Extracto
gliomas de alto grado (Organización Mundial de la Salud de grado III astrocitoma anaplásico y el glioblastoma multiforme grado IV), el más prevalente cerebral maligno primario tumores, muestran una jerarquía celular con células, auto-renovación tumorigénicas madre del cáncer (CSC) en el ápice. Si bien la hipótesis CSC ha sido un modelo atractivo para describir muchos aspectos del comportamiento del tumor, que sigue siendo controvertido debido a problemas no resueltos, incluyendo el uso de
ex vivo
análisis de las condiciones de crecimiento diferencial. Una población CSC se ha confirmado en los gliomas malignos por la formación de tumores preferencial de las células directamente aislados a partir de muestras de biopsia de pacientes. Sin embargo, la comparación directa de múltiples poblaciones de células tumorales con el análisis de los fenotipos resultantes de cada población dentro de un entorno tumoral representante no ha sido claramente descrita. Directamente a prueba el potencial tumorigénico relativa de células madre cancerosas y las células tumorales no madre en el mismo microambiente, se interrogaba poblaciones de tumores emparejados purificada a partir de un tumor primario humano trasplantado en un modelo de xenoinjerto de ratón y se controló
in vivo
el crecimiento del tumor competitiva los estudios que utilizaron en serie
in vivo
microscopía intravital. Mientras que las CSC eran una pequeña minoría de la población de células cancerosas trasplantadas inicial, la células madre cancerosas, no las células tumorales no madre, impulsó la formación de tumores y produjo tumores que presentan una jerarquía celular. En los tumores resultantes, una fracción de las células madre cancerosas trasplantadas iniciales mantiene expresión de celular y la proliferación vástago marcadores, que fueron significativamente mayores en comparación con la población de células tumorales no vástago y demostró que las CSC genera heterogeneidad celular dentro del tumor. Estas comparaciones cara a cara entre los CAC emparejados y las células tumorales no troncales proporcionan la primera evidencia funcional utilizando imágenes en vivo que en el mismo microambiente, células madre cancerosas más que las células tumorales no madre son responsables de la propagación del tumor, lo que confirma la definición funcional de una CSC
Visto:. Lathia JD, J Gallagher, Myers JT, Li M, Vasanji A, McLendon RE, et al. (2011) Directo
En Vivo
La evidencia de propagación del tumor por células madre del cáncer glioblastoma. PLoS ONE 6 (9): e24807. doi: 10.1371 /journal.pone.0024807
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2011; Aceptado: August 22, 2011; Publicado: 22 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Lathia, et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo en el laboratorio Rich es apoyada por la Damon Runyon Fundación de Investigación del cáncer, la Sociedad Nacional de Tumores Cerebrales, Fundación Goldhirsh, Fundación James S. McDonnell y subvenciones NIH CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), CA151522 (ABH), 5P50-NS-20023-26 (REM) y un Premio del Servicio de Investigación Nacional CA142159 (JDL). REM es apoyado por la Fundación Pediatric Brain Tumor. JNR es un investigador clínico Damon Runyon-Lilly con el apoyo de la Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon. ABH es apoyado por la Sociedad Nacional de Tumores Cerebrales. AYH es apoyado por la Fundación de San Baldrick, la Fundación Dana, Instituto de Investigación del Cáncer y la Fundación Ángel de la Gabrielle. JDL es apoyado por la Asociación Americana de Tumores Cerebrales Fellowship (patrocinado por el Fondo Syverson Joelle). AYH y JDL reconocen fondos de la subvención piloto del Centro Integral del Cáncer de la caja (RES50-5509). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los tumores humanos muestran habitualmente una heterogeneidad dentro de su compartimiento neoplásico que pueden derivarse de una combinación de alteraciones del número de copias genéticas estocásticos y una jerarquía epigenético que co-evolucionan con el tiempo [1]. Integrando el concepto de que los tumores pueden contener una población de células madre similares a las responsables de su mantenimiento y la propagación puede ser informativo, tanto para el cáncer y los campos de células madre [2]. La hipótesis CSC puede ayudar a comprender la resistencia del tumor y terapéutica recurrencia y subrayar la complejidad del cáncer. La emoción que rodea a la hipótesis de CSC se ve atenuada por la controversia con respecto a apropiarse de sistemas de modelos experimentales para definir funcionalmente las CSC CSC, la frecuencia, y