Extracto
Las mutaciones somáticas juegan un papel importante en la iniciación y progresión del tumor. El estado de la mutación de un tumor puede predecir el pronóstico y guiar a las terapias dirigidas. La mayoría de las técnicas para el estudio de mutaciones oncogénicas requieren alta calidad y DNA cantidad o son analíticamente desafiante. el análisis de mutación basado espectrometría de masas sin embargo, es un método relativamente simple y de alto rendimiento adecuado para el material fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE) tumor. paneles gen diana usando esta técnica se han desarrollado para varios tipos de cáncer. Estos paneles de punto de acceso actuales contra el cáncer no se centran en los genes que son más relevantes en los cánceres ginecológicos. En este estudio, se presenta el diseño y validación de un panel basado en la novela, la espectrometría de masa específicamente para neoplasias ginecológicas y presentamos las frecuencias de mutaciones detectadas. Utilizando los datos de frecuencia del Catálogo en línea de mutaciones somáticas en el Cáncer, se seleccionaron 171 mutaciones hotspot somáticas en los 13 genes más importantes para los cánceres ginecológicos, siendo
BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS , las ANR, PIK3CA, PPP2R1A
y
PTEN
. Un total de 546 tumores de cuello uterino (205, 227 endometrio, ovario 89, y 25 carcinomas vulvares) se utilizaron para probar y validar nuestro panel, y para estudiar la prevalencia y el espectro de mutaciones somáticas en estos tipos de cáncer. Los resultados fueron validados por el análisis de muestras duplicadas y por qPCR específica de alelo. El panel se presenta aquí usando espectrometría de masas muestra que ser reproducibles y de alto rendimiento, y es muy útil en el material FFPE de baja calidad y cantidad. Se ofrece nuevas posibilidades para el estudio de un gran número de muestras de tumores ginecológicos en la práctica diaria, y podría ser útil en la selección de la terapia guiada
Visto:. Spaans VM, Trietsch MD, Crobach S, Stelloo E, D Kremer, Osse EM , et al. (2014) Diseño de un Grupo de Alto Rendimiento La mutación somática de perfiles Específicamente para los cánceres ginecológicos. PLoS ONE 9 (3): e93451. doi: 10.1371 /journal.pone.0093451
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, España |
Recibido: 18 de diciembre de 2013; Aceptado: March 4, 2014; Publicado: 26 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Spaans et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Susanne Müller trabaja como científico de Sequenom, Hamburgo Alemania. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
genomas del cáncer llevan mutaciones somáticas, y el espectro de mutaciones varía según el tipo de tumor y subtipo [1] , [2]. La evaluación de una amplia gama de mutaciones de genes clave del cáncer a través de diversos tipos de cáncer tiene el potencial para la identificación de mutaciones clínicamente relevantes. Los estudios de melanoma, de pulmón, colorrectal, y carcinomas de mama han demostrado que el estado de la mutación somática se puede utilizar para predecir el pronóstico y guiar las estrategias de tratamiento específicas de tumor [3] - [6]. tumores malignos ginecológicos representan el 15-20% de todos los nuevos casos de cáncer en las mujeres en todo el mundo, y los números siguen aumentando [7], pero la carcinogénesis de los tumores malignos ginecológicos es diversa y el papel de las mutaciones somáticas aún no está completamente aclarada [1].
Durante la última década, las mutaciones somáticas y su papel en la terapia dirigida se han estudiado en tumores malignos ginecológicos, pero aún no en la misma medida que en otros tipos de cáncer como el de mama y el cáncer de colon. La mutación de perfiles de tumores malignos ginecológicos pueden identificar nuevos objetivos farmacológicos y ayudar a predecir el pronóstico del paciente y la respuesta del tumor al tratamiento. La investigación ha revelado cambios genéticos superpuestas, así vías de señalización afectada similares en los diferentes tipos de tumores ginecológicos [8] - [14]
Al estudiar un gran número de materiales de pacientes, nos enfrentamos a dos tipos de problemas:. Aplicabilidad técnica y especificidad tumor. Hoy en día, sólo un número limitado de genes se criba en la práctica clínica. Se espera que este número se incrementará considerablemente en el futuro próximo. Por lo tanto, se requiere un método rápido y fiable para detectar mutaciones. Esta técnica debe ser adecuado para el ADN extraído a partir de tejido de formalina parafina fijo incorporado (FFPE), que es a menudo de baja calidad, o de pequeñas biopsias de tejido, que es de baja cantidad. Asistida por matriz de desorción por láser /ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF) ha demostrado cumplir con todos estos criterios [15] - [17].
