Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) son un pequeño subconjunto de células cancerosas responsables del mantenimiento y la progresión de varios tipos de cáncer. El aislamiento, la propagación y la diferenciación de las células madre cancerosas en los nichos adecuados madre exponen las dificultades intrínsecas para estudios posteriores. Aquí nos muestran que el cáncer inducido al igual que las células madre (iCLSCs) puede ser generado por
in vitro
manipulación oncogénica de las células madre embrionarias de ratón (mESCs) con elementos oncogénicos bien definidos; SV40 LTG y H
ras
V12 mediante el uso de un virus madre de ratón repetición terminal larga (LTR-MSCV) basado en el sistema retroviral. Los mESCs reprogramadas utilizando ambos oncogenes se caracterizaron por su expresión de los genes oncogénicos, el aumento de la proliferación y el mantenimiento sin trabas de las propiedades madre
in vitro Opiniones y
in vivo
. Además, estas células transformadas como resultado la formación de teratomas malignos de ovario, inmaduros
in viv
o. Para ampliar aún más estas propiedades con éxito a otros órganos y especies, se necesita investigar más por hacer para comprender plenamente el papel de un microambiente favorable a tumores. Nuestro estudio ha proporcionado un enfoque novedoso para generar cáncer inducido como células madre a través de
in vitro
reprogramación oncogénico y formación de tumores malignos de órganos específicos iniciado con éxito en un modelo ortotópico de cáncer pequeño animal.
Visto : S Cho, Parque H, Jarboe EA, Peterson CM, Bae YH, Janat-Amsbury MM (2015) Diseño y caracterización de células madre de bioingeniería similar al cáncer. PLoS ONE 10 (10): e0141172. doi: 10.1371 /journal.pone.0141172
Editor: Masaharu Seno, Universidad de Okayama, Japón
Recibido: 21 de julio de 2015; Aceptado: 3 de octubre de 2015; Publicado: 21 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Cho et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la teoría jerárquica de la organización de cáncer sugiere que sólo un pequeño subconjunto de células es responsable de la iniciación y un mayor crecimiento del cáncer [1-3]. Esas pequeñas poblaciones de células se han definido como células madre de cáncer (CSC). Entre otros, presentan características CSC tales como la auto-renovación y la capacidad de diferenciación en células cancerosas heterogéneos y tumorigénicos [1, 4]. CSC putativos de diversos tumores incluyendo el cerebro, de mama, y cáncer de ovario fueron aisladas hasta la fecha en base a su expresión de moléculas específicas o combinación de marcadores celulares (por ejemplo, CD133, CD44, ALDH) [5-9]. El potencial tumorigénico de estas células se ha demostrado en diversos estudios de xenoinjertos utilizando ratones inmune comprometido [5, 6, 10]. Sin embargo, la caracterización adicional de las propiedades y capacidades CSC 'se han visto obstaculizados por las dificultades intrínsecas de aislar poblaciones puras CSC, la propagación de estas células madre cancerosas aisladas, y la diferenciación de las células madre cancerosas en los nichos adecuados madre [11].
fibroblastos normales y células de mama pueden ser transformados en sus células cancerosas inducidas por
in vitro
reprogramación a través de la introducción exógena de alternancias genéticos responsables del aumento de la longitud de los telómeros (hTERT), proporcionando señales de proliferación constitutivos (H
ras
V12), y la inhibición del crecimiento vías supresores tales como p53 y pRb por virus de simio 40 (SV40) antígenos [12, 13]. En la misma línea de
In vitro reprogramación
, Scaffidi
et al
informó de que las células somáticas poseen suficiente plasticidad para ser reprogramado y adquirir propiedades CSC a través de
in vitro
introducción oncogénico [ ,,,0],14]. Numerosas referencias, especialmente en el estudio de cánceres hematológicos, indicaron que las CSC se puede derivado del tallo del tejido, las células progenitoras, e incluso a partir de células somáticas [10, 14-18]. Sin embargo, el potencial de
in vitro
reprogramación de las células madre embrionarias en células madre cancerosas sigue sin estar claro.
En este documento, se estudió si las células madre embrionarias de ratón (mESCs) pueden ser reprogramadas con éxito en cáncer inducido como Las células madre (iCLSCs) a través de
in vitro
manipulación oncogénico. Además, mediante la exposición de iCLSCs a diversos microambientes específicos
in vivo
, pudimos observar el potencial de estos iCLSCs para generar tumores iCLSC específicas del lugar en ratones inmunocompetentes.
Materiales y Métodos
Química y plásmidos
los siguientes materiales han sido obtenidas de los fabricantes indican: (a) Fugene 6 (Promega, Madison, WI), (b) y FBS polibreno (Sigma-Aldrich, St-Louis , MO), (c) Geltrex (Invitrogen, Carlsbad, CA) (d) Mycozap además CL (Lonza, Allendale, NJ), (e) pBABE-H
ras
V12 (# 1768), pBabe- LTG SV40 (# 10891), pMSCV-GFP (# 33336), y pMSCV-RFP (# 33337) (Addgene, Cambridge, MA), (f) pVSV-G (Clontech, Mountain view, CA).
