Extracto
timidina quinasas (TKS) se han considerado como uno de los objetivos potenciales para el cáncer terapéutica debido a sus expresiones elevadas en las células cancerosas. Sin embargo, los análogos de nucleobases dirigidas a las TK han mostrado pobres citotoxicidad selectiva en las células cancerosas pesar de la actividad antiviral eficaz. 3'-desoxitimidina conjugado fenilquinoxalina (dT-QX) fue diseñado como un nuevo análogo de nucleobase para apuntar TK en las células cancerosas y la replicación celular a través de bloque resto quinoxalina intercalante de ADN conjugado. In vitro de detección de células mostró que dT-QX mata selectivamente una variedad de células de cáncer incluyendo el carcinoma de hígado, células de adenocarcinoma de mama y de glioma de cerebro; Considerando que tenía una baja citotoxicidad en las células normales como las células hepáticas humanas normales. La actividad contra el cáncer de dT-QX se atribuyó a su inhibición selectiva de la síntesis de ADN resultante en extensa estrés superóxido mitocondrial en las células cancerosas. Se demuestra que la unión covalente con 3'-desoxitimidina resto dirigido únicamente citotóxico fenilquinoxalina más hacia las células de cáncer que las células normales. Estudio preliminar de ratón con el modelo de tumor en el hígado subcutánea mostró que dT-QX inhibe eficazmente el crecimiento de tumores. dT-QX es la primera molécula de este tipo con componentes altamente modificables que presenta este citotoxicidad selectiva en las células cancerosas
Visto:. Wei Q, Zhang D, Yao A, L Mai, Zhang Z, Q Zhou (2012 ) Diseño, síntesis y In Vitro e In Vivo Estudios biológicos de un conjugado 3'-desoxitimidina que potencialmente mata selectivamente las células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e52199. doi: 10.1371 /journal.pone.0052199
Editor: Kamyar Afarinkia, University of Bradford, Reino Unido
Recibido: 2 Agosto, 2012; Aceptado: 12 Noviembre 2012; Publicado: December 26, 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (2011CB933100), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades central (HUST: 2010ZD023), y el importante Ciencia & amp Nacional; Tecnología Proyectos Específicos (2009ZX09301-014). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Con los cánceres siendo la principal causa de muerte en todo el mundo, el desarrollo de agentes anticancerígenos seguros y eficaces sigue siendo una necesidad urgente. terapia dirigida molecularmente ha sido el enfoque reciente para el desarrollo de fármacos contra el cáncer, como se ve en el ejemplo de Sorafenib [1], [2]. Sorafenib es un inhibidor de quinasa de tirosina de múltiples que potencialmente pueden minimizar los efectos adversos tales como hepatotoxicidad causada por otros medicamentos contra el cáncer que incluyen 5-fluorouracilo y doxorrubicina [3], [4]. Similar a tirosina quinasas, timidina quinasas (TKS) se han considerado otro objetivo potencial contra el cáncer [5] - [8]. TK son las primeras enzimas de fosforilación en la vía de timidina salvamento conversión de timidina a su forma 5 'fosfato para la síntesis de ADN. En células de mamíferos normales, TKS citosólica sólo están presentes en un nivel bajo en la fase S de las células; mientras que el nivel elevado de las TK se han observado en las células infectadas por virus y células cancerosas proliferan rápidamente [5] -. [8], por ejemplo, los tumores de pulmón y cáncer de mama tejidos [9], [10]
análogos
nucleobásicos focalización TK tales como AZT y aciclovir se ha demostrado actividad antiviral eficaz [11], [12]. Sin embargo, pobres cáncer de selectividad y laterales fuerte efectos han sido asociados con los análogos de nucleobases incluyendo agente de captura de neutrones conjugado 5-timidina boro y radioisotópica desoxiuridina yodado [13], [14]. Recientemente, una terapia de combinación utilizando la timidina quinasa predelivered seguido por análogos de nucleobases se ha investigado en pacientes con cáncer de hígado con efectos limitados lograrse [15]. Esto es probablemente debido a que los análogos de nucleobases orientada TKS tales como AZT se eliminan rápidamente por los procesos de reparación nucleobase después de que se incorporan en la síntesis de ADN de las células cancerosas a través de la vía de timidina salvamento [16] - [18]. 5-fluorouracilo, otro análogo de timina, es un inhibidor de la reductasa dihyrofolate y causa directamente la citotoxicidad en hepatocitos normales [3], [19]. Por lo tanto, es necesaria una alternativa de diseño de análogos de nucleobases más eficaces dirigidas a las TK.