inmunofenotipos universalmente informativos [3]. las células madre normales y neoplásicas están actualmente definidas por ensayos funcionales de auto-renovación y diferenciación, con el ensayo más preciso hasta la fecha para los CAC siendo la propagación del tumor. modelos de xenotrasplante han confirmado la capacidad de formación de tumores mejorada de las fracciones enriquecidas-CSC en una variedad de tumores humanos y se han utilizado para estimar la frecuencia de células tumorales de propagación [4], que es bastante alto para algunos tumores malignos [3]. A medida que el nicho en el que tanto las células madre normales y neoplásicas residen instruye a la auto-renovación y mantenimiento, animal vivo en las técnicas de imagen in vivo han sido aplicado a algunas poblaciones de células madre - Células madre en particular hematopoyéticas y leucémicas - para determinar los patrones de crecimiento en el microambiente nativo [ ,,,0],5], [6], [7], pero la aplicación a los tejidos sólidos ha sido limitada. CSC de tumores sólidos han sido caracterizados en ensayos ex vivo o poblaciones como segregadas, que han sido informativo en la determinación de las vías de diferencialmente regulados pero han impedido el análisis directo de la propagación del potencial tumor entre las diferentes fracciones de células tumorales. Para evaluar el potencial de células madre cancerosas en comparación directa con las células tumorales no madre en un microambiente representante, que marcadas diferencialmente fracciones de células GBM derivadas de un tumor humano y supervisado el comportamiento del tumor en un modelo de xenotrasplante en el tiempo mediante microscopía intravital. A pesar de un pequeño número de células madre cancerosas en el trasplante, la propagación del tumor fue impulsado por los CAC y sus descendientes, lo que demuestra la capacidad de los CAC, pero no las células tumorales no madre, para impulsar la formación de tumores y propagar la heterogeneidad celular.
Materiales y Métodos
El trasplante de células de glioma
células de glioma humano se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito y bajo protocolos aprobados por el IRB de Cleveland Clinic (Protocolo de 2559) y la Universidad de Duke (Protocolo de 7409). células de glioma se hicieron pasar transitoriamente como xenoinjertos en ratones desnudos bajo aprobada Cleveland Clinic IACUC protocolo ARC 8699 imagen in vivo y se llevó a cabo en virtud de la Case Western Reserve University Protocolo 2.009-0.109). Para los estudios iniciales de formación del tumor CSC, el espécimen utilizados (T4302) fue un astrocitoma anaplásico de grado III recién diagnosticado en un varón de 40 años que fue extirpado quirúrgicamente en la Universidad de Duke. En el momento de la extracción, la muestra se caracteriza por tener polysomy EGFR (EGFRvIII negativo), MGMT negativo, PTEN intacta, y polysomy de los cromosomas 7 y 10. Para los estudios de mezcla de células (es decir, ensayo de competición), el espécimen se utilizan (T4121) fue un glioblastoma multiforme recurrente (GBM) se diagnostica en un varón de 26 años que fue extirpado quirúrgicamente en la Universidad de Duke. En el momento de la extracción, la muestra se caracterizó haber amplificado EGFR (pero EGFRvIII negativo), MGMT positivo, la pérdida de PTEN, la pérdida del cromosoma 9p21, y polysomy de cromosomas 1p36, 1p32 y 19q13. Para los estudios experimentales, las células tumorales fueron retirados de xenoinjertos y células madre cancerosas fueron enriquecidos basado en la expresión CD133 por citometría de flujo (utilizando un anticuerpo CD133 /2-APC, Miltenyi) a continuación, se ensayaron funcionalmente para la renovación de uno mismo, la diferenciación multi-linaje, la expresión de marcadores de células madre y propagación del tumor como se ha descrito previamente [8]. Los CCC putativos de GBM espécimen T4302 fueron transducidas con un lentivirus para expresar la proteína fluorescente verde (GFP). Para tumor espécimen T4121, células madre cancerosas putativas se marcaron con proteína amarilla fluorescente (YFP) o las células tumorales y no madre fueron marcadas con una proteína fluorescente cian (CFP, T4121 espécimen tumor) por lentivirus (Sigma). CSC marcados y células tumorales no vástago (derivados de T4121) se mezclaron en una 10%: 90% [o 01:09] (CSC: células tumorales no tallo) ratio y trasplantadas en la corteza de un ratón desnudo a una profundidad de 1,5 - 2 mm. Se instalaron ventanas craneales como [9] se describe anteriormente. Los estudios por imágenes utilizan 25.000 células trasplantadas. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo un protocolo aprobado IACUC Cleveland Clinic.