En cuanto a la especificidad del tumor, en la actualidad, varios paneles de oncogenes basado en diferentes técnicas son (comercialmente) disponibles. Estos paneles han sido utilizados con éxito en el estudio de grandes cantidades de muestras tumorales, con el fin de dibujar los paisajes de mutaciones somáticas que caracterizan los tipos de tumores [18] - [22]. Una selección de genes y las mutaciones relevantes para los subtipos de tumores ha llevado con éxito para el diseño de paneles específicos del tumor [15], [16], [23]. Hasta el momento, no hay paneles disponibles que están diseñados específicamente para apuntar tumores ginecológicos. Por lo tanto, el objetivo fue desarrollar un panel de mutación de alto rendimiento especificado para neoplasias ginecológicas.
Un meta-análisis de los cósmicos (Catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer) de base de datos en línea [24], se llevó a cabo para diseñar un MALDI basado -TOF-, el panel de la mutación de alto rendimiento que cubre las mutaciones somáticas en 13 genes que se reportan con mayor frecuencia para participar en tumores malignos ginecológicos. Hemos probado y validado este panel en un conjunto de 546 de cuello de útero, endometrio, ovario y muestras de carcinoma de vulva. A continuación, se presenta el diseño de un panel específico del cáncer ginecológico y de las frecuencias de mutaciones somáticas identificadas usarlo.
Materiales y Métodos
Se utilizaron todas las muestras de tejidos humanos en este estudio de acuerdo con el médico directrices éticas que se describen en el Código de uso secundario apropiado de Tejidos Humanos establecida por la Federación holandesa de Ciencias médicas (www.federa.org, una traducción al Inglés del Código se pueden encontrar here:
http://www.federa.org/sites/default/files/digital_version_first_part_code_of_conduct_in_uk_2011_12092012.pdf).
Patients recibir información sobre el uso secundario de tejido que se toman muestras para diagnóstico. Ellos pueden oponerse activamente al uso secundario. De acuerdo con estas directrices, todo el material humano utilizado en este estudio se ha anónima. Debido a este procedimiento de forma anónima, la investigación retrospectiva no requiere no es necesaria la aprobación ética de la Junta de Revisión Institucional y el permiso de los pacientes individuales.
diseño del panel
en primer lugar, PubMed y cósmico [24] búsquedas se realizaron para seleccionar los genes y mutaciones para su inclusión en el panel de mutación-ginecológica específico. la selección se basa en si una mutación se ha encontrado repetidamente para ser mutado en tumores malignos ginecológicos. en segundo lugar, con el fin de cubrir un alto porcentaje de las variantes reportados por gen, se seleccionaron las mutaciones más frecuentes para obtener un ginecológica justo cobertura -tissue específica, ya que sólo las mutaciones de punto de acceso eran apropiados para el análisis con la técnica MALDI-TOF. el objetivo de seleccionar los genes en los que por lo menos uno de los tipos de cáncer ginecológico estudiadas (por ejemplo, vulva, cuello uterino, endometrio u ovario), al menos el 30% de todas las mutaciones reportadas ocurrieron en menos de 10 sitios diferentes en el gen
El establecimiento de un "punto caliente" del panel de genes específicos ginecológica -. GynCarta 1.0
Consulting bases de datos PubMed y COSMICAS mostraron claramente una superposición en los diez primeros genes mutados en el cuello uterino, endometrio y cáncer de ovario. Son pocos los estudios de mutaciones somáticas se han realizado sobre el cáncer vulvar y, por tanto, para este tipo de tumor que se basó en las frecuencias que se encuentran en los tipos de tumores similares (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de la piel en otros sitios, y el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello). Se seleccionaron los genes más frecuentemente mutado que cumplieron con los criterios de inclusión para el panel. El primer panel designamos 'GynCarta 1.0' (Sequenom, Hamburgo, Alemania) consistió en 89 ensayos (12 multiplexa) para detectar 154 mutaciones en 12 genes que cumplieron con los criterios de inclusión:
BRAF, CDKN2A, CTNNB1, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FOXL2, HRAS, KRAS, las ANR, PIK3CA
, y
PTEN
.