Se presenta aquí una novela 3'-desoxitimidina fenilquinoxalina conjugado (dT-QX, Figura 1) que mata selectivamente una variedad de células cancerosas, pero no hepatocitos normales. Estructuralmente, dT-QX es un 3'-triazol-3'-desoxitimidina unido a un resto quinoxalina intercalante de ADN. dT-QX fue diseñado para apuntar a la vía de timidina de rescate basado en el hecho de que los derivados de timidina 3'-triazol se reconocen por las quinasas de timina humanos [20], [21]. El propósito de la adición de la fracción quinoxalina en la estructura dT-QX era bloquear la eliminación celular de los análogos de timidina [16] - [18] a través de la intercalación de ADN en la síntesis de ADN de las células cancerosas, porque fracción quinoxalina es un conocido intercalador de ADN [22]. Además, la estructura de quinoxalina puede ser convenientemente sintetizado por una etapa de condensación de un compuesto dicetona 1 [23] y un orto-fenilendiamina (Figura 1). Más importante aún, la estructura de quinoxalina es altamente modificable para modificaciones químicas con una variedad de sustituyentes para avanzado estudio de estructura-actividad para optimizar la actividad biológica potencial. A continuación, se evaluó la actividad contra el cáncer de dT-QX utilizando un panel de células cancerosas. También se investigaron los efectos de dT-QX en la inhibición de la síntesis de ADN y la inducción de estrés oxidativo celular. Por último, la inhibición del crecimiento tumoral por dT-QX se evaluó en ratones portadores de tumores hepáticos subcutáneos.
Materiales y Métodos
Síntesis
Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (WI, EE.UU.), J & amp; K Scientific Ltd. (Beijing, china), o Sinopharm Agentes químicos Co., Ltd (Shanghai, china) y se usó sin purificación adicional. Los espectros de RMN se registraron con espectrómetro Bruker Avance 400-RMN (Madison, WI, EE.UU.). Las abreviaturas utilizadas para los patrones de división de las señales de RMN de protón son: singlete (s), doblete (d), triplete (t), cuarteto (q), quinteto (qui), multiplete (m) y la señal de amplio (br). espectroscopía de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) el análisis se llevó a cabo con un espectrómetro de masas Thermo Fisher TSQ Quantum Max Triple cuadrupolo Etapa (MA, EE.UU.). Se obtuvo el compuesto 1 como se informó anteriormente [23]
6-Bromo-
N CD -.. (prop-2-inil) hexanamida (2)
A una solución de 6-bromohexanoico de ácido (694 mg, 3,56 mmol) en seco CH
2Cl
2 clorhidrato de propargilamina (50 ml) se añadieron (300 mg, 3,28 mmol), trietilamina (332 mg, 3,28 mmol) y 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (630 mg, 3.28mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo N
2 de 16 h a temperatura ambiente. La solución resultante se extrajo con CH
2Cl
2 (150 ml x 3). Se recogieron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera (250 ml), se secó con MgSO
4 y se concentró. Una separación cromatográfica flash (0 a 40% de EtOAc en hexano) proporcionó 2 como 01:01 syn /anti-mezcla de amida en forma de un aceite incoloro (390 mg, 1,68 mmol) con un rendimiento 51%.
1 H RMN (CDCl
3, 400 MHz, 01:01 syn /anti):
δ
= 5,71 (br s, 1H, NH), 4,05 (dd,
3J gratis (H, H) = 5,2 Hz,
4J gratis (H, H) = 2,5 Hz, 2H, CH
2), 3,53 (t,
3
J gratis (H, H) = 6,6 Hz, 1H; 0.5CH
2), 3,40 (t,
3
J gratis (H, H) = 6,7 Hz, 1H; 0.5CH
2), 2.24 a 2.19 (m, 3H, CH, CH
2), 1,87 (qui,
3J gratis (H, H) = 7,2 Hz, 1H; 0.5CH
2), 1,79 (qui,
3J gratis (H, H) = 7,0 Hz, 1H; 0.5CH
2), 1,67 (qui,
3J gratis (H, H) = 7,52 Hz, 2H, CH
2), 1,50-1,41 ppm (m, 2H, CH
2);
13C RMN (CDCl
3, 100.6 MHz, 01:01 syn /anti):
δ
= 172.3, 172.2, 79.5, 71.6, 44.8, 36.1, 36.1, 33.5, 32.4, 32.2 , 29,1, 27,7, 26,4, 24,7, 24,5 ppm (Figura S1); HRMS calculado para C
9H
15BrNO [M + H]
232.0337 y [M + 2 + H]
234,0316, encontrado 232,0324 y 234.0413.
N
-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-9,10-dioxo-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octahydrophenanthren-2-yloxy)hexanamide (3).
A una solución de 2 (390 mg, 1,68 mmol) en DMF seca (50 ml) se añadieron 1 (355 mg, 1,30 mmol) y carbonato de potasio (1,8 g, 13,0 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo N
2 de 16 h a temperatura ambiente y después se acidificó a pH 5 con HCl 5 N. La solución resultante se extrajo con CH
2Cl
2 (150 ml x 3). Se recogieron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera (250 ml), se secó con MgSO
4 y se concentró. Una separación cromatográfica flash (0 a 40% de EtOAc en hexano) proporcionó 3 como un aceite amarillo (320 mg, 0,76 mmol) con un rendimiento del 58%.
