de mitoxantrona. células HEK293 /Vec o HEK293 /ABCG2 se incubaron con mitoxantrona por 30 minutos en la presencia de control de DMSO, o 3 M de PZ-34, PZ-38 o control FTC. Los datos son medias ± SD de tres experimentos independientes. B, respuesta a la dosis de PZ-34, PZ-38, y el control de la FTC en la restauración de la acumulación en las células mitoxantrona /ABCG2 HEK293. La línea gruesa muestra el nivel de acumulación de mitoxantrona en células HEK293 /Vec, sirviendo como un control máximo de acumulación. C, el efecto sobre ABCB1 y mediada por el flujo de salida de ABCC1 adriamicina. células HEK293 con ABCC1 la sobre expresión (HEK293 /ABCC1) y FC19 células con ABCB1 se incubaron sobre-expresión con adriamicina en ausencia (área gris) o en presencia (línea de puntos) de 3,8 M PZ-34 o PZ-38 seguido por FACS análisis. La línea gruesa indica el nivel máximo de acumulación en las células transfectadas con el control de vectores. D, efecto sobre ABCB1 y ABCC1 expresión. HEK293 /ABCC1 y FC19 células con ABCB1 sobre-expresión se trataron con 10 mM PZ-34 o PZ-38 durante 3 días, seguido de análisis de transferencia de Western de ABCB1 utilizando anticuerpo monoclonal C219 y ABCC1 utilizando anticuerpo monoclonal MRPr1. GAPDH se utilizó como control de carga.
Para determinar la especificidad de PZ-34 y PZ-38, hemos probado su efecto sobre el eflujo de fármaco mediada por otros dos transportadores ABC que se sabe que causan MDR, ABCB1 y Abcc1, utilizando células transfectadas con MCF7 ABCB1 (FC19) [13] y células HEK293 transfectadas con ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [14], [15]. Sin embargo, no se encontraron efectos de estos compuestos sobre la actividad de ABCB1 y ABCC1 en la disminución de la acumulación de adriamicina (Fig. 4C). Tanto PZ-34 y PZ-38 tampoco afectan a la expresión de ABCB1 y ABCC1 (Fig. 4D). Por lo tanto, PZ-34 y PZ-38 pueden ser específicas para ABCG2 y no afecten salida del fármaco mediado por otros dos principales transportadores ABC.
Efecto de PZ-34 y PZ-38 en la resistencia a múltiples fármacos ABCG2 mediada
para determinar si ambos PZ-34 y PZ-38 tienen la capacidad de sensibilizar a resistencia a los medicamentos ABCG2 mediada, se realizó un análisis de los efectos de estos compuestos sobre la supervivencia de las células /ABCG2 HEK293 en la ausencia o presencia de mitoxantrona . Como se muestra en la Fig. 5A, tanto PZ-34 y PZ-38 solo tienen ningún efecto sobre la supervivencia de células /ABCG2 HEK293 en concentraciones de menos de 10 mg /ml. Su IC
50 se estima en ~12.9 y & gt; 20 M, respectivamente (Tabla 1). Así, tanto PZ-34 y PZ-38 tienen poca citotoxicidad para las células /ABCG2 HEK293 en concentraciones de menos de 10 micras, lo que sugiere que no pueden actuar sobre otras moléculas esenciales con alta afinidad para la supervivencia celular.
A, potencia de PZ-34 y PZ-38 en la reversión de la resistencia a mitoxantrona. células HEK293 /ABCG2 fueron tratadas sin o con 0,1 M (IC
10) mitoxantrona en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de PZ-34 o PZ-38, seguido por el ensayo de SRB. B, el índice de sensibilización de PZ-34 y PZ-38 en las células HEK293 /ABCG2. células HEK293 /ABCG2 se trataron con varias concentraciones de mitoxantrona en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de PZ-34 o PZ-38, seguido por el ensayo de SRB. C y D, índice de sensibilización de PZ-34 y PZ-38 en las células MCF7 /AdVp3000 seleccionado con las drogas. células MCF7 /AdVp3000 se trataron con varias concentraciones de mitoxantrona (c), o adriamicina (D) en presencia de DMSO (vehículo) o 500 nM de PZ-34 y PZ-38 seguido por el ensayo de MTT. índice de Sensibilización se calculó utilizando IC
50 de los medicamentos contra el cáncer en la ausencia o presencia de PZ-34, PZ-38, o FTC. Los datos mostrados son la media ± SD de tres experimentos independientes.
