Extracto
A pesar de que la orientación de las células cancerosas utilizando nanoportadores administrador del medicamento es una promesa para mejorar la especificidad agente terapéutico, la estrategia de maximizar la afinidad ligando para los receptores sobreexpresados en células cancerosas es subóptima. Para determinar los principios de diseño que maximizan la especificidad nanotransportador de células cancerosas, se estudió un modelo teórico basado en la cinética generalizadas de nanovehículos con uno o más ligandos que se unen específicamente a estos receptores sobreexpresados. Se demuestra que la cinética inherente al sistema desempeñan un papel importante en la determinación de la especificidad y de hecho pueden ser explotados para alcanzar órdenes de magnitud de mejora en la especificidad. En contraste con la tendencia actual de diseño terapéutico, mostramos que estos aumentos de especificidad en general se pueden conseguir por una combinación de bajas tasas de endocitosis y nanovehículos con múltiples ligandos de baja afinidad. Estos resultados son ampliamente robusta a través de mecanismos de endocitosis y protocolos de administración de medicamentos, lo que sugiere la necesidad de un cambio de paradigma en el diseño de distribución del fármaco dirigido a los receptores
Visto:. Tsekouras K, Goncharenko I, ME Colvin, Huang KC, Gopinathan a (2013) Diseño de alta especificidad nanoportadores mediante la explotación de efectos no-equilibrio en Cancer Cell orientación. PLoS ONE 8 (6): e65623. doi: 10.1371 /journal.pone.0065623
Editor: Bing Xu, Brandeis University, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Enero, 2013; Aceptado: April 25, 2013; Publicado: 26 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Tsekouras et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores reconocer el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias de subvención EF-1038697. AG también reconoce el apoyo de un Premio James S. McDonnell Fundación, de la Universidad de California Instituto de México y los Estados Unidos (UC MEXUS) la concesión, y George E. Brown, Jr. Award. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
daños colaterales a los tejidos sanos causados por la acción agente terapéutico sigue siendo un problema importante para la terapia del cáncer, lo que limita la eficacia del tratamiento y la aplicabilidad, y en última instancia comprometer la supervivencia del paciente. La especificidad se puede mejorar a través de nanovehículos conteniendo agente terapéutico equipados con ligandos que se unen a receptores sobreexpresados selectivamente en células de cáncer [1] - [3]. Aunque este enfoque es prometedor, con un número de fármacos en el mercado [4] y la investigación en curso se centra en conjugados nanotransportador-ligando y en la identificación de receptores viables [5] - [8], la aparición de efectos secundarios en los pacientes restos nanotransportador tratados un factor limitante. El diseño racional de nanoportadores polivalentes para la especificidad óptima, por tanto, presenta un reto interesante e importante
Varios recientes estudios teóricos y experimentales [9] - [15]. Han sido motivadas por la relevancia de ligando-receptor multivalente vinculante para ambas nanotransportador diseño y los procesos biológicos como la función del sistema inmunológico. En el contexto de la orientación de células de cáncer de alta especificidad, se ha demostrado que nanovehículos multivalentes equipadas con ligandos de baja afinidad puede lograr una cobertura mucho más alta en las células con modestamente mayor densidad de receptores en condiciones de equilibrio [3], [16]. Sin embargo, es el número de nanovehículos internalizados que es de importancia terapéutica y no simplemente el número en contacto con la superficie de la célula en condiciones idealizadas de equilibrio. Esperamos entonces que la especificidad se regirá por las diferentes escalas de tiempo asociadas con la unión endocitosis, ligando-receptor /compromiso.Por, y el método de administración de fármacos. Incluso cuando se tiene en cuenta la respuesta lineal simple cerca del equilibrio, se ha encontrado que la magnitud de la tasa de endocitosis coloca la máxima especificidad [3], que apunta a la importancia crítica de la cinética. De hecho, nos encontramos con que tanto la magnitud de la tasa de endocitosis y su dependencia funcional del número de ligandos unidos, que se rige por el mecanismo molecular de la endocitosis, tienen efectos sustanciales sobre la especificidad.