1 H RMN (CDCl
3, 400 MHz):
δ
= 7,53 (d,
4J gratis (H, H) = 2,9 Hz, 1H, CH ), 7,35 (d,
3J gratis (H, H) = 8,8 Hz, 1H, CH), 7,21 (dd,
3J gratis (H, H) = 8,7 Hz,
4J gratis (H, H) = 2,7 Hz, 1H, CH), 5,94 (br s, 1H, NH), 4,04 (dd,
3J
(H, H) = 5,3 Hz,
4J gratis (H, H) = 2,6 Hz, 2H, CH
2), 4,00 (t,
3J
(H, H) = 6,4 Hz, 2H, CH
2), 2,65 (s, 1H, CH), 2,53 (d,
3J gratis (H, H) = 14,3 Hz, 1H, CH), 2,24 (t,
3J gratis (H, H) = 7,6 Hz, 2H, CH
2), 2,21 (d,
4J gratis (H, H) = 2,5 Hz, 1H, CH), 1,82-1,70 (m, 4H; 2CH
2), 1,56-1,31 (m, 7H; 3CH
2, CH), 1,18 (s, 3H, CH
3), 0,95 (s, 3H, CH
3), 0,38 ppm (s, 3H, CH
3);
13C RMN (CDCl
3, 100.6 MHz):
δ
= 199,0, 181,3, 172,4, 158,1, 142,6, 134,6, 126,1, 124,2, 112,6, 71,7, 68,9, 68,1, 41,9, 39,2, 39,0, 36,3, 36,3, 35,5, 31,4, 29,7, 29,2, 28,9, 25,7, 25,2, 24,3, 18,8 ppm (Figura S2); HRMS calculado para C
26H
34NO
4 [M + H]
424,2488, encontrado 424.2487.
N
-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)-hexanamide (4).
A una solución de 3 (320 mg, 0,76 mmol) en tolueno (25 ml) se añadieron
o
fenilendiamina (103 mg, 0,95 mmol) y gel de sílice ( 300 mg). La mezcla de reacción se sometió a reflujo bajo N
2 para 18 h y después se concentró. Una separación cromatográfica flash (0 a 40% de EtOAc en hexano) produjo 5 como un sólido amarillo (230 mg, 0,46 mmol) con un rendimiento del 61%.
1 H RMN (CDCl
3, 400 MHz):
δ
= 8.9 a 8.7 (m, 3H; 3CH), 7,73-7,67 (m, 2H; 2CH), 7,30 (d,
3J gratis (H, H) = 8,8 Hz, 1H, CH), 7,02 (dd,
3J gratis (H, H) = 8,4 Hz,
4J
(H, H) = 2,8 Hz, 1H; CH), 5,71 (br s, 1H; NH), 4.14 a 4.6 (m, 4H; 2CH
2), 2,88 (s, 1H, CH), 2,56 (d ancho,
3J gratis (H, H) = 14 Hz, 1H, CH), 2.28 a 2.23 (m, 3H, CH
2, CH) , 1,89-1,73 (m, 4H; 2CH
2), 1,59-1,47 (m, 7H; 3CH
2, CH), 1,02 (s, 3H, CH
3), 0,99 (s, 3H, CH
3), 0,16 ppm (s, 3H, CH
3);
13C RMN (CDCl
3, 100.6 MHz):
δ
= 172,4, 158,0, 154,8, 148,4, 141,9, 141,3, 137,6, 134,8, 129,2, 129,1, 129,0, 128,6, 125,0, 118,1, 111,2, 79,6, 71,6, 67,7, 59,7, 42,0, 37,3, 36,3, 36,1, 36,0, 34,8, 31,5, 29,2, 29,1, 25,8, 25,3, 22,1, 19,0 ppm (Figura S3); HRMS calculado para C
32H
38N
3O
2 [M + H]
496,2964, encontrado 496.2964.
N
-((1-(2-(Hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-tetrahydrofuran-3-yl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)hexanamide (DT-QX).
A una solución de 4 (100 mg, 0,2 mmol) en 5 ml de DMF y 10 ml de CH
2Cl
2 se añadieron 3'-azido-3' desoxitimidina (54 mg, 0,20 mmol) y una solución acuosa de ascorbato de sodio (40 mM, 15 ml). La mezcla de reacción se purgó con N
2 durante 10 min, y CuSO
4 · 5H
se añadió 2O (8 mg, 0,03 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo N
2 a temperatura ambiente durante 12 h. La solución resultante se extrajo con CH
2Cl
2 (150 ml x 3). Se recogieron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera (200 ml), se secó con MgSO
4 y se concentró. Una separación cromatográfica flash (0-7% de MeOH en CH
2Cl
2) proporcionó dT-QX como un sólido blanco (114 mg, 0,15 mmol) con un rendimiento del 75%.