imágenes Multifotónica
microscopía intravital se realizó utilizando imágenes multifotónica como se describe anteriormente [10] utilizando un sistema de imágenes Leica SP5 con un femto 16W -segundo láser sintonizado a 840-860 nm y se concentró a través de una lente de 20X de inmersión en agua (apertura numérica de 1,0). Antes de la formación de imágenes, los ratones fueron anestesiados y por vía intravenosa inyectados con dextrano de alto peso molecular fluorescente (& gt; 150 kD) para resaltar vasculatura. Las imágenes fueron adquiridas en un rango de 200 micras de 2 micras z-pilas. proyecciones de máxima intensidad, lo que representa 200 micras de profundidad, se ajustaron de manera uniforme en Photoshop (Adobe) antes de la visualización. Para reconstrucciones tridimensionales, los datos se ha importado al software de Imaris (Bitplane) para la representación de la superficie y el volumen se cuantificó para cada población de células.
La inmunotinción y el análisis estadístico
Se cortaron secciones congeladas usando un criostato (Leica) y la inmunotinción se realizó como se describe anteriormente [11] con anticuerpos contra Tra1-85 (I + amp; D Systems, 1:500), Medias 2 (R & amp; D Systems, 1:200), fosforilados histona H3 (PH3, Millipore , 1:500), y CD31 (Dako, 1:200). Los núcleos se counterstained con DRAQ5 (Biostatus limitado, 1:5000). Las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio confocal Leica SP5 como se describe anteriormente [11]. Análisis de todo el tumor se hizo durante 3 profundidades anatómicas en 3 ratones representativos, por un total de & lt; 400.000 células. El inmunofenotipo de las poblaciones de células trasplantadas se confirmó mediante citometría de flujo utilizando la expresión de CD133 (CD133 anticuerpo /2-APC, Miltenyi) de cada población de células como [8] se describe anteriormente. La inmunotinción de cada población de células in vitro se realizó utilizando anticuerpos descritos anteriormente y cuantificados sobre la base de un mínimo de 150 células de 10 campos. La significación estadística se calculó utilizando un modelo lineal.
imagen Análisis automatizado
Gran campo de visión (FOV) de imágenes tumorales secciones transversales fueron adquiridos utilizando una Leica DM4000, un objetivo de 40X , un CCD Q-Imaging, una etapa motorizada 8-deslizante Antes, imagen-Pro 6.2, y YFP, CFP, Cy5 (DRAQ5 marcado núcleos), y Texas Red (Sox2, Tra-1-85, o PH3) cubos de filtros. Las imágenes grandes FOV (~ 500 MB /canal) se importaron en Image-Pro para el análisis del uso de macros personalizadas. Para cada sección transversal, el canal de DRAQ5 se ha importado y espectralmente mejorado para igualar la apariencia de cada núcleo. Los núcleos se segmenta a continuación, morfológicamente "dilatada" para extender sus límites en el citoplasma, y "cuencas" filtrada para la separación celular. Una región de interés (ROI) se dibuja alrededor del tumor a granel y la PPC, YFP, y Texas Red canales fueron cargados en sucesión. Cada canal se filtra espectralmente y "multiplica" por la máscara de células descrito anteriormente. Segmentación mediante morfometría y la intensidad perfiles específicos para cada marcador /mancha seguido de operaciones lógicas de imagen que ofrece YFP, CFP, y el recuento de células positivas de anticuerpos. Para determinar el inmunofenotipo de la población trasplantada, la máscara nuclear binario resultante era "multiplicado" con el canal PH3 /Sox2 correspondiente. Positividad se asigna en forma automática la intensidad media de PH3 nuclear o Sox2 por encima de un umbral predefinido.