Se determinó el efecto de la próxima PZ-34 y PZ-38 en la sensibilización de la respuesta celular a 0,1 M mitoxantrona que por sí sola produce menos de inhibición 10% de crecimiento de las células /ABCG2 HEK293. Como se muestra en la Fig. 5A, tanto PZ-34 y PZ-38 a una concentración baja gama sensibilizar a estas células a la mitoxantrona. Aproximadamente a 1,2 M, tanto PZ-34 y PZ-38 ayudan 0,1 M mitoxantrona para inhibir completamente el crecimiento celular. El IC
50 de PZ-34 y PZ-38 en la sensibilización de la resistencia a la mitoxantrona se calculó en 71 y 45 nM, respectivamente (Tabla 1). También probamos PZ-8 y PZ-16 y encontramos que el CI
50 de estos compuestos por sí sola es ~ 20 M y su IC
50 en la sensibilización de la resistencia a la mitoxantrona de las células MCF7 /AdVp3000 somos ~ 80 ~ 70 nM y , respectivamente. El IC
50 de FTC en la sensibilización de la resistencia a mitoxantrona, por otro lado, es mucho más alta en 326 nM (Tabla 1).
A continuación, se examinó la respuesta a la dosis de PZ-34 y PZ-38 en la sensibilización de ABCG2 mediada por la resistencia a mitoxantrona utilizando células /ABCG2 HEK293. Como se muestra en la Fig. 5B, el IC
50 de mitoxantrona disminuye drásticamente en presencia de PZ-34 y PZ-38. A 50 nM, PZ-34 y PZ-38 reducen significativamente el IC
50 de mitoxantrona con un índice de sensibilización de 1,6 y 2,2, respectivamente (Tabla 2). A 500 nM, el índice de sensibilización de PZ-34 y PZ-38 son 8,7 y 14,3, respectivamente (Tabla 2). Por otro lado, el índice de sensibilización de FTC a 500 nm es solamente 3.9 (Tabla 2). Estos resultados muestran que PZ-34 y PZ-38 son inhibidores novedosos ABCG2 muy potente.
Para investigar más si PZ-34 y PZ-38 pueden invertir la MDR mediada por ABCG2 en una célula de cáncer resistente a fármacos línea, se utilizó la línea celular de cáncer de mama drogas seleccionado MCF7 /AdVp3000 el que sobre-expresa ABCG2 y probamos un sustrato fármaco anticancerígeno adicional de ABCG2, adriamicina. Como se muestra en la Fig. 5C, tanto PZ-34 y PZ-38 a 500 nm a reducir drásticamente la resistencia de MCF7 /AdVp3000 tanto adriamicina y mitoxantrona.
PZ-34 y PZ-38 no afectan a la oligomerización ABCG2
Anteriormente, se ha demostrado que ABCG2 puede existir y funcionar como un homo-oligómero de [4], [6]. Para examinar si PZ-34 y PZ-38 posiblemente inhiben oligomerización ABCG2, co-inmunoprecipitación de dos ABCG2 diferencialmente etiquetados se realizó como se describe anteriormente [4] después de un tratamiento de 6 horas con PZ-34 y PZ-38 a 3,3 mM. Sin embargo, no se encontró efecto de PZ-34 y PZ-38 en ABCG2 co-inmunoprecipitación (ver. Suplementario Fig S1), lo que sugiere que PZ-34 y PZ-38, similar a PZ-39 [7], no pueden afectar ABCG2 oligomerización. Sin embargo, debido a la limitación de co-inmunoprecipitación, estos inhibidores pueden afectar a la dimerización de que no puede ser revelada por co-inmunoprecipitación debido a la existencia de al menos 3 sitios de interacción diferentes de la ABCG2 oligomérica [4], [6].