diseño ensayo
MySequenom.com línea se utilizaron herramientas de diseño para diseñar el ensayo ensayos de detección de mutación somática. Se aplicó un nivel máximo de 12 ensayos múltiplex por pocillo. Si es posible, los picos de extensión alelo mutante fueron diseñados como primera detectado picos de los alelos y los picos de extensión de tipo salvaje como el último detectaron picos de alelos para reducir el peligro de falsos positivos de aductos de sal. Todos los ensayos fueron validados en el ADN de tipo salvaje, controles negativos y se seleccionaron muestras conocidas positivas de mutación.
Mutación de detección
Detección de mutaciones se realizó en el Centro Médico de la Universidad de Leiden siguiendo el protocolo del fabricante (Sequenom, Hamburgo , Alemania) como se describe anteriormente [29]. En pocas palabras, de tipo salvaje y mutante de ADN se amplificó por PCR multiplex. tratamiento con fosfatasa alcalina de camarón nucleótidos sobrantes inactivadas. Una reacción de extensión del cebador (IPLEX Pro) se realizó con nucleótidos terminadores en masa modificada, y el producto fue descubierta en una SpectroCHIP (Sequenom, Hamburgo, Alemania). alelos mutantes y silvestres tipo eran discriminadas a continuación utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas.
Análisis de los datos
Los datos se analizaron con el software MassARRAY Typer Analyser (TYPER 4.0.22, Sequenom, Hamburgo, Alemania). Las mutaciones se detectaron por un umbral mínimo 5% del pico del alelo mutante. Tres investigadores cegados a la identificación del tumor revisados manualmente la salida, y se llegó a una determinación consenso. Los análisis estadísticos se realizaron con las estadísticas de IBM SPSS versión 20.0 Editor de datos. Los estudiantes independientes
t-test
se utilizó para comparar las variables de referencia, y se utilizó la prueba exacta de Fisher para analizar los datos numéricos y categóricos distribuidas normalmente.
P-valores
≤0.05, correspondientes a los intervalos de confianza del 95%, se consideraron estadísticamente significativos. Todas las pruebas fueron de dos colas.
Muestras
En primer lugar, se utilizó un conjunto de entrenamiento de 51 muestras FFPE (26 cervicales, 17 de endometrio, ovario y 6 2 muestras de cáncer de vulva) para probar la eficacia del panel diseñado. Después de los ajustes técnicos y mejoras menores del panel, se amplió el número de pacientes para cada tipo de tejido.
En total, el ADN de 548 muestras de tumores de cuello uterino (
N =
209), de endometrio (
N =
227), de ovario (
N =
89) pacientes con carcinoma, y la vulva (
N = 25)
se aisló. Dos muestras de cáncer de cuello uterino fallaron para todos los ensayos de espectrometría de masas y fueron excluidos de análisis adicionales. Se recogieron los siguientes parámetros de línea de base: la edad, la FIGO (Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia) etapa, el diagnóstico histopatológico, el grado del tumor en su caso, y el virus del papiloma humano (VPH) positividad y el tipo de casos de tumores de cuello uterino y de vulva (Tabla 1)
aislamiento de ADN
ADN fue aislado de los bloques de tejido FFPE para 505 muestras, y a partir de tejido fresco congelado (FF) para 43 carcinomas de ovario. De tres a cinco de 0,6 mm de diámetro núcleos de tejido de longitud variable se tomaron de las FFPE bloques de un área seleccionada que comprende células tumorales ~ 70%. En 34 muestras, las células tumorales fueron distribuidos de forma difusa, y por lo tanto micro-disección se realizó en 10 secciones de 10 micras de hematoxilina-teñido para obtener un alto porcentaje de células tumorales. De aislamiento del ADN se realizó como se ha descrito anteriormente [25] seguido de purificación de ADN (Tissue Kit NucleoSpin®, Machery-Nagel, Alemania) o se realizó totalmente automatizado utilizando el tejido del sistema Preparación (Siemens Healthcare Diagnostics, Nueva York, EE.UU.) [28].