Resultados
Los gliomas malignos son cánceres sólidos para los cuales las jerarquías celulares han sido definidas de manera reproducible, permitiendo el interrogatorio de las células que se puede enriquecer de forma prospectiva para las características de CSC, incluyendo autorrenovación, potencial de diferenciación, la expresión de marcadores de células madre, y la propagación de tumores in vivo. Para hacer frente a la propagación del potencial diferencial de tumores in vivo, hemos utilizado modelos en los que habíamos demostrado previamente la capacidad de enriquecer funcionalmente o agotar las características de CSC en ensayos ex vivo, utilizando fluorescente etiquetado marcador de superficie celular [8], [11]. Si bien existe controversia en torno a CD133 como marcador CSC, muchos marcadores CSC propuesta de glioma (incluyendo L1CAM [12], A2B5 [13], y la integrina alfa 6 [11]) se solapan con CD133. Encontramos que CD133 enriquece para células madre cancerosas en las muestras de GBM utilizados para el estudio y segrega para tumorsphere eficacia de formación en comparación con alfa integrina 6 (datos no mostrados). Además, las fracciones de CD133 se propagan de manera eficiente tumores secundarios y CD133 enriquecimiento de células madre cancerosas de estos tumores recientemente se ha utilizado para validar una tirosina quinasa no receptor CSC-específica y óxido nítrico sintasa isoforma [14], [15]. expresión CD133 se evaluó después de etiquetado por citometría de flujo con 11% de las células YFP (CSC deriva) y 1% de las células de la PPC (no madre derivadas) siendo CD133 positiva (datos no mostrados). El procedimiento de titulación viral no alteró las propiedades de crecimiento (datos no mostrados).
En vivo
observación del crecimiento de las células madre de cáncer en un tumor
Hasta la fecha, el crecimiento de células madre cancerosas de tumores sólidos no ha sido evaluada en la resolución de una sola célula durante un transcurso de tiempo temporal in vivo. Para observar el potencial de propagación del tumor por células madre cancerosas solo, se utilizó la microscopía intravital en un modelo de ratón ortotópico xenotrasplante para identificar y rastrear el crecimiento de un pequeño número de células madre cancerosas en un tumor con el tiempo (fig. 1A). Temprano en el período de observación, cuando estaban presentes cantidades limitadas de células madre cancerosas (T4302, los días 3 a 13), los CAC se asociaron con los vasos sanguíneos en el nicho perivascular (Fig. 1B, C) como se describe por Gilbertson y compañeros de trabajo [16] y creció en proximidad con los vasos sanguíneos (Fig. 1D, E). Con el tiempo (desde el día 13 a 20), un nódulo tumoral forma rápidamente y no se observaron células tumorales para infiltrarse en las regiones periféricas (flechas azules), una característica histológica común de los gliomas malignos. Los resultados proporcionan la primera crecimiento del tumor curso de tiempo temporal de células madre cancerosas mediante formación de imágenes en vivo y confirman el potencial tumorigénico de las células madre cancerosas trasplantadas.
La formación de tumores en un modelo de xenotrasplante se observó a partir de células madre cancerosas GFP-etiquetados con el tiempo como se muestra en experimental diseño esquemático (A). micrografías de proyección (BD) demuestran la formación de tumores en el tiempo y reconstrucciones tridimensionales representados en las micrografías (E, E ') reveló células tumorales fueron estrechamente asociados con los vasos sanguíneos (E', que se muestra con las flechas blancas en D, E) y en las zonas periféricas (D, E, que se muestra en flechas azules). dextrano fluorescente (se muestra en rojo) se inyectó en la circulación para iluminar los vasos sanguíneos antes de la imagen. La barra de escala representa 50 micras.