Efecto de PZ-34 y PZ-38 en la vida media de ABCG2
Como se discutió anteriormente, tanto PZ-34 y PZ-38 suprime la expresión ABCG2 (Fig. 2). Para descartar la posibilidad de que esta supresión se debe a la inhibición de la expresión génica, se realizó análisis en tiempo real RT-PCR. Como se muestra en la Fig. S2, los niveles de estado estacionario de ABCG2 mRNA son los mismos entre los grupos control y de tratamiento compuesto y, por lo tanto, eliminando la posibilidad de que estos compuestos afectan a la transcripción o la estabilidad de ABCG2 mRNAs.
Para determinar si la expresión suprimida de ABCG2 es debido a la degradación inducida por inhibidores de como previamente hemos observado con PZ-39 [7], se examinó el efecto de PZ-34 y PZ-38 en la vida media de ABCG2 en células /ABCG2 HEK293 por las células pre-tratamiento con cicloheximida, que inhibe la elongación durante la síntesis de proteínas, seguido de tratamiento con PZ-34 y PZ-38 durante diversos tiempos. Como se muestra en la Fig. 6A, la pérdida de ABCG2 en las células tratadas con una combinación de cicloheximida y PZ-34 o PZ-38 es mucho más rápido que el del tratamiento de control con vehículo DMSO o control FTC. La vida media de ABCG2 en presencia de PZ-34 y PZ-38 se estima en ~ 8 horas que es estable con una vida media estimada de más de 60 horas en el tratamiento de control con FTC o DMSO (Fig. 6B ). Por lo tanto, PZ-34 y PZ-38 probablemente acelera la degradación de la proteína ABCG2 de manera similar como PZ-39 [7].
A, el análisis de transferencia Western. células HEK293 /ABCG2 fueron tratados primero con 5 mg /ml de cicloheximida (CHX) seguido de la adición de 3 M de PZ-34, PZ-38, el control de FTC, o DMSO durante diversos tiempos. Las células se recogieron a continuación para el análisis de transferencia Western de ABCG2 se sondaron con anticuerpo monoclonal BXP-21. Actina se utilizó como control de carga. B, la vida media de ABCG2. niveles ABCG2 en transferencia de Western como se muestra en el panel A se determinaron utilizando Scion Image y se representaron frente al tiempo de tratamiento. Los datos mostrados son la media ± SD de tres experimentos.
degradación ABCG2 PZ-34 y PZ-38 inducir en lisosoma
Se ha informado anteriormente de que de tipo salvaje y plegada correctamente proteínas ABCG2 se degradan en los lisosomas, mientras que las proteínas mutantes y mal plegadas están involucrados en la degradación mediada por ubiquitina proteasoma en [16]. Además, encontramos previamente que PZ-39 causa la degradación ABCG2 a través de lisosoma mediada por la degradación de [7]. Para determinar si PZ-34 y PZ-38 causa la degradación ABCG2 a través de lisosoma o proteasoma, se utilizó bafilomicina A
1, un inhibidor de la degradación de proteínas en lisosomas, y MG-132, un inhibidor del proteasoma tal como se describe anteriormente [7]. Como se muestra en la Fig. 7A, el tratamiento previo de las células con bafilomicina A
1 inhibe PZ-34 e inducida por PZ-38 degradación ABCG2 mientras que el tratamiento previo con MG-132 no lo hace. Por lo tanto, probable PZ-34 y PZ-38 también inducen la degradación ABCG2 en lisosoma, lo mismo que PZ-39 [7].
A, la degradación en los lisosomas ABCG2. HEK293 /células ABCG2 se trataron con 3 M de PZ-34 o PZ-38 en ausencia o presencia de 10 nM bafilomicina A
1 (BMA1) o 2 M MG-132 durante diversos tiempos. Las células se recogieron a continuación por análisis de transferencia de Western de la expresión ABCG2 se sondaron con anticuerpo monoclonal BXP-21. Actina se utilizó como control de carga. B, ABCG2 cambios conformacionales. células HEK293 /ABCG2 y MCF7 /AdVp3000 se trataron con 10 mM de PZ-34, PZ-38, o control de vehículo DMSO seguido de tinción con el anticuerpo monoclonal 5D3 y FACS análisis. Punta de flecha indican los grupos tratados con el PZ-34 y PZ-38.