1 H RMN (DMSO
D
6
, 400 MHz):
δ
= 11,35 (s, 1H, OH), 8,34 (t,
3
J gratis (H, H) = 5,5 Hz, 1H, CH), 8.14 a 8.11 (m, 2H; 2CH), 08.06 a 08.04 (m, 1H, CH), 7,96 (d,
4
J gratis (H, H) = 2,8 Hz, 1H, CH), 7,79 (m, 3H; 2CH, NH), 7,39 (d,
3
J gratis (H, H) = 8,7 Hz, 1H, CH), 7,11 (dd,
3
J gratis (H, H) = 8,5 Hz,
4
J gratis (H, H ) = 2,8 Hz, 1H; CH), 6,40 (t,
3
J
(H, H) = 6,6 Hz, 1H; CH), 5,36-5,33 (m, 1H; CH), 5,28 (t,
3
J gratis (H, H) = 5,2 Hz, 1H, NH), 4,31 (d,
3
J gratis (H, H) = 5,5 Hz, 2H, CH
2), 4,18 (m, 1H, CH), 4,06 (t,
3
J gratis (H, H) = 6,4 Hz, 2H, CH
2), 3,67-3,60 (m, 2H, CH
2), 2,85 (s, 1H, CH), 2,67-2,57 (m, 2H, CH
2), 2,16 (t,
3
J gratis (H, H) = 7,4 Hz, 2H, CH
2), 1,79-1,62 (m, 5H, CH
3, CH
2), 1,56-1,43 (m, 10H; 5CH
2), 0,93 (s, 3H, CH
3), 0,91 (s, 3H, CH
3), 0,07 ppm (s, 3H, CH
3 );
13C RMN (DMSO-
D
6
, 100,6 MHz):
δ
= 172,0, 163,6, 157,4, 154,2, 150,4, 147,5, 145,2, 141,1, 140,9, 137,1, 136,1, 134,1, 129,5, 129,4, 128,9, 128,4, 125,3, 122,4, 117,7, 110,8, 109,5, 84,4, 83,8, 67,4, 60,6, 59,0, 58,5, 41,2, 37,0, 36,8, 35,5, 35,1, 34,9, 34,4, 34,0, 31,3, 28,5, 25,2, 24,9, 21,6, 18,5, 12,2 ppm; HRMS calculado para C
42H
51N
8O
6 [M + H]
763.3932, 763.3959 (Figuras encontraron S4 y S5).
4b, 8, 8-trimetil-9,10-dioxo-4b, 5,6,7,8,8a, 9,10 octahydrophenanthren-2-il 4-metil-piperazina-1-carboxilato de metilo (5).
a una solución de 1 (650 mg, 2,39 mmol) en DMF (30 ml) se añadieron hidrocloruro de 4-metil-1-piperazinecarbonyl cloruro (630 mg, 3,16 mmol) y carbonato de potasio (3,4 g, 24 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo N
2 para 18 h y después se acidificó a pH 5 con HCl 5 N. La solución resultante se extrajo con CH
2Cl
2 (150 ml x 3). Se recogieron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera (250 ml), se secó con MgSO
4 y se concentró. Una separación cromatográfica flash (0 a 25% de EtOAc en hexano) produjo 5 como un aceite amarillo (730 mg, 1,83 mmol) con un rendimiento del 77%.
1H NMR (CDCl $
3, 400 MHz):
δ =
7,86 (s, 1H; CH), 7,49 (s, 2H; 2CH), 3,71 (br s, 2H; CH
2), 3,61 (s, 2H, CH
2), 2,69 (s, 1H, CH), 2,58 (d,
3
J gratis (H, H) = 13,3 Hz, 1H, CH), 2,49 (s ancho, 4H; 2CH
2), 2,37 (s, 3H, CH
3), 1,47-1,42 (m, 5H; 2CH
2, CH ), 1,23 (s, 3H, CH
3), 0,98 (s, 3H, CH
3), 0,41 ppm (s, 3H, CH
3);
13C RMN (CDCl
3, 100.6 MHz): δ 198,2, 180,6, 152,5, 149,8, 147,4, 134,6, 129,4, 126,3, 122,5, 68,7, 53,7, 53,6, 41,7, 39,5, 38,7, 36,2, 36,1 , 35,5, 31,2, 26,9, 24,2, 24,2, 18,7 ppm (Figura S6); HRMS calculado para C
23H
31N
2O
4 [M + H]
299.2284, 299.2294 encontraron.