células madre del cáncer superan las células tumorales no madre
in vivo
Numerosos estudios han demostrado la capacidad de formación de tumores diferencial entre células madre cancerosas y no -stem células tumorales [8], [15], [17], [18], sin embargo, una comparación cabeza a cabeza entre las dos poblaciones en alta resolución o en una manera dependiente del tiempo no se ha realizado. Esta evaluación es crítica como un glioma maligno se compone de múltiples poblaciones de células, existe la diafonía entre las poblaciones, y cómo las poblaciones de células interactúan es probable que sea informativo con respecto a los procesos tumorigénicos. Para evaluar el comportamiento de células madre cancerosas y células tumorales no madre en un microambiente idénticos, trasplantado marcados diferencialmente células madre cancerosas humanas y células tumorales no madre derivadas de la misma tumor parental en el mismo ratón receptor y se controló en el comportamiento in vivo con el tiempo mediante microscopía intravital (Fig. 2A). Sequential evaluación in vivo de la misma máquina que lleva una mezcla inicial de CSC (10%, YFP etiquetados) y las células tumorales no madre (90%, CFP etiquetado) demostró que las CSC superó no contener células tumorales, con un aumento de volumen de plegado 51.9 para las células madre cancerosas y un aumento de 0,92 veces para las células tumorales no madre (Fig. 2B) y el crecimiento entremezclado había limitado entre las poblaciones (Fig. 2C, D). El uso de múltiples poblaciones de células del mismo tumor, estos resultados de las imágenes proporcionan la primera evidencia de la capacidad de formación de tumores diferencial entre células madre cancerosas y células tumorales no madre in vivo usando imágenes secuenciales alta resolución.
CSC fraccionado y no madre tumorales las células se marcaron con diferentes proteínas fluorescentes y trasplantadas en ratones a una célula madre de cáncer 10% (YFP) relación de células tumorales no vástago 90% (CFP) para, como se muestra en el diseño experimental esquemática (a). Los CCC no superó los CAC in vivo, como se muestra en el gráfico de resumen (B), que se calcula en base a las reconstrucciones tridimensionales de las micrografías de proyección (B, C). Además, las poblaciones tumorales no se entremezclan en vivo (población no madre tumorales indica óvalo amarillo). dextrano fluorescente (se muestra en la púrpura) se inyectó en la circulación para iluminar los vasos sanguíneos antes de la imagen. La barra de escala representa 100 micras.
tumores resultantes contenían células madre del cáncer y sus descendientes
Los tumores secundarios formados por células madre cancerosas trasplantadas contienen múltiples poblaciones de células, sin embargo los estudios anteriores se han centrado en gran medida en el la histología de los tumores secundarios o expresión de marcadores tumorales pero no ha habido información limitada en relación con el grado de heterogeneidad, así como la contribución de los múltiples tipos de células para el desarrollo de la heterogeneidad. Después de los ratones desarrollaron signos neurológicos (que van desde 37 a 42 días después del trasplante), se utilizó el examen histológico para confirmar el fenotipo de las células trasplantadas en los tumores resultantes. Para delinear los límites de los tumores, los tejidos se tiñeron para un antígeno específico humano, Tra-1-85. Hemos encontrado que mientras tanto YFP positivo (CSC deriva) y positivo PPC (no madre derivadas) fueron detectables, la inmensa mayoría de las células tumorales se derivan de células madre cancerosas; 94,5 por ciento de TRA-1-85 células positivas dentro del tumor eran YFP positivo (CSC deriva) frente a 0,2 por ciento que eran CFP positivo (derivado no tallo, Fig. 3A, B).