PZ-34 y PZ-38 se unen a ABCG2
Se ha informado anteriormente de que el anticuerpo monoclonal 5D3 se une a ABCG2 en la superficie celular más fácilmente tras la unión de los inhibidores a ABCG2 posiblemente debido a inhibidores inducidos por cambios conformacionales de ABCG2 [7], [12], [17]. Para determinar si PZ-34 y PZ-38 potencialmente se unen a ABCG2, hemos realizado análisis de tinción de ABCG2 usando 5D3 en presencia o ausencia de PZ-34 y PZ-38. Como se muestra en la Fig. 7B, tanto PZ-34 y PZ-38 causa un incremento en la tinción 5D3 tanto en las células MCF7 /AdVp3000 y HEK293 /ABCG2, lo que indica que tanto PZ-34 y PZ-38 se pueden unir a ABCG2 y los cables de unión con el cambio conformacional de ABCG2.
Discusión
en el presente estudio, mostramos que hay posiblemente dos grupos de inhibidores ABCG2 y la degradación inducida por inhibidores de ABCG2 en lisosoma puede ser más común de lo que se había previsto anteriormente. También mostramos que PZ-34 y PZ-38 son inhibidores potentes ABCG2. Aunque PZ-34 y PZ-38 son estructuralmente diferentes de inhibidor de la ABCG2 previamente identificados, PZ-39, que parecen tener mecanismo de acción similar al inhibir la función de ABCG2 y acelerando la degradación ABCG2 en lisosoma.
Entre muchos inhibidores de la ABCG2 previamente identificados, pocos son conocidos por ser específicos de ABCG2 y ninguno ha sido investigado para mostrar si podían acelerar la degradación ABCG2 en lisosoma. En este y en nuestros estudios anteriores [7], se encontró que FTC no afectó la expresión ABCG2 mientras que tanto NSC-168201 y NSC-120668 hicieron. En los cuatro inhibidores ABCG2 nuevas (PZ-8, 16, 34, y 38) probados en este estudio, tres suprimió la expresión ABCG2 mientras que el otro no. Tomados en conjunto, creemos que hay dos grupos de inhibidores ABCG2 con una inhibición de la única actividad ABCG2 y el otro también suprimir la degradación ABCG2, además de inhibir la función ABCG2. Nombramos estos inhibidores como los inhibidores estáticos y dinámicos, respectivamente.
Actualmente se desconoce cuáles son las diferencias fundamentales que existen entre estos dos grupos de inhibidores hacen que la diferencia en su mecanismo de acción. Es, sin embargo, es tentador especular que se unen a dos sitios diferentes en ABCG2. La unión a cualquiera de los sitios causará cambios conformacionales de ABCG2 que conducen a la inhibición de la actividad ABCG2. Sin embargo, la unión a uno de los sitios también facilitará la endocitosis ABCG2 y la degradación en lisosomas. El cambio de conformación ABCG2 por PZ-34 y PZ-38 detectó utilizando el anticuerpo monoclonal 5D3 sugiere que PZ-34 y PZ-38 se unen directamente a ABCG2 aunque sus sitios de unión son actualmente desconocidos. Desde FTC también causa cambio conformacional pero no acelera la degradación ABCG2, PZ-34 y PZ-38 probablemente no se unen al sitio similar a la FTC. Anteriormente, se ha demostrado que la endocitosis acelerada y la degradación de β receptor
2-adrenérgicos de unión en lisosoma [18] agonista, apoyando la hipótesis anterior. Aunque es poco probable, también es posible que los inhibidores de la ABCG2 dinámicos pueden tener efecto fuera del objetivo que activa las vías de aguas arriba implicadas en la degradación ABCG2. En cualquier caso, estas posibilidades necesitan ser probados en futuros estudios en profundidad.