Por otra parte, el equilibrio los estudios basados no pueden hacer frente a los diferentes protocolos de administración de fármacos, ya que estos crean disponibilidades nanotransportador dependientes del tiempo y por lo tanto excluye la existencia de un estado de equilibrio. En cualquier caso, un estado estacionario es prácticamente imposible de conseguir
in vivo
, donde los ciclos biológicos naturales, los mecanismos de homeostasis, y los aspectos prácticos de los reglamentos de drogas de administración todos conspiran contra ella. Exploramos estos temas con un enfoque que examinan los
cinética de complejos nanotransportador-ligando de unión a las células sanas y cancerosas con el fin de identificar estrategias de diseño de fármacos que maximizan dirigidos especificidad. Mostramos que no existen picos en la especificidad como una función tanto de la afinidad y el número de ligandos, lo que implica la existencia de diseños óptimos nanotransportador con un gran número de ligandos de unión muy débilmente individuales con constantes de disociación de ligando-receptor en el rango de mM. Además, demuestran que la especificidad se puede aumentar en varios órdenes de magnitud mediante la explotación de la cinética del sistema a través de receptores que son endocitados lentamente sólo en grupos y /o por una afinación juicioso de la dependencia del tiempo de la administración de fármacos de orientación. Notablemente, la región diseño óptimo del espacio de parámetros muestra poca variación incluso entre significativamente diferentes protocolos de administración de fármacos y mecanismos de endocitosis, que apunta a la existencia de principios de diseño sólidas.
Métodos
Construimos un mínimo modelo cinético para la endocitosis de nanoportadores equipados con
N
ligandos (Fig. 1). Ligandos se unen de forma independiente para desatan y de los receptores individuales con tasas, para las células sanas y, si hay células cancerosas, ¿dónde está el factor por el cual las células cancerosas sobreexpresan los receptores. Los valores de estas tasas dependen de una variedad de factores tales como el tamaño nanotransportador y ligando /receptor de tipo, y pueden estar relacionados con las constantes de la cinética química estándar señalando que y, cuando es la concentración del receptor de efectivo en la proximidad de un solo ligando (File S1) y se supone que hay un gran exceso de receptores móviles. Por lo tanto, ¿dónde está la constante de disociación y es la constante de afinidad ligando-receptor. La independencia de la unión, mientras que asume por simplicidad ligando, es una buena aproximación para muchas interacciones supramoleculares multivalentes [17]. Nanovehículos entran en el sistema con una tasa de entrada, determinado por el
administración de fármacos protocolo
, que es el método por el cual se administra el tratamiento y la cinética de la primera unión de los nanovehículos a la superficie celular. Hemos examinado tres casos: (i) el estado estacionario resultante de un suministro constante de nanovehículos, (ii) el resultado de una dosis única, de alta concentración, y (iii) la entrega pretargeted en la que se introduce primero un complejo de ligando (a) y luego seguido más tarde por el terapéutico activo (a), que se acopla con nanoportadores restantes en el sistema. Para este último protocolo, que mide la especificidad para una determinada
Hora de recogida ventana
, donde se establece mediante escalas de tiempo fisiológicas y se corresponde con el tiempo más allá del cual la endocitosis de los complejos terapéutico-nanotransportador activados es insignificante. Después de unir a una celda, nanoportadores se eliminan del sistema si todos los ligandos desatan (no consideramos nanotransportador "reciclaje") o si están endocitosis. La endocitosis se produce con una tasa, cuya dependencia del número de ligandos unidos que denominamos
endocitosis perfil de.
(A) nanotransportador (oro) con dos de los cuatro ligandos unidos sobre los receptores (verde) . (B) Asignación de un paseo aleatorio 1D con perfiles constantes, sigmoides y lineales dictar las tasas de endocitosis en cada estado de unión del ligando.