calidad del ADN
ADN de todas las muestras fue aislado y probado para la calidad; 493 (90%) obtuvieron muestras ≥1 para la calidad del ADN mediante PCR, y esto se consideró suficiente. Dos muestras, tanto de los carcinomas cervicales con una puntuación de calidad del ADN de 0, fracasaron en todos los ensayos, dando una tasa de éxito del 99,99%. Ambas muestras fueron excluidos de los nuevos análisis. En general, las muestras con ADN de baja calidad eran más propensos a fallar en algunos ensayos, pero 27 de las 48 muestras (56%) con puntuaciones de calidad del ADN de 0 se analizaron con éxito en todos los ensayos, y 40 de 48 (83%) baja muestras de calidad se analizaron con éxito en más de 90% de los ensayos. El porcentaje de muestras analizadas con éxito no difirió significativamente entre FFPE muestras congeladas y frescas. Esto confirma que el método de detección de mutaciones MALDI-TOF es muy adecuado para el análisis de ADN de menor calidad, extrajo-FFPE.
Validación
En total, 546 muestras tumorales fueron incluidos en este estudio. Para evaluar la reproducibilidad del ensayo, 57 (10%) muestras se ensayaron por duplicado y otro 26 (5%) por triplicado. De las mutaciones detectadas inicialmente en estas muestras, 95% (40/42) se confirmó por duplicado y 97% (30/31) se confirmó por triplicado. Sin plantilla (
N
= 4) y el ADN de leucocitos de tipo salvaje (
N
= 2) controles se incluyeron en cada múltiplex para obtener espectros negativo y salvaje tipo MALDI-TOF. Por otra parte, para un random30% (163 muestras),
KRAS
y
PIK3CA
mutaciones fueron validados mediante qPCR específica de alelo tal como se describe anteriormente [26] en 7 variantes de mutación de
KRAS
(p.G12C, p.G12R, p.G12S, p.G12V, p.G12A, p.G12D, p.G13D) y 3 variantes de mutación de
PIK3CA gratis (p.E542K, p. E545K, p.H1047R), y una tasa de concordancia de 99,4% se alcanzó. (Figura 1) El panel GynCarta detecta más mutaciones que alelo específico qPCR hizo. Esto podría explicarse por el hecho de que la espectrometría de masas es capaz de detectar alelos mutantes con una frecuencia más baja (por debajo de 5%) que la PCR específica de alelo es (hasta 20%). El hecho de que no hemos encontrado ninguna mutación en el ADN de control de tipo salvaje, o en cualquiera de los H
2O controles negativos fortalece nuestra creencia de que estas mutaciones adicionales son verdaderas mutaciones en lugar de los falsos positivos.
La concordancia entre MALDI-TOF genotipado mutación (GynCarta, Sequenom, Hamburgo, Alemania) y el alelo-específicas para qPCR 3
PIK3CA Opiniones y 7
KRAS
mutaciones se determinó para 164 (30% del total cohorte de 546 carcinomas) muestras para validar los resultados. La concordancia se calculó para todos los partidos de tipo salvaje-wild type (1546 en total) y todos los partidos de la mutación de mutación (45 en total) en todas las reacciones (164 * 10, 1640 en total). reacciones fallidas fueron excluidos porque la comparación no era posible (4 * 3
PIK3CA Opiniones y 4 * 7
KRAS
; 40 en total). Esto condujo a una concordancia de (1546 + 45) /(1640-1640) = 0.994. WT = tipo salvaje; MUT = mutante.
Mejorar el panel y la creación de GynCarta 2.0
Con los primeros datos de mutaciones de GynCarta 1.0 y reportes de la literatura de nuevas mutaciones oncogénicas, hemos sido capaces de mejorar la GynCarta 1.0 Panel mediante la eliminación de los ensayos de mutaciones que no fueron detectados (
D108Y CDKN2A
, D108XA, Y108XC;
FGFR3
Y373C, A391E, K650Q, K650E, K650T, K650M, S371C;
G13S y
ANR
G13V, G13A, G13D, G13C, G13R, G13S) y mediante la adición de 10 nuevas mutaciones de punto de acceso de los genes ya incluidos. De esta manera, la cobertura de los
FGFR2
y
PIK3CA
se incrementó del 59% al 71% y del 72% al 76%, respectivamente. Por otra parte, los ensayos que habían mostrado ser difícil de interpretar debido a los pequeños picos de artefactos fueron mejoradas. Durante el período de prueba y validación,
PPP2R1A
, un nuevo gen de interés, habían surgido de la literatura [27] - [29]. Nueve mutaciones de este gen también se añaden al panel, creando así 'GynCarta versión 2.0'. Un resumen completo de las mutaciones incluidas en el panel de 2.0 mutación GynCarta se da en la tabla 2, con los ensayos de agregados que figuran en negrita. Se organizaron los ensayos para GynCarta 2.0 de tal manera, que un total de 13 multiplexa podría ser utilizado para analizar el panel completo, la concentración de los nuevos ensayos en 4 multicines. Estos 4 multicines se utilizaron para analizar las 497 muestras del conjunto de confirmación.