4b, 8,8-trimetil-4b, 5,6,7,8,8a-hexahidrodibenzo [a, c] fenazin-2-il 4-metil-piperazina-1-carboxilato (Pip-QX).
a una solución de 5 (330 mg, 0,83 se añadieron mmol) en tolueno (25 ml)
o
fenilendiamina (100 mg, 0,92 mmol) y gel de sílice (300 mg). La mezcla de reacción se sometió a reflujo bajo N
2 para 18 h y después se concentró. Una separación cromatográfica flash (0-3% de MeOH en CH
2Cl
2) proporcionó Pip-QX como un aceite amarillo (310 mg, 0,66 mmol) con un rendimiento del 79%.
1 H RMN (DMSO
D
6
, 400 MHz):
δ
= 08/14 a 08/05 (m, 3H; 3CH), 7,81-7,79 (m, 2H ; 2CH), 7,49 (d,
3
J gratis (H, H) = 8,4 Hz, 1H, CH), 7,29 (dd,
3
J gratis (H , H) = 8,4 Hz,
4
J gratis (H, H) = 2,4 Hz, 1H, CH), 3,63 (s ancho, 2H, CH
2), 3,46 (s ancho , 2H; CH
2), 2,88 (s, 1H; CH), 2,58 (m, 1H; CH
2), 2,38 (br s, 4H; 2CH
2), 2,16 (s, 3H, CH
3), 1,51-1,38 (m, 5H; 2CH
2, CH), 0,96 (s, 3H, CH
3), 0,90 (s, 3H, CH
3 ), 0,06 ppm (s, 3H; CH
3);
13C RMN (DMSO-
D
6
, 100,6 MHz):
δ
= 154,4, 153,3, 150,5, 147,5, 142,3, 141,6, 134,7, 130,2, 130,2, 129,4, 129,0, 125,7, 125,2, 119,3, 58,9, 54,7, 54,6, 46,2, 44,6, 44,0, 41,6, 37,7, 36,1, 35,4, 34,7, 31,8, 22,2, 19,0 ppm (Figura S7); HRMS calculado para C
29H
35N
4O
2 [M + H]
471.2760, 471.2767 encontraron.
Estudios Biológicos
El animal protocolo fue aprobado por el Comité de Revisión de la Facultad de Ciencia y Tecnología de la vida Humana en la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. líneas celulares de cáncer HepG2, Hep3B, MCF-7 y C6 se obtuvieron de ATCC (VA, EE.UU.). Células Células hepáticas humanas HL-7702 y el cáncer de hígado murino H22 eran de Shanghai Instituto de Ciencias de la Vida de la célula Culture Center (Shanghai, China). Las células se mantuvieron en DMEM de alta glucosa o medio RPMI-1640 (Invitrogen, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS), HEPES 25 mM, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 1,0 piruvato de sodio mM, 50 U /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C y 5% de CO
2. Las soluciones madre de dT-QX, Pip-QX o AZT se prepararon en DMSO, y la sal clorhidrato de doxorrubicina se disolvió directamente en el agua. Todos los productos químicos biológicos se obtuvieron de Sigma Aldrich (WI, EE.UU.) a menos que se especifique lo contrario. Todos los experimentos se repitieron de forma independiente al menos tres veces.
ensayo MTT La viabilidad celular.
Las células (5000 por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos en medio de crecimiento durante la noche antes de cada tratamiento en triplicado. dT-QX, Pip-QX o AZT fue a una concentración final de 0, 0,1, 1, 10, 20, 50, 100, o 200 mM con DMSO total de menos de 0,2%. La doxorrubicina se utiliza como una comparación a una concentración final de 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 o 2,0 mM. Después de 72 h, el ensayo de MTT se llevó a cabo según lo informado [23]. La viabilidad de las células de cada tratamiento se representó con el programa GraphPad Prism, y IC
50 valores se obtuvieron usando análisis de dosis-respuesta sigmoidal proporcionada por el software (versión 4.00, GraphPad Software, CA, EE.UU.).
anti-BrdU ensayo de fluorescencia.
Hep3B, HepG2 o células HL-7702 (50.000 por pocillo) se sembraron en el medio de crecimiento durante la noche en placas de 48 pocillos y se trataron con 0, 10 o 50 M dT-QX para 5 h. ensayo anti-BrdU se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (BD Biosciences, NJ, EE.UU.). Brevemente, se añadió solución de BrdU (0,1 mg /ml) a cada pocillo, y se incubaron las células a 37 ° C durante 3 h. medio celular se retiró y las células se fijaron con 3,7% de formaldehído en PBS. Las células se permeablized con 0,1% de Triton-100 en PBS y se bloquearon con 3% de FBS en una solución de PBS. El ADN celular se desnaturalizó por ADNasa I (0,3 mg /ml) en solución de PBS. La BrdU incorporada se tiñeron con Alexa Fluor®488 anti-BrdU anticuerpo monoclonal (BD Biosciences, NJ, EE.UU.). Los núcleos fueron contra el teñidas con solución de Hoechst 33342. imágenes de células de cada tratamiento fueron capturadas con Olympus IX71 microscopio invertido equipado con una cámara digital bajo luces apropiadas. Los impactos de Pip-QX y AZT en la síntesis de ADN en Hep3B se evaluaron de manera similar como se describe anteriormente.
estudio de fluorescencia de la producción de superóxido mitocondrial.