Cada nanotransportador puede entonces ser representada por un andador 1D al azar en la discreta intervalo entre una barrera absorbente a 0 y una pared de reflexión a
N
, con una tasa de pérdida de partículas en cada sitio (Fig. 1B). Al tiempo, un andador en la posición
n
representa un nanotransportador con
n
ligandos unidos. Denota la probabilidad de que un nanotransportador tiene
n
ligandos unidos a la hora de
t
como, derivamos las ecuaciones maestras para una nanotransportador unido a una célula sana:
a, (1 ) para, (2) para, (3) para un nanotransportador unido a una célula de cáncer, en las ecuaciones. 1-3 simplemente se sustituye por.
Este sistema de ecuaciones maestro puede ser refundida como la ecuación vectorial (4) en el que el componente del que es y los elementos de la matriz son dictadas por los correspondientes coeficientes en las ecuaciones maestras . Eq. 4, entonces se puede resolver numéricamente, con condiciones iniciales, para determinar los valores propios y los vectores propios para diferentes combinaciones de perfiles de endocitosis, los protocolos de liberación de fármacos, y los valores de,,, y (para la administración de fármacos pretargeted) ventanas de tiempo de recogida. Para cada combinación de protocolo de administración de fármacos y el perfil de la endocitosis se determinó la especificidad, donde y es el número de nanoportadores endocitosis por el cáncer y las células sanas, respectivamente. y se puede calcular como la integral sobre la ventana de tiempo correspondiente de la tasa neta de internalización de drogas,. El factor en la ecuación para normaliza para el aumento del número de receptores en la célula de cáncer. Además de determinar las soluciones numéricas completas para todas las combinaciones, se validó todos los resultados con simulaciones de Monte Carlo utilizando el algoritmo de Gillespie. Por otra parte, se obtuvieron una solución analítica para la combinación de un perfil de endocitosis constante en estado estacionario en el límite que está de acuerdo con nuestros resultados numéricos (Archivo S1).
Resultados
picos especificidad para un número elevado ligandos débilmente unidos de
para investigar el papel de los efectos cinéticos sobre la especificidad, lo primero que examinó el impacto de la variación de los perfiles de endocitosis para un protocolo de distribución del fármaco en estado estacionario fijo. Estamos interesados en cómo la especificidad depende de la siguiente subconjunto de los parámetros de diseño nanotransportador: número ligando y la constante de afinidad del ligando-receptor. Higo. 2A muestra la especificidad para un perfil de endocitosis constante, donde. Hay un rango bien definido de parámetros de diseño óptimos donde la especificidad es sustancialmente mayor que los alrededores. Localmente soluciones óptimas aparecen en una curva continua que van desde pequeños picos por un gran () para grandes picos en grande para.
(A-C) Mapas de superficie de especificidad en el marco del protocolo de administración de fármacos en estado estacionario con una constante (A), lineal (B), y la endocitosis sigmoidal con (C). (D) la especificidad máxima bajo la administración de fármacos en estado estacionario y la endocitosis sigmoidal para varios valores de umbral. En todos los casos, el número total de ligandos es,, y.
En general, los valores razonables de y (Tabla 1), nos encontramos con que los picos de especificidad a nivel mundial para un gran número de ligandos y una disociación tasa del orden de mM (Fig. 2A). Esto se puede entender en términos de los valores relativos de la solo ligando dentro y fuera de las tasas. Si, nanovehículos se unirán a ambos las células sanas y el cáncer, mientras que si nanovehículos se unirán a ninguno de los tipos de células; ambos efectos reducen especificidad. Si, nanovehículos sobre las células sanas siguen siendo más probable que desvincular de unirse a un ligando; Sin embargo, si está cerca de tal manera que, a continuación, nanovehículos en las células cancerosas estarán más probable que se unen de desatar un ligando. Por lo tanto, en este régimen, el ligando de unión selecciona para nanovehículos unidos a las células cancerosas, y el sesgo aumentos deseados como esta población pre-seleccionado se introduce en la siguiente reacción de unión a ligando. Por lo tanto, en promedio nanovehículos pasan más tiempo unido a las células de cáncer en comparación con las células sanas y por lo tanto tienen una mayor probabilidad de ser endocitosis. Por muy grande, nanoportadores prefieren fuertemente a unirse en lugar de desatar un ligando con independencia de si están unidos a las células sanas o cancerosas, dando una muy alta probabilidad de que un proceso de endocitosis nanotransportador forma no específica. Esta probabilidad aumenta con el número de ligandos, que conducen a la disminución de la especificidad y tendiendo a 1 (el límite inferior) en el límite general. La especificidad es idénticamente a la unidad, por lo que a medida que aumenta, la máxima tiende a acercarse, con el carácter discreto de establecer el óptimo en que tiende a infinito, un resultado que se confirmó mediante análisis de nuestros archivos (S1).