Resultados
Las mutaciones identificadas usando GynCarta 1.0 y 2.0
genotipado de mutaciones mediante GynCarta 1.0 revelaron 395 mutaciones en 273 muestras (50%). Las mayoría de las mutaciones se detectaron en los carcinomas endometriales (177 muestras (64%)), seguido de los carcinomas de ovario (33 muestras (37%)), carcinomas de cuello uterino (67 muestras (33%)), y carcinomas de vulva (5 muestras (20% )).
PIK3CA
fue mutado con mayor frecuencia (122 muestras), seguido por
PTEN gratis (97 muestras) y
KRAS gratis (64 muestras). No se encontraron mutaciones en
BRAF
y
FOXL2
genotipado de mutaciones mediante GynCarta 2.0 detecta un adicionales 36: mutaciones. 4 en
FGFR2 Opiniones y 5 de
PIK3CA
.
No se detectaron mutaciones PPP2R1A
en 27 muestras (7 cervicales, 18 de endometrio, ovario y 2 0 muestras vulvares).
Desde el panel versión 1.0 y 2.0 tuvieron algunos ensayos superpuestos, hemos sido capaces de comparar los resultados de ambos paneles. No se detectó ninguna llamada mutación discrepantes, pero hemos sido capaces de analizar los ensayos que eran difíciles de interpretar en GynCarta 1.0 debido a que estos ensayos habían mejorado en GynCarta 2.0. También obtuvimos salida exitosa para 3 muestras que habían fracasado en GynCarta 1.0. Las frecuencias de mutación para cada locus se resumen en la tabla 3. La mutación del espectro se visualiza en la figura 2.
El espectro de frecuencias y de las mutaciones identificadas mediante MALDI-TOF en 546 carcinomas ginecológicos. La mutación del espectro se muestra (de arriba a abajo) de cuello de útero (
N
= 205), de endometrio (
N
= 227), de ovario (
N
= 89) y carcinomas vulvares (
N
= 25). De izquierda a derecha,
N
es el número de muestras con la mutación, "%" es el porcentaje de muestras mutadas dentro de la cohorte, y las barras representan gráficamente los porcentajes de: azul, 4 mutaciones por muestra (
N
= 6); rojas, 3 mutaciones por muestra (
N =
29); verdes, 2 mutaciones por muestra (
N =
65); y amarillo, 1 mutación por muestra (
N =
189).
Las frecuencias de mutación detectados fueron comparados con los números pronosticados de mutaciones en base a las frecuencias descritas en el COSMIC base de datos [23] y corregido por la cobertura del panel (Tabla 4).
PIK3CA
mutaciones se detectaron dos veces más frecuentemente como se predijo en el cáncer de cuello de útero (
N = 23
predijo y
N = 51
detectados) y en el cáncer de endometrio (
N
= 32 predijo y
N = 71
detectado).
PTEN
mutaciones también se detectaron con mayor frecuencia en el cáncer de endometrio que lo predicho (
N = 35
predijo y
N = 104
detectado). Sin embargo, hay
PTEN
se detectaron mutaciones en el cáncer de vulva, aunque
N = 8
mutaciones se predijo [19].
Además, hay
BRAF
o
se detectaron mutaciones FOXL2
en esta cohorte, a pesar de la alta cobertura de ambos genes por el panel. Esto podría explicarse por el hecho de que
FOXL2
está fuertemente asociada con tumores de células de la granulosa del ovario [30], un subtipo de cáncer de ovario que fue excluido de nuestro estudio de cohortes.