Anteriormente, se ha demostrado que la degradación ABCG2 se produce principalmente a través de dos mecanismos diferentes. Mientras correctamente plegada tipo salvaje ABCG2 se degradan principalmente a través de lisosomas [16], las proteínas mutantes se degradan por proteasoma a través de un mecanismo de control de calidad [16], [19], [20]. Parece que el mecanismo de control de calidad se produce a la derecha ER después de la síntesis de ABCG2 y la degradación normal de las proteínas de tipo salvaje pueden producirse a través de la endocitosis de ABCG2 a partir de membranas de plasma. En la actualidad, todavía no se sabe si la dinámica de degradación inducida por los inhibidores de la ABCG2 se produce por el tráfico de lisosomas de las membranas plasmáticas a través de endocitosis y /o de las membranas ER inmediatamente después de su síntesis.
A pesar de que actualmente se desconoce si PZ -34 y PZ-38 son específicos de ABCG2, nuestros resultados muestran que no afectan ABCB1 y la función ABCC1 y expresión. Por lo tanto, PZ-34 y PZ-38 son más específicos para ABCG2 que algunos de los inhibidores de la ABCG2 previamente identificados como el conocido GF120918 ABCG2 inhibidor que parece inhibir ABCB1 y /o ABCC1 igualmente bien [2], [21]. También se encontró que tanto PZ-34 y PZ-38 no son citotóxicos con una concentración de hasta 10 mg /ml, lo que sugiere que estos inhibidores ABCG2 probablemente no se unen a e inhiben otras proteínas celulares con alta afinidad, que son esenciales para la supervivencia celular. Sin embargo, se necesitan más estudios para investigar la especificidad de PZ-34 y PZ-38 y para determinar si se unen e inhiben otros miembros de la familia de transportadores ABC humano.
El hecho de que PZ-34 y PZ -38 no tienen citotoxicidad para las células HEK293 a concentraciones menores de 10 micras y puede revertir eficazmente MDR sugiere que la ventana de índice terapéutico de estos compuestos son grandes. Un quimio-sensibilizador ideal es que no debe ser tóxico en sí. Claramente, PZ-34 y PZ-38 satisfacen este requisito en los estudios in vitro en. Sin embargo, no se sabe si estos compuestos son tóxicos y eficaces para revertir la MDR in vivo, que necesita ser evaluado en futuros estudios con modelos animales.
Materiales y Métodos
Materiales
anticuerpos
El anticuerpo monoclonal BXP-21 contra ABCG2, anti-Myc y anti-HA fueron de ID Labs, la señalización celular, y Roche, respectivamente. El anticuerpo monoclonal C219 y MRPr1 se adquirieron de Kamiya Biomedical Company. anticuerpo 5D3 conjugado con biotina y conjugados de ficoeritrina-estreptavidina fueron de eBiosciences. Todos los reactivos de electroforesis, kit de ensayo de concentración de proteínas y las membranas de difluoruro de polivinilideno se adquirieron de Bio-Rad. FTC, adriamicina, mitoxantrona, camptotecina, ditiotreitol, Sulforodamina B (SRB), y Triton X-100 fueron de Sigma. Los compuestos PZ-8, PZ-16, PZ-34, PZ-38 y PZ-39 fueron comprados a Espec. NSC-168201 y NSC-120668 fueron regalos de Instituto Nacional del Cáncer. La proteína G-PLUS-agarosa y SYBR Green PCR Master Mix eran de Santa Cruz Biotechnology y Applied Biosystems, respectivamente. LipofectAMINE Plus y G418 eran de Invitrogen. Cultivo de células y medio IMEM DMEM eran de Biosource Internacional y Medios de Comunicación Tech, respectivamente. Todos los demás productos químicos eran de la calidad de biología molecular de Sigma o Fisher Scientific.