Los tumores de la célula experimentos de mezclado (n = 3) se evaluaron para determinar su composición. La evaluación posterior de los tumores resultantes demuestra que la mayoría de las células dentro de la masa tumoral era de origen humano y deriva de CSC según lo confirmado por Tra-1-85 tinción y expresión YFP, se muestra en micrografías representativas (A) y gráfico de barras (B) . Se observó que las células tumorales trasplantadas periféricos (CSC positivos YFP y sus descendientes) para tener una asociación con los vasos sanguíneos. Micrografía de imagen multifotónica y reconstrucción tridimensional (C) representan estrecha asociación de las células tumorales (verde) con vaso sanguíneo adyacente (púrpura, iluminado por la inyección de dextrano fluorescente en la circulación antes de la imagen). El examen histológico de los tumores resultantes confirma estrecha asociación de las células tumorales a la vasculatura periférica mediante inmunotinción CD31 (D; CD31 en rojo, las células tumorales en verde, los núcleos de color morado). La barra de escala representa 50 micras. Datos que se muestran como valores medios +/- S.E.M. ***, P & lt; 0,001 según se evaluó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) guía empresas
Asociación entre los vasos sanguíneos y las células madre del cáncer y sus descendientes
La capacidad de los tumores. las células a crecer a lo largo de los vasos sanguíneos es un fenotipo que se identifica con frecuencia en muestras quirúrgicas de glioma humano. Para evaluar si este fenotipo se recapitula en los tumores resultantes de la co-trasplante de células madre cancerosas y células tumorales no madre emparejados, se evaluó la vasculatura del tumor usando microscopía multifotónica y el examen histológico de los tumores resultantes (Fig. 3C, D). Al día 38 (mostrado en la Fig. 2B), fuimos capaces de identificar un grupo de células tumorales en la periferia del tumor y análisis tridimensional demostrado que las células madre cancerosas y sus descendientes (células YFP) estaban en estrecha proximidad a la vasculatura (Fig. 3C). El examen histológico de resultante tumor utilizando un anticuerpo contra CD31 para marcar los vasos sanguíneos también confirmó que las CSC y sus descendientes (células YFP +) eran de hecho cerca de la vasculatura en las regiones separadas de la masa tumoral mayor, un fenómeno también se observa en pacientes con GBM (Fig. 3D).
células madre cancerosas se propagan heterogeneidad
in vivo
Para determinar si las células madre similares a contenía células tumorales trasplantadas, se evaluó la expresión del marcador de CSC, Sox2 [19], y se encontró que 25,9 por ciento de células madre cancerosas trasplantadas y sus descendientes (células YFP) eran Sox2 positivo en comparación con 0,1 por ciento de células no madre tumorales y sus descendientes (células de la PPC, la Fig. 4A, B). También se evaluó la proliferación utilizando el marcador de fase M fosforilada-histona H3 (PH3) y se encontró que 1,7 por ciento de células madre cancerosas y sus descendientes (células YFP) fueron activamente en la fase M, en comparación con menos de 0,01 por ciento de las células tumorales no madre y sus descendientes (células de la PPC, la Fig. 4C, D). Estas diferencias en la proliferación visto en nuestros informes clínicos de apoyo modelo que sugieren células madre cancerosas en proliferación (basado en el estado de CD133-positivo) caracterizar una clase agresivo de los tumores GBM [20].
El examen histológico se realizó a partir de tumores resultantes en la célula experimentos de mezclado (n = 3) para determinar la fracción de células madre como según la evaluación de la expresión de Sox2 y la presencia de células en proliferación como se confirma por el marcador de fase M histona fosforilada 3 (PH3). Micrografías representativas (A) y gráfico de barras (B) muestran la expresión de Sox2 (rojo) se asocia con células madre del cáncer y sus descendientes (verde), pero no con las células tumorales no madre y sus descendientes (Azules). Micrografías representativas (C) y gráfico de barras (D) demuestran la expresión PH3 (rojo) se asocia con células madre del cáncer y sus descendientes (verde), pero no con las células tumorales no madre y sus descendientes (Azules). La barra de escala representa 50 micras. Datos que se muestran como valores medios +/- S.E.M. ***, P. & Lt; 0,001 según se evaluó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), núcleos contrastados con DRAQ5 (púrpura) guía empresas
Para obtener una apreciación del grado de heterogeneidad establecido por el trasplantado los CCC (YFP células positivas), se evaluó el fenotipo de las células antes del trasplante. Los cultivos CSC contenían 74,8 por ciento de células positivas Sox2 (es decir, in vitro) en comparación con 24,9 por ciento de células positivas Sox2 YFP (CSC deriva) en el tumor (es decir, in vivo, la Fig. 5A-C). Estos resultados sugieren que el ambiente in vivo proporciona señales instructivas para recrear un equilibrio de estado de diferenciación y heterogeneidad de este modo celular. Una reducción similar se observó en Sox2 células tumorales no madre positivas (células de la PPC) de una población inicial de 7,1 por ciento en cultivo a 0,1 por ciento en el tumor (Fig. 5A-C). Las diferencias en el crecimiento también se observaron entre las poblaciones en cultivo en comparación con el interior del tumor. Uso del PH3 marcador de fase M como un sustituto de la proliferación, se observó un 2,1 por ciento células YFP positivos (CSC deriva) y 0,2 por ciento CFP células positivas (no madre derivadas) en cultivo en comparación con las células positivas 1,7 por ciento YFP y menos de 0,01 ciento CFP células positivas en los tumores (Fig 5A-C). Estos resultados demuestran que aunque las células tumorales no madre predominaron en puntos de tiempo antes de tiempo debido a las relaciones en el momento del trasplante, los tumores en crecimiento tenían un número limitado de células derivadas de células tumorales no madre, de los cuales unos pocos marcadores de células madre expresa o fueron activamente proliferantes. Los tumores resultantes se componen de células madre cancerosas y sus descendientes, una fracción de los cuales todavía contenían la expresión de marcadores de células madre y proliferaban activamente.