a continuación consideramos los efectos de la alteración de la forma funcional del perfil de endocitosis. Figs. 2B y C muestran las especificidades para el perfil lineal endocitosis (5) y el perfil sigmoidal endocitosis (6) en la que es la función de Heaviside paso y es el valor de umbral de, respectivamente. La ubicación del óptimo global no se ve afectada de manera significativa por los cambios en el perfil endocitosis. En el estado estacionario, los valores de especificidad son similares para la endocitosis constante y lineal, el último de los cuales los modelos el escenario en el que cada evento de unión de ligando-receptor desencadena una cascada de señalización independiente que tiene una probabilidad finita de que resulta en la endocitosis. Por el contrario, para la endocitosis sigmoidal, la magnitud de la especificidad óptima se mejora considerablemente. Por esta endocitosis cooperativa que requiere múltiples eventos de unión [18], por lo que la especificidad se mejora debido a la endocitosis se produce sólo con nanoportadores en los estados de unión a ligandos cuyas abundancias relativas mostrar los efectos acumulativos de la selección en cada paso. Para un número total fijo de ligandos, Fig. 2D demuestra que la especificidad aumenta bruscamente en órdenes de magnitud que el valor del umbral,, necesaria para activar aumentos de endocitosis. Este efecto es una consecuencia directa de la especificidad dependiendo de la cinética de unión, unbinding, y la endocitosis. Estos resultados indican que los receptores de orientación que están endocitosis de una manera cooperativa pueden conducir a mejoras significativas en la especificidad.
A continuación examinó el impacto de la variación de los protocolos de administración de fármacos para un perfil de endocitosis fija constante, de nuevo se centra en cómo la especificidad depende de los parámetros de diseño nanotransportador. Figs. 3A, B, y C muestran la especificidad como una función de y para el estado estacionario, de dosis única, y los protocolos de administración de fármacos pretargeted, respectivamente. Sorprendentemente, al igual que en la Fig. 2, se observó un robusto conjunto de soluciones localmente óptimas que aparecen en una curva continua que va desde de a grande para. El hecho de que este régimen óptimo parece ser conservadas a través de diferentes protocolos sugiere que los diseños de la droga genérica óptimos, independiente del protocolo de administración, son posibles. Para el protocolo de administración de fármacos pretargeted para las mismas condiciones, también se puede lograr muy grandes especificidades simplemente a través de una elección adecuada de la ventana de tiempo de recogida: los cambios en un factor de puede dar lugar a órdenes de mejora de magnitud en la especificidad (figura 3D.). También hay que señalar que la especificidad es mucho más sensible a, y sólo débilmente dependiente.
(A-C) Especificidad para un perfil constante endocitosis bajo estado estacionario (A), de dosis única (B), y los protocolos de administración de fármacos pretargeted (C). Para el protocolo de administración de fármacos pretargeted, la ventana de tiempo de recogida es de 200 a 300 segundos. (D) la especificidad máxima bajo el protocolo de administración de fármacos y la endocitosis pretargeted constante para varios valores de. En todos los casos y.