GynCarta 2.0 se puede utilizar en la diferenciación de tipos de tumores
una ilustración visual que resume las frecuencias de mutación en los diferentes tipos de tumores se representan en la Figura 2. Como se muestra en la figura 2, tumores ginecológicos muestran una considerable superposición en mutaciones somáticas, aunque los perfiles específicos de tejido también se puede apreciar.
los cánceres de endometrio tienen la frecuencia más alta de mutación, con un 78% de las muestras que presenten al menos una mutación. Como se predijo, los genes mutados con más frecuencia en los cánceres ginecológicos son genes de la vía de pAKT /mTOR, pero dentro de esta vía, las frecuencias de mutación varían entre tipos de tumores. Para el cáncer de ovario,
KRAS
es el gen más frecuentemente mutado (18%), mientras que
PIK3CA
se ve afectado principalmente en el cáncer cervical (24%) y
Hoteles en PTEN endometrio cáncer (39%). Aunque el número de carcinomas vulvares incluidos son pequeñas, cáncer vulvar parece tener un espectro mutacional diferente en comparación con otros tumores malignos ginecológicos con
CDKN2A
(12%) y
HRAS
(8%) más menudo afectada.
Una diferencia interesante puede observarse al comparar
PIK3CA
distribución entre los cánceres de cuello uterino y los otros tipos de tumores. En endometrio (y ovárico),
PIK3CA
mutaciones se encuentran con más frecuencia en puntos calientes localizados en el exón 9 y el exón 20, con una distribución uniforme entre estos exones (33% y 45%). En el cáncer cervical, sin embargo, las mutaciones se producen casi exclusivamente en loci en el exón 9 (47 de 50 (94%)
PIK3CA
mutaciones). Esta diferencia clara (
p Hotel & lt; 0,0001) se puede utilizar en la práctica clínica, la hora de diferenciar el cáncer cervical primario del cáncer de endometrio primario
Discusión
La demanda de cáncer individualizado. terapia ha aumentado en los últimos años. Las nuevas técnicas de genotipado permiten que los tumores que se caracterizan en función de sus perfiles genómicos, que permita establecer nuevos objetivos para el tratamiento específico de tumor, permitió comprender mejor la respuesta del tumor a la quimioterapia y la radioterapias, y ayudaron a predecir el resultado del paciente [3] - [6], [ ,,,0],9], [12], [14]. tumores malignos ginecológicos representan el 15-20% de todos los cánceres en las mujeres en todo el mundo [7]. Las consecuencias clínicas de las mutaciones somáticas en diversos tumores malignos ginecológicos aún no se entienden completamente. En el presente estudio, hemos diseñado un panel que es altamente específico para una amplia gama de cánceres ginecológicos, que investigó la mutación del espectro específico de tumor de 162 mutaciones de 13 genes. El uso de este panel, se encontró que en esta serie de mutaciones somáticas estaban presentes en el 36% de todos los carcinomas cervicales, en el 78% de los carcinomas de endometrio, en el 37% de los carcinomas de ovario y en el 20% de los carcinomas vulvares.
somática espectros de mutación fueron investigados previamente en los cánceres ginecológicos también el uso de MALDI-TOF [17], [18], [22], [31] - [33]. Sin embargo, la mayoría de esos estudios paneles de genes del cáncer genéricas basadas en las frecuencias correspondientes, en todos los tumores sólidos o utilizados paneles pre-existentes que fueron diseñados para la oncología general [17], que se utiliza [22], [31] - [33]. Estos paneles pre-existentes, disponibles en el mercado no se ajustan para el campo de la oncología ginecológica, con la desventaja de que contiene los genes que no están involucrados en los cánceres ginecológicos, tales como
FLT3
y
KIT
, o omitiendo los genes que han demostrado estar involucrados relativamente frecuente en el cáncer ginecológico, como
PIK3CA
. Por lo tanto, hemos creado un panel de mutación basado en MALDI-TOF diseñado específicamente para detectar una amplia gama de las mutaciones de punto de acceso más comunes que se han reportado en varios tipos de tumores ginecológicos. paneles de mutación similares han sido diseñados específicamente para los melanomas, carcinomas de colon y cáncer de pulmón de células no pequeñas [15], [16], [20]. Mediante el uso de un panel específico ginecológica, estudiamos sólo las mutaciones relevantes, incluyendo, por ejemplo,
PIK3CA
y
PPP2R1A Windows que no están incorporados en los paneles generales, tales como el OncoCarta (Sequenom, Hamburgo, Alemania) y con una cobertura mejor y más específica (por ejemplo,
CTNNB1
). Como resultado, las frecuencias reportadas de gen-participación pueden diferir sustancialmente. Por ejemplo, en nuestra serie de cáncer de endometrio, un
se detectó KRAS
tasa de mutación del 17%. Esto está en contraste con el estudio de Cote et al [32] que, utilizando un panel de onco-genérica, informa de un
KRAS
tasa de mutación de sólo el 1% en el cáncer de endometrio. De otros estudios que utilizan diferentes técnicas, se sabe que
KRAS
está mutado en el 15-20% de todos los cánceres de endometrio [18], [34]. Este ejemplo muestra que la fiabilidad de los estudios que utilizan un enfoque de MALDI-TOF se ve seriamente influenciada por la elección y el grado de cobertura de los genes incorporados en el panel
.