micrografías representativas (A) y gráfico de barras (B) de células expandidas antes del trasplante demuestran, Sox2 y expresión PH3 (rojo) es mayor en la fracción de CSC de células en comparación con las células tumorales no madre. Resumen figura representa la expresión de marcadores de in vivo e in vitro análisis (C). La barra de escala representa 50 micras. Datos que se muestran como valores medios +/- S.E.M. ***, P & lt; 0,001 y N.S. representa no significativa (p & gt; 0,05). tal como se evaluó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), núcleos contrastados con Hoechst 33342 (azul)
Discusión
El microambiente tumoral es un regulador crítico de la formación de tumores y de mantenimiento con contribuciones a la respuesta terapéutica y el fracaso. Sin embargo, muchos estudios de CSC y de tumores cerebrales no han modelado adecuadamente el microambiente. A menudo CSC y células tumorales no madre se cultivan en diferentes condiciones que incluyen diferentes medios y células madre cancerosas cultivadas como esferas y las células tumorales no madre cultivadas adherente. Como estas condiciones activan diferentes vías de señalización celular, algunos resultados CSC puede ser debido a artefactos de cultivo en lugar de diferencias celulares intrínsecos. Muchos estudios se llevan a cabo con las poblaciones en aislamiento, lo que no permite para la señalización entre células que es esencial para el crecimiento celular o la evaluación de la contribución de cada tipo de célula a la formación de tumores in vivo. Por otra parte, las interacciones con los componentes de nicho como la vasculatura o estroma no pueden evaluarse plenamente a menos que se llevaron a cabo estudios in vivo. Para modelar mejor el microambiente tumoral, que marcadas diferencialmente células madre cancerosas y células tumorales no madre e introdujimos las células en el mismo las condiciones in vivo. Nuestra evaluación de crecimiento proporciona la primera evidencia directa para la propagación del tumor por un tumor sólido CSC subpoblación in vivo usando imágenes en vivo y muestra que una pequeña fracción de las células tumorales puede propagar un tumor heterogéneo. Nuestros estudios ofrecen ventajas sustanciales sobre ex vivo o estudios de población emparejados debido a nuestra capacidad de modelo más apropiado el entorno in vivo y evaluar el comportamiento de múltiples poblaciones en tiempo real utilizando microscopía de alta resolución.