multiplicativo mejora en la especificidad con la combinación óptima de protocolo de administración de fármacos y el perfil de la endocitosis
Nuestros resultados indican que la especificidad puede ser mejorada significativamente mediante la regulación independiente de la droga protocolo de entrega y el perfil de la endocitosis a través de la elección del tipo de receptor diana. Esto sugiere que las combinaciones juiciosas de protocolo de administración de fármacos y el perfil de la endocitosis, junto con los parámetros de diseño apropiados podrían producir nuevos aumentos de especificidad. En la Fig. 4A, se demuestra esta mejora en el caso de la administración de fármacos y la endocitosis pretargeted sigmoidal, para la que encontramos una especificidad máxima de hasta veces el valor de la selectividad se espera del factor de sobreexpresión solo y más de 300 veces la especificidad para la combinación de estacionario entrega estado y la endocitosis constante, que es la más cercana a imitar las condiciones de equilibrio. El efecto parece ser multiplicativo, con sólo una modesta () los incrementos esperados debido a la endocitosis de cooperación (Fig. 2D) o entrega pretargeted (Fig. 3D) por sí sola.
(A) La combinación de protocolo de administración de fármacos pretargeted y la endocitosis sigmoidal exhibe la mayor especificidad de todas las combinaciones examinadas. ,, Umbral a. (B) la especificidad máxima a través de todas las combinaciones. ,, Para la endocitosis sigmoidal, y de 200 a 300 seg para el protocolo de administración de fármacos pretargeted. Las líneas continuas corresponden a y. (C) Los efectos de la sobreexpresión del factor de especificidad a través de protocolos de administración de fármacos para la endocitosis perfil constante en,. La especificidad se eleva bruscamente a. (D) Los efectos de la tasa de endocitosis (normalizado por) a través de protocolos de administración de fármacos para la endocitosis perfil constante en,,.
Si bien la región óptima fue ampliamente consistente a través de protocolos o perfiles de endocitosis cuando uno o el otra se fijó, hemos querido comprobar si ésta seguía siendo cierto para combinaciones arbitrarias. Higo. 4B representa las especificidades máximos para todas las combinaciones de protocolo de administración de fármacos y el perfil de la endocitosis. Hay una clara agrupación de las soluciones óptimas para todas las combinaciones a lo largo de una región que va desde de grande para grande para baja. Si bien hemos explicado el óptimo en general, el óptimo global para el bajo es de gran interés. Como se discutió anteriormente, este régimen debe corresponder aproximadamente a la situación cuando un nanotransportador atado con un ligando a una célula de cáncer es marginalmente más probable que se unen otro ligando. Esto quiere decir o. Con la asíntota a ser grande, se llega a la regla heurística, donde es una constante que depende de,, y. Higo. 4B muestra dos de tales curvas con diferentes valores de comparación.
Dado que las soluciones de diseño óptimas y las especificidades correspondientes dependen de y, demostramos esas dependencias en las Figs. 4C y D a través de protocolos de administración de fármacos para un perfil de endocitosis constante fija. La especificidad aumenta bruscamente por un valor de que es a través de los protocolos más o menos constantes. Puesto que este valor de es establecido por los parámetros de diseño y la elección de receptor (véase S1 del archivo para los detalles), otra estrategia para lograr una alta especificidad es elegir un receptor para el que su factor de sobreexpresión típico es justo por encima de este valor. Esto asegura que cualquier célula cancerosa con constituyan el objetivo de alta especificidad. De hecho, esto también fue identificado como un mecanismo para la super-selectividad en los estudios de equilibrio [16]. Los efectos cinéticos del protocolo de administración de fármacos afectan significativamente la selectividad real cerca, con el protocolo pretargeted tener la mayor mejora de la especificidad. Finalmente, se observó que la especificidad generalmente disminuye con el aumento de velocidad de la endocitosis (Fig. 4D), lo que indica que los receptores que están siendo reciclados más lentamente son potencialmente mejores objetivos. Esta dependencia en particular también podría surgir en un contexto muy diferente: la creación acelerada de los gradientes de morfogenes en presencia de la degradación, lo que puede ser descrito por las ecuaciones similares [19]
Discusión
En conclusión. , hemos demostrado que los picos de especificidad se producen como una función tanto de la afinidad y el número de ligandos, lo que implica la existencia de diseños óptimos nanotransportador. En general, los complejos con ligando individual en el rango de mM () y un gran número de ligandos por portadora tienen características de diseño que producen una alta especificidad en nuestras simulaciones. Esta región óptima del espacio de parámetros de diseño es robusto a través de protocolos de administración de fármacos y mecanismos de endocitosis. La magnitud máxima especificidad precisa y la nitidez se pueden personalizar a través de la cuidadosa selección de los parámetros o las estrategias de administración. Las posibles estrategias para aumentar la especificidad de segmentación incluyen receptores que desencadenan la endocitosis sólo si atado en los grupos y /o tienen una baja tasa de endocitosis en general, y la utilización de la administración de fármacos pretargeted con largos tiempos de espera.