Células
Hep 3B o HL-7702 (50.000 por pocillo ) se sembraron en el medio de crecimiento durante la noche en placas de 48 pocillos. Las células se trataron con 0 o 50 mM dT-QX durante 8 h y después se eliminó medio. Se añadió una solución de MitoSOX indicador dismutasa mitocondrial Roja (Invitrogen, CA, EE.UU.) en PBS y se incubó a 37 ° C durante 20 minutos. Después, las células se lavaron una vez con PBS y se tiñeron counter-con solución de Hoechst 33342. Fluorescente imágenes fueron capturadas con Olympus IX71 microscopio invertido bajo las luces apropiadas. El estudio con 100 mM Mn (III) tetrakis (1-metil-4-piridil) porfirina de hidróxido tetratosylate (MnTmPyP, EMD Chemicals, Inc., EE.UU.) como control positivo en células Hep 3B se realizó de manera similar.
hígado subcutánea estudio de tumores en ratones.
células de cáncer de hígado murino H22 se mantuvieron inicialmente en el medio de crecimiento RPMI-1640 y luego crecen en los ratones BALB /c (Hubei Provincial Laboratory Animal Center, china) por vía intraperitoneal. Los ratones se sacrificaron después de 4 días y H22 células se recogieron con solución de PBS. H22 células se lavaron una vez con PBS estéril y se inyectaron por vía subcutánea (3x10
6 células por ratón) en la parte posterior inferior de ratones /c ingenuo BALB. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de (mm 8x8, 340 mm
3), nueve ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (3 por grupo) y se inyectaron con 100 l de solución salina (con 0,1% de DMSO), AZT (50 micras en PBS estéril con 0,1% de DMSO) o dT-QX (50 mM en PBS estéril con 0,1% DMSO) en el sitio del tumor en el día 1 y día 7. el crecimiento del tumor y el peso corporal se controlaron diariamente. En el día 12 tras la primera inyección, todos los ratones fueron sacrificados y las imágenes de los tumores se registraron. El análisis estadístico (ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey) de los tratamientos se realizó utilizando el software GraphPad Prism.
Resultados y Discusión
Síntesis de dT-QX se logró mediante el acoplamiento con AZT fenilquinoxalina 4 a través de cobre (I) reacción catalizada por clic (Figura 2). Intermedio 3 se obtuvo de la sustitución nucleófila de bromoalkyne 2 con terpenone oxidado 1. fenilquinoxalina 4 se obtuvo por condensación con
o
-diaminobenzene y gel de sílice a reflujo en tolueno, que era mucho mejor que el acetonitrilo, DMF o etanol. La conjugación de AZT con fenilquinoxalina 4 a dT-QX se llevó a cabo con un rendimiento del 75% utilizando la reducción in situ de cobre (II) por el ascorbato [20], [21]. Fenilquinoxalina 4, una molécula de referencia, se encontró que era poco soluble en solución acuosa DMSO 1% y por lo tanto fue modificado a un
N
metilpiperazina derivado Pip-QX como se muestra en la Figura 2. Pip-QX se sintetizó de de manera similar a dT-QX través de la conversión de 1 en el derivado de piperazina 5, seguido de condensación con
o
-diaminobenzene en un rendimiento global del 61%. Pip-QX sirvió como uno de los compuestos de referencia en el seguimiento de los estudios biológicos. Varios lotes de dT-QX y compuestos de control se sintetizaron, y todos los lotes realizan constantemente no sólo en la química, sino también en los estudios biológicos.