Hay muchos aspectos de la modelos de xenotrasplante que proporcionan ventajas potenciales, sin embargo todavía hay limitaciones. Conceptualmente, estos ensayos de trasplante ofrecen un mejor entorno en vivo a expensas de una apreciación de los procesos tumorigénicos en tiempo real, que sólo pueden ser inferidas después de la formación de tumores. Sin embargo, este enfoque cuadro negro se puede tratar con el uso de imágenes en vivo como se describe en este informe. El uso de imágenes en vivo, las complejidades del modelo de xenotrasplante pueden ser dilucidados y predicciones informativos se pueden hacer para el desarrollo de tumores, el mantenimiento y la respuesta al tratamiento. El uso cuidadoso de los modelos de xenotrasplante permitirá una mayor comprensión de la interacción entre células madre cancerosas y células tumorales no madre, así como la comunicación celular con los vasos sanguíneos, un nicho CSC en varios tumores cerebrales [16]. Además, estos enfoques pueden aclarar el fenómeno recientemente identificado de la diferenciación GBM CSC en células vasculares y aclarar el papel de esta plasticidad en los procesos tumorigénicos [21], [22], [23], [24]. Es de destacar, que no observó la integración de células marcadas en la pared vascular (datos no mostrados). Estas interacciones vasculares han implicaciones de largo alcance terapéuticos especialmente en el contexto de la angiogénesis en muchas terapias están bajo investigación. Además, una mayor apreciación de la interacción entre el microambiente del tumor y las células trasplantadas puede ayudar a explicar el retraso en el crecimiento tumoral en modelos de trasplante. Esto se pone de relieve por nuestras observaciones se muestran en la Figura 1, donde el crecimiento CSC entre el día 35 a día 38 es bastante notable, pero congruente con la dinámica de crecimiento del tumor en un modelo de trasplante de [25], [26]. Estas diferencias son probable que sea un reflejo de un proceso de varias etapas que incluye la supervivencia de células tumorales, la adaptación al entorno de acogida, seguido de crecimiento exponencial, que se puede extrapolar a entender recurrencia en pacientes
.
Nuestros datos también demostrar que este enfoque puede ser usado para definir mejor la heterogeneidad celular del cáncer, que será crítico tanto para la comprensión básica de la tumorigénesis y un modelo para probar terapias más apropiadamente pre-clínicos prometedores. En nuestros estudios, los tumores resultantes que se formaron contenían una población heterogénea, según la evaluación de la expresión de Sox2, a pesar de la representación sustancial de células YFP (CSC deriva). Este tipo de rastreo in vivo linaje se ha limitado en los estudios de GBM y nuestros resultados confirman que las CSC que expresa un marcador de células madre puede generar células que no expresan el marcador de células madre, lo que demuestra la transición entre estados de células madre in vivo. Los estudios preclínicos han confiado en el tamaño del tumor como una estimación de la eficacia. Nuestra demostración de que una pequeña fracción de las células de cáncer se propaga a un tumor in vivo representa un enfoque complementario para evaluar la eficacia de un determinado tratamiento por rastreo linaje. Tomado en un contexto clínico, una terapia que mata la mayoría de las células y deja tras de sí una pequeña población de células refractarios (susceptibles de ser enriquecida en células madre cancerosas) aparecerá eficaz si el tamaño del tumor es el resultado medido. Sin embargo, las células restantes, algunas de las cuales son células madre cancerosas, es probable que contribuyan a la recurrencia del tumor, como se ve a menudo en los pacientes después de las terapias eficaces en la reducción del tamaño del tumor [27]. Por lo tanto, la evaluación de los linajes celulares en un tumor después de la terapia en combinación con las evaluaciones tamaño del tumor y el análisis histológico es probable que proporcione una visión más precisa del impacto del tratamiento. La capacidad de evaluar el comportamiento de las células tumorales en sí en un modelo clínico relevante es valioso. Nuestros datos (este informe y [11], [28]) y los de otros grupos [16] indican que las células tumorales tienen una relación íntima con el sistema vascular; Sin embargo, la FDA aprobó el factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) neutralizar anticuerpos bevacizumab (Avastin) ha tenido un éxito clínico, a pesar del éxito en modelos pre-clínicos [29]. Resistencia a las terapias anti-VEGF se postula a ocurrir a través de la evasión o la indiferencia e implican angiogénesis modulada, vasculogénesis, la normalización vascular [30], [31]. Sin embargo, el modo dominante de la resistencia es aún por determinar y nuestro enfoque utilizando múltiples poblaciones de células tumorales y la microscopía de alta resolución en vivo es probable que proporcione una visión crítica. Para mayor impacto, estos métodos se pueden combinar con el uso de sistemas indicadores fluorescentes para evaluar la actividad transcripcional en tiempo real y en correlación con la respuesta terapéutica. Otra área en la que estos enfoques de formación de imágenes será útil es la evaluación de los inhibidores de Sonic hedgehog (Shh). No está claro si el modo de acción es directamente sobre las células tumorales, el estroma del tumor, o ambos, y la elucidación del mecanismo de acción es una prioridad inmediata como varios inhibidores de Shh están actualmente bajo investigación para una variedad de tumores incluyendo GBM [32] , [33].