Debe tenerse en cuenta que el aumento de especificidad viene a costa de que tiene un número total menor de nanovehículos endocitosis. Mientras que supone que la dosis se puede aumentar según sea necesario, en la práctica clínica puede haber otros factores tales como la capacidad del riñón para eliminar el medicamento del cuerpo que pueda limitar la capacidad de maximizar la especificidad. Con el fin de abordar los principios y estrategias generales de diseño, sino que también optó por ignorar una serie de otras características específicas del sistema, incluyendo la posibilidad de que depende del tiempo, las interacciones entre ligandos, y los detalles de la geometría compleja nanotransportador (véase S1 del archivo para más detalles).
en general, nuestro trabajo de complementos de estudios de equilibrio, tales como [16], por lo que demuestra que es posible diseñar complejos de muy alta especificidad para condiciones de no equilibrio. Una ventaja específica de nuestro enfoque de la utilización de baja afinidad nanovehículos multivalentes es que reduce la necesidad de ligandos de alta especificidad, que son generalmente de alto peso molecular (tales como fragmentos de anticuerpo) y pueden conducir a fármacos que tienen una pobre biodisponibilidad [20] . Es de señalar que nuestro trabajo no se centra en un único sistema biológico sino que se dirige a toda una clase de problemas biológicos, químicos y de bioingeniería. Al centrarse únicamente en cantidades físicas y no la sustancia química específica, biológicas y las características clínicas de cada sistema es posible, hemos derivado principios de diseño generales, generales y globales. Nuestros resultados pueden, por tanto, potencialmente pueden aplicar a procesos que comercian fuera de unos pocos sitios de reconocimiento altamente específicos frente a un mayor número de sitios menos específicos; por ejemplo, para diseñar una columna de manera óptima los productos químicos separados o para diseñar secuencias de ADN con un número excesivamente de ciertos motivos. Es también interesante observar que las reacciones de unión ligando-receptor sucesivos establecieron un proceso de paso de reacción múltiple similar a la corrección cinética [21] que aumenta bruscamente la relativamente baja sesgo hacia la unión libre de las células cancerosas. Por lo tanto, como el número de pasos aumenta, la especificidad puede llegar a ser muy alta. Sin embargo, al contrario que en la corrección de pruebas cinética, la energía se gasta no al sesgo de cada etapa de reacción, con el coste que resulta ser la reducción general de la probabilidad nanotransportador endocitosis. Por último, dada la ubicuidad de baja afinidad interacciones multivalentes y el medio ambiente inherentemente no-equilibrio en biología, es posible que la naturaleza ya explota el mecanismo que hemos discutido conseguir una notable mejora en la especificidad por encima de los límites dictados por el equilibrio.
Apoyo a la Información del archivo
S1.
Contiene información de apoyo en supuestos en nuestro modelo con respecto a la disponibilidad del receptor y la interdependencia ligando, dependencias de tasa, las definiciones de y, y una solución analítica de las ecuaciones maestros y la determinación de la especificidad para el caso de estado estacionario con perfil endocitosis constante. Figura S1, Diagrama de superficie de especificidad en función de y, que muestra una cresta que se extiende hacia valores grandes de (fuera de la página). Para fijo y grande, la especificidad como una función del tiene un pico a. Aquí y . Figura S2, el valor del factor de Crossover sobreexpresión como una función de afinidad, y el número de ligandos, (recuadro). para ambas parcelas, para la trama principal y para la inserción. En general, tiende a seguir cualitativamente el comportamiento de la especificidad para los mismos valores de los parámetros
doi:. 10.1371 /journal.pone.0065623.s001
(PDF)