La actividad biológica de dT-QX fue evaluada usando primero la viabilidad celular ensayo en un panel de líneas celulares de cáncer, incluyendo el carcinoma de hígado humano HepG2 y Hep3B, carcinoma de hígado de ratón H22, adenocarcinoma de mama células de glioma C6 de cerebro de rata MCF-7, y. línea celular HL-7702 de hígado humano se utilizó como representante de las células normales en el estudio. células HL-7702 se transforman los hepatocitos humanos normales con baja expresión de marcadores de cáncer [24]. El tratamiento de la HL-7702 con dT-QX no resultó en ninguna citotoxicidad significativa a concentraciones tan altas como 200 mM (Figura 3A). La CE
50 de dT-QX en todas las células cancerosas se encontró que era intervalo de 6,6 a el 42,1 M. Se observó la citotoxicidad más pronunciado sobre las células Hep 3B carcinoma hepatocelular humano con la muerte celular de más de 80% a 20 mM, seguido de adenoma de pecho células de glioma C6 cerebrales MCF-7 y. En marcado contraste, Pip-QX no selectiva matado a todas las líneas de células incluyendo HL-7702 a 50 M (Figura 3b). El compuesto de referencia segundo, AZT como un análogo de 3'-desoxitimidina, se encontró que exhiben baja citotoxicidad contra estas líneas celulares (Figura 3C), mientras que el co-tratamiento de AZT más Pip-QX también no selectiva mató a todas las líneas celulares (Figura 3d ), similar a la de tratamiento Pip-QX solo. Estos resultados sugieren que la muerte selectiva de las células cancerosas respecto a las células normales del hígado por dT-QX era debido a la conjugación covalente único de fracción fenilquinoxalina citotóxico con 3'-desoxitimidina. En comparación, la doxorubicina medicamento contra el cáncer se encontró altamente tóxico para todas estas células. De hecho, la doxorrubicina fue aún más tóxico hacia el hígado normal 7702 que las células del cáncer de hígado Hep3B o H22 células en concentraciones por encima de 0,5 M (Figura 3e).
Un panel de líneas celulares de cáncer (color negro) y un hígado normal línea celular de hepatocitos (color rojo) se trataron con una) dT-QX; b) Pip-QX; c) AZT; d) Pip-QX más AZT y e) la doxorrubicina, respectivamente. La viabilidad celular se evaluó después de 72 h de incubación mediante el ensayo de MTT. El porcentaje de viabilidad se calculó y equipado con las curvas de dosis-respuesta usando el software GraphPad Prism. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
Para comprender mejor la citotoxicidad selectiva de dT-QX hacia las células cancerosas, lo primero que investigó la proliferación celular usando un ensayo de fluorescencia de anti-BrdU. BrdU (5-bromo-3'-desoxiuridina) es un análogo de timidina que se incorpora en el genoma celular como se replica [25]. Por lo tanto, el nivel de BrdU en núcleo de la célula refleja el nivel de la división y proliferación celular. Teniendo en cuenta los resultados de la viabilidad celular por encima, humana HL-7702, HepG2 y células Hep 3B fueron investigados como representantes de las células normales y cancerosas. El ensayo anti-BrdU se llevó a cabo en 5 h después del tratamiento dT-QX para permitir suficiente acumulación de compuesto en las células y para determinar su impacto sobre la síntesis de ADN celular. El nivel de BrdU en los núcleos de células se midió usando un conjugado fluorescente anti-BrdU [25] (color verde) con contra-manchado por Hoechst 33342 (color azul), como se muestra en la Figura 4.
ensayo BrdU núcleos de células se llevó a cabo después de las células tratadas con compuestos de 5 h. La BrdU incorporada se tiñó con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU Alexa Fluor®488 (color verde) con núcleos de células contra el teñidas con Hoechst 33342 (de color azul). a) la incorporación de BrdU en HL-7702, las células HepG2 o Hep 3B tratadas con DMSO o dT-QX; b) la incorporación de BrdU células tratadas con DMSO inHep3B, AZT o Pip-QX.
En las células HL-7702 humanos normales, los tratamientos de DMSO y dT-QX resultaron en niveles similares de incorporación de BrdU en los núcleos celulares , que indicaron la presencia de dT-QX no interferir con la división y proliferación celular. Sin embargo, se observó una pérdida significativa de fluorescencia verde en las células HepG2 y Hep3B cancerosas con tratamiento dT-QX en comparación con el del control de DMSO (Figura 4a). Estos resultados indicaron que dT-QX inhibe selectivamente la síntesis de ADN celular de las células HepG2 y Hep3B en la primera etapa del tratamiento que resulta en selectiva matando tanto de las células cancerosas. La inhibición de la incorporación de BrdU fue mucho más pronunciado en células Hep 3B con la pérdida completa de la fluorescencia verde en los núcleos de células (Figura 4a). Esto fue consistente con los resultados de viabilidad celular que dT-QX fue más eficaz en matar Hep3B de células HepG2. La citotoxicidad más pronunciado en las células Hep3B que HepG2 puede ser debido al hecho de que Hep3B se originó a partir de la infección de hepatitis B [26].