cobertura satisfactoria de los genes en nuestro panel se logró para las mutaciones que hemos estudiado, y los espectros de la mutación generada en este estudio son, pues, una representación fiable de las frecuencias de mutación en los tumores malignos ginecológicos en los genes que se han seleccionado para este panel. Sin embargo, algunos genes relevantes, tales como
TP53
y
ARID1A
, [8], [13], [34] - [39] no se incluyeron en nuestro panel, ya que no lo hicieron cumplir con el criterio de un "gen de punto de acceso". Ambos genes tienen mutaciones dispersas ampliamente en todo el gen y por lo tanto no eran adecuados para un enfoque de MALDI-TOF. Hay algunos loci en
TP53
y
ARID1A Windows que están mutados con mayor frecuencia; sin embargo, estos no cubren más del 20% de todos sus mutaciones conocidas. Incluyendo algunos de estos loci en nuestro panel sería subestimar la verdadera frecuencia de mutación de estos genes en cánceres ginecológicos. Sus frecuencias de mutación se podrían estudiar mejor el uso de otros métodos de detección, como la secuenciación de Sanger o de próxima generación de secuenciación (NGS).
Nos hicieron decidir incluir 22 ensayos para el gen supresor de tumores
PTEN
, resultando en una cobertura de 40%, lo que podría ser considerado subóptima utilizando este enfoque. La frecuencia de las mutaciones informó aquí es por lo tanto probablemente subestima la verdadera frecuencia de mutación somática de
PTEN
. Además, la pérdida de PTEN también puede ser causado por otras alteraciones moleculares, tales como LOH y la hipermetilación del promotor [40]. Por lo tanto, se aconseja el uso adicional de otras técnicas como la inmunohistoquímica para evaluar el verdadero estado de PTEN.
CDKN2A
no es realmente un gen mutado punto de acceso también, pero esta en el panel debido a su alta relevancia predicho en el cáncer de vulva, porque esperábamos que para obtener una cobertura justa del gen. Los tumores incluidos en la base de datos COSMIC muestran con frecuencia la pérdida completa de, o grandes deleciones en el
CDKN2A
gen, un tipo de mutación que no es fácilmente detectable por MALDI-TOF espectrometría de masas. Sin embargo, dado
son reportados CDKN2A
mutaciones en el carcinoma de células escamosas de la piel a ser más a menudo que las mutaciones puntuales (grandes deleciones), creemos que la adición de
mutaciones puntuales del gen CDKN2A
al panel puede dar información valiosa, especialmente para el cáncer de vulva. Aunque los números son muy bajos, los resultados de la investigación sobre
CDKN2A
imutations en la vulva y carcinoma de células escamosas de pene refuerzan esta hipótesis [41].
FBXW7
parece tener una baja la cobertura por el panel, pero esto se ve influida por el hecho de que se ha investigado y se encuentra mutado en un número relativamente pequeño de tumores ginecológicos. Cuando se considera la gran cantidad de datos disponibles de la investigación en cáncer de colon, la cobertura esperada es de aproximadamente 35%.
Las nuevas tecnologías tales como la secuenciación de próxima generación son capaces de detectar las mutaciones en múltiples genes sin selección previa y por lo tanto pueden superar la limitaciones de un enfoque de espectrometría de masas. Con NGS, genes completos de interés pueden ser analizados y se encuentran por lo tanto todas las mutaciones. Sin embargo, el análisis bioinformático de los datos producidos por NGS puede ser un reto y se encuentra todavía en desarrollo. Además, la diferenciación entre las variantes somáticas no patógenas y mutaciones patógenas puede ser lento y complejo [42]. En comparación, el análisis de datos de MALDI-TOF es mucho más sencillo, en particular en el análisis de mutaciones con relevancia clínica conocida. El panel que aquí presentamos cubre las mutaciones más frecuentes en los cánceres ginecológicos, con algunas excepciones. Los espectros de la mutación que hemos detectado son comparables a los espectros reportado en NGS y estudios de secuenciación del exoma que se centran en los cánceres ginecológicos [8], [43], [44]. Por lo tanto, MALDI-TOF espectrometría de masas tiene potencial para su uso en un entorno clínico, para detectar el estado mutacional de los genes correspondientes de una manera rápida y fiable. Otra clara ventaja del análisis de la mutación basada espectrometría de masas es la flexibilidad de añadir y borrar los ensayos de un panel, como también se muestra en este informe, por lo que nuevos conocimientos o demandas clínicas se pueden adoptar con facilidad.
El paisaje de mutación somática cánceres ginecológicos producidos por este estudio (figura 2) y por las bibliotecas de mutación disponibles públicamente muestran perfiles de mutación se superponen y distinguir entre tumores ginecológicos. Las mutaciones en el /Akt-vía PI3K son frecuentes y se superponen, sin embargo se identificaron algunas mutaciones que distinguen. Un ejemplo es el descubrimiento de que
PIK3CA
exón 20 mutaciones sólo en raras ocasiones se producen en el cáncer de cuello de útero, mientras que son un hallazgo frecuente en los cánceres endometriales. Este hallazgo puede ser de valor en un entorno clínico, cuando hay incertidumbre sobre el origen primario tumores, sobre todo en los adenocarcinomas de cuello uterino que son VPH negativo y se encuentra en el segmento uterino inferior del útero. Se ilustra que la información mutacional somática puede ser útil para la clasificación de tumores [45].
Somatic perfiles de mutación también puede revelar nuevos conocimientos sobre los tipos de tumores que no están bien caracterizadas, sin embargo, como el cáncer vulvar. El cáncer vulvar es una enfermedad poco común que puede surgir a través de un HPV-dependiente o una vía independiente de VPH. La carcinogénesis de los carcinomas vulvares VPH-independiente es en gran parte desconocida. En el presente estudio, 25 carcinomas vulvares (de los cuales 19 tumores VPH-negativas) se analizaron, y uno
PIK3CA
, 3
CDKN2A
, y 2
HRAS
mutaciones eran detectado en los carcinomas de VPH-negativas. No se detectaron mutaciones en cualquiera de los 13 genes investigados en los 6 tumores VPH-positivo. El espectro de mutación de cáncer vulvar parece diferente del espectro de otros cánceres ginecológicos, pero muestra similitudes con el espectro de mutación de células escamosas carcinoma de la cabeza y el cuello [46], un tipo de tumor que comparte características morfológicas y etiológicos con carcinoma epidermoide vulvar . El hecho de que el cáncer de vulva no se plantea en Mullarian originó estructuras, como los otros tres tipos de tumores en este estudio hacen, también podría ser una explicación para las diferencias en el espectro que nos hemos detectado. Los resultados de nuestro estudio pronta investigación más a fondo de las funciones de
HRAS
y
CDKN2A
en el cáncer de vulva.
En conclusión, hemos diseñado, validado y utilizado un novedoso espectrometría de masas panel de mutación basado en la identificación de mutaciones somáticas en una gran cohorte de tumores malignos ginecológicos. Hemos mostrado que este nuevo panel es reproducible, de alto rendimiento, y adecuado para baja calidad y cantidad de ADN a partir de muestras FFPE. Nuestros datos apoyan la posibilidad de que los perfiles de mutación somática como una herramienta para clasificar los tipos de tumores en el tracto ginecológico. Por otra parte, nuestros resultados revelaron que la vía PI3K-Akt se ve afectada lo más prominente en tumores malignos ginecológicos, lo que justifica una mayor investigación de
PI3K
/Akt /mTOR en terapias de oncología ginecológica de orientación.