Cultivo celular, tratamientos y preparaciones de lisado
línea celular de cáncer de mama humano MCF7 y sus líneas FC19 derivados (un regalo de Julie Horton en el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental) y MCF7 /AdVp3000 (un regalo de Susan Bates en el Instituto Nacional del cáncer), HEK293 /ABCC1 [14], HEK293 /vector [14], HEK293 /ABCG2 [4] se cultivaron como se describe anteriormente [ ,,,0],4], [13], [14], [22]. Para el análisis de la degradación de ABCG2, las células HEK293 /ABCG2 fueron tratados primero con 10 nM bafilomicina A
1 o 2 M MG132 durante 24 horas seguido de tratamiento con 3 M PZ-34 o PZ-38 durante diversos tiempos y la recogida de los lisados celulares . Para la determinación de ABCG2 vida media, las células HEK293 /ABCG2 fueron tratados con 5 mg /ml de cicloheximida, 3 M PZ-34 o PZ-38 para las varias veces seguido por la recolección de células. preparación de lisado se realizó como se describió anteriormente [22].
Western blot, inmunoprecipitación y análisis FACS
Western blot, inmunoprecipitación y análisis FACS de la acumulación del fármaco se llevaron a cabo tal y como hemos descrito anteriormente [ ,,,0],4], [6]. Para determinar el cambio conformacional de ABCG2 después del tratamiento con inhibidores de la ABCG2, las células HEK293 /ABCG2 se incubaron con 10 mM PZ-34 o PZ-38 a 37 ° C durante 30 min antes de incubar con el anticuerpo 5D3 conjugado con biotina (dilución 1:100) durante 2 horas. Después, las células se lavaron 3 veces y se incubaron con estreptavidina-ficoeritrina durante 30 minutos seguido de lavado y análisis usando FACS.
Ensayo de citotoxicidad
La citotoxicidad se determinó usando ensayos de SRB y MTT como se describe anteriormente [ ,,,0],6], [22], [23]. El efecto de los inhibidores de ABCG2 sobre la resistencia a fármaco se determinó mediante la exposición de las células a un intervalo de concentraciones de fármacos contra el cáncer en la ausencia o presencia de diferentes concentraciones de los inhibidores de la ABCG2. El índice de potencia y la sensibilización de los inhibidores de la ABCG2 se calcula de la siguiente manera:
tiempo real RT-PCR
La extracción de RNA y en tiempo real de RT-PCR se realizaron como ya hemos descrito anteriormente [22]. Las secuencias de los cebadores 5'-ABCG2 son GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 '(hacia delante) y 5'-ATGGCGTTGAGACCAG-3' (hacia atrás). Las secuencias de los cebadores GAPDH son 5'-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 '(hacia delante) y 5'-CCATCACGCCACAGTTTCC-3' (hacia atrás). El nivel de ARN ABCG2 relativa (2
Ct) tratados con inhibidores se expresó como porcentaje del control (en presencia de 0,1% de DMSO) en la que? Ct (ciclo umbral) = (CT
ABCG2-CT
GAPDH ).
Apoyo a la Información
Figura S1.
Efecto de PZ-34 y PZ-38 en ABCG2 dimerización /oligomerización. células HEK293 co-transfectadas con Myc y ABCG2 marcada con HA fueron expuestos a 3,3 M PZ-34, PZ-38, o el control de DMSO durante 6 horas y los lisados celulares se sometieron a inmunoprecipitación con anti-Myc o anticuerpo monoclonal anti-HA seguido por Western blot probaron utilizando anticuerpos anti-HA y anti-Myc
doi:. 10.1371 /journal.pone.0015276.s001 gratis (JPG)
figura S2.
Efecto de PZ-34 y PZ-38 en el nivel de ARNm ABCG2. células HEK293 /ABCG2 se trataron con vehículo DMSO, PZ-34, o PZ-38 durante diversos tiempos y se recogieron para la preparación de RNA y análisis RT-PCR en tiempo real. Los datos mostrados son la media ± SD de tres experimentos independientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0015276.s002 gratis (JPG)
Reconocimientos
gracias al Programa de Desarrollo Terapéutica en NCI para los compuestos NSC utilizados en este estudio.