Para dilucidar que chemophore de dT-QX era responsable de la inhibición de la síntesis de ADN, el ensayo de fluorescencia anti-BrdU se llevó a cabo con AZT o Pip-QX en células Hep 3B (Figura 4b). El tratamiento de AZT no dio lugar a una inhibición significativa de la síntesis de ADN, mientras que Pip-QX, inhibió la síntesis de ADN en las células, similar a la de dT-QX, indicando chemophore phenylquaxinoline era responsable de la inhibición de la síntesis de ADN observada. En combinación con los resultados de viabilidad celular, se sugirió que la conjugación con 3'-desoxitimidina modificado de forma exclusiva el chemophore fenilquinoxalina citotóxico para que sea más selectiva hacia las células de cáncer que los hepatocitos normales. Estos resultados también confirmaron que la conjugación del resto de quinoxalina con 3'-triazol-3'-desoxitimina llevó a orientación selectiva de las células cancerosas mediante el bloqueo de su síntesis de ADN
.
La inhibición selectiva de la síntesis de ADN nuclear por dT-QX en el cáncer células condujeron a la hipótesis de que dT-QX podría inhibir selectivamente la síntesis de ADN mitocondrial y causar disfunción mitocondrial también. Desafortunadamente, el ensayo fluorescente anti-BrdU no era suficientemente sensible para observar tal inhibición en células. Alternativamente, la disfunción mitocondrial debido al agotamiento de ADN por análogos de nucleósidos se ha informado que se produzca simultáneamente con el nivel de superóxido elevada en las mitocondrias después del tratamiento durante 4 días [27]. Por lo tanto, el impacto de dT-QX en la función mitocondrial se evaluó mediante un ensayo de formación de imágenes de superóxido mitocondrial basado en la fluorescencia. Las células Hep 3B se investigaron como representante del modelo de células de cáncer debido a la pronunciada inhibición de la síntesis de ADN en una etapa temprana de DT-QX observó en el ensayo anti-BrdU (Figura 4a).
significativa fluorescencia de color rojo indicativo de la producción de superóxido se detectó en células Hep 3B después del tratamiento de 50 mM dT-QX durante 8 h en comparación con la DMSO (Figura 5). La presencia citosólica de tinción con rojo de superóxido fue confirmada por núcleos de las células contra-tinción con un colorante Hoechst. También se encontró que el tratamiento de las células Hep 3B con dT-QX para un tiempo más corto, tal como 3 o 5 h no indujeron fluorescencia roja significativa, lo que sugiere la producción de superóxido mitocondrial fue acumulativo y era probablemente debido a la inhibición de la síntesis de ADN celular. Además, un control positivo con un Mn (III) -chelator actuando como NADPH /GSH: O
2
- oxidorreductasa en células [28] resultó en un nivel similar de fluorescencia roja en células Hep 3B a que tratan con dT-QX (ver Figura S8). Por el contrario, se observó fluorescencia bajo fondo rojo en células HL-7702 humanos normales tratados con dT-QX, similar a la tratada con DMSO (Figura 5). Por lo tanto, estos resultados sugieren que dT-QX podría causar disfunción mitocondrial mediante la inducción de estrés superóxido mitocondrial en las células cancerosas después de la inhibición de la síntesis de ADN.
línea celular de cáncer Hep3B o células HL-7702 normales se trataron con DMSO o 50 M-dT QX durante 8 h. El nivel de superóxido mitocondrial se detectó con MitoSOX indicador superóxido mitocondrial (color rojo). Los núcleos celulares fueron contra el teñidas con colorante Hoechst (color azul).
Un estudio preliminar antitumoral in vivo con dT-QX se llevó a cabo en un modelo de ratón. tumores subcutáneos se establecieron con células de cáncer de hígado H22 murino [29]. Los tumores se dejaron llegar a un tamaño medio de 8,8 × 8,8 mm. La baja solubilidad relativa de dT-QX en solución PBS limitada la vía de administración que sea inyecciones intra-tumorales. Por lo tanto, AZT o dT-QX (100 L x 50 M cada uno) se inyectó directamente en los tumores en el día 1 y el día 7. Independientemente de los tratamientos, ni los ratones murió ni hubo una pérdida significativa de peso corporal observado durante el estudio de 12 días. El perfil de crecimiento del tumor de más de 12 días después de la primera inyección se muestra en la Figura 6a. Los tumores en los ratones tratados con AZT crecieron rápidamente, similares a los del control negativo (solución salina); mientras que el crecimiento de los tumores fue significativamente inhibido en dT-QX ratones tratados (Figura 6a). En el día 12 después de la primera inyección, los tamaños de los tumores en ratones inyectados con dT-QX eran claramente más pequeñas que las de AZT o solución salina (Figura 6b). El análisis estadístico confirmó también que el tratamiento de la dT-QX fue significativamente diferente de los otros dos (
P
& lt; 0,01). Estos resultados sugieren que la inyección intra-tumoral de dT-QX en una dosis baja (equivalente a 0,13 mg /kg por ratón) era bastante eficaz en la inhibición del crecimiento de tumores subcutáneos en un modelo de ratón.
tumor subcutáneo era establecida mediante la inyección de células H22 en la parte posterior inferior de ratones BALB /c por vía subcutánea (3 × 10
6 células por ratón).