GP2-293 (Clontech) y sus derivados, y fibroblastos de embriones de ratón γ-irradiado células (MEF) (cyagen, Santa Clara, CA) se mantuvieron en DMEM (ATCC, Manassas, VA ) suplementado con 10% o suero bovino fetal 15% (Sigma-Aldrich,), respectivamente. células madre embrionarias de ratón (mESCs) (células madre embrionarias C57BL /6 de ratón,#MUBES-01001, cyagen) se mantuvieron en Knockout DMEM (Invitrogen) suplementado con 15% de sustitución de suero knockout (Invitrogen), 1% de L-glutamina (Invitrogen) , 1% de ácidos aminados no esenciales (Invitrogen), 0,1% de beta-mercaptanol (Invitrogen), factor inhibidor de leucemia (LIF, 10 ng /ml en medio de cultivo; StemRD, Burlingame, CA). Todas las células se mantuvieron en un incubador humidificado con un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C.
Sub-clonación de genes para pMSCV
Para realizar sub-clonación, H
ras
V12 y gran SV40 T antígeno (LTG) fueron separados de pBABE-H
ras
V12 y pBABE-SV40 LTG por la digestión enzimática con BamHI y EcoRI (NEB, Ipswich, MA), o con BamHI (NEB), respectivamente. Integración de H
ras
V12 y SV40LTg en cualquiera pMSCV-GFP o RFP-pMSCV se llevó a cabo mediante ligación con T4-ligasa (NEB) y produjo pMSCV-H
ras
V12-GFP y pMSCV -SV40 LTG-RFP. La integración de los insertos se verificó mediante la digestión enzimática y secuenciación de ADN.
Generación de retrovirus
Para generar sobrenadante retroviral, GP2-293 células fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de pMSCV H-ras
V12-GFP o pMSCV-SV40 LTG-RFP combinado con el incompetente para la replicación del ayudante de vector pVSV-G en una placa de cultivo de 60 mm utilizando Fugene 6. las células se alimentaron a las 24 h después de la transfección, y el sobrenadante retroviral era agrupados de la colección en 48 y 72 h después de la transfección. El sobrenadante se dividió en alícuotas después de la centrifugación y se almacenó a -80 ° C para uso futuro. El título viral se verificó mediante análisis FACS (FACSCanto Analyzer, BD Biosciences, San Jose, CA) después de la infección a 1x 10
5 NIH-3T3 células de fibroblastos de ratón (ATCC).
Establecimiento de GP2- Estable 293 derivados
Para generar GP2-293 derivados con la integración estable de genes, GP2-293 células fueron infectadas ya sea con H
ras
V12 o SV40 LTG usando un sistema retroviral. Clasificación FACS se llevó a cabo para seleccionar las células infectadas de forma estable de acuerdo con la GFP o RFP expresión (FACSAria clasificador de células, BD Biosciences, San Jose, CA). La expresión génica en células estables se verificó mediante western blot.
infección retroviral para mESCs
mESCs se lavaron y se trataron con tripsina. Después de la centrifugación, se resuspendieron en mESCs libres de suero medio que contiene 8 g de Polybrene por ml-PBS y se colocaron en placas a 1x10
5 células /1 ml por pocillo de una placa de doce pocillos. Se añadió retroviral sobrenadante de virus solo en 1 ml /1x10
5 células o misma relación de volumen de sobrenadante retroviral de virus individuales se añadió para co-infección. Después de 1 hora de incubación en CO
2 incubadora, la placa se centrifugó durante 2 horas a 1000 g a temperatura ambiente. Al día siguiente, se eliminaron los sobrenadantes retrovirales; las células se resuspendieron en medio mESCs y se sembraron en placas revestidas con cualquiera Geltrex o chapado de irradiado MEF. Los mESCs establemente infectadas fueron ordenados por FACS basada en GFP o RFP expresión (clasificador de células FACSAria).
Western Blotting
Las células se lisaron con tampón RIPA (# 9806, Cell Signaling) suplementado con 1 mM de PMSF (Sigma-Aldrich). transferencia de Western se realizó con gradiente de 4-20% de SDS-poliacrilamida TRIS-HCl gel (Mini-PROTEAN TGX
®, BioRad) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Biorad). Los anticuerpos utilizados para el Western Blot fueron anti-ras (# 610001, 1: 1000, BD Bioscience), anti-T grande de SV40 y el antígeno t pequeño (# 554150, 1: 1000, BD Bioscience), anti-β-actina (# A5441 , 1: 2500, Sigma-Aldrich), y anti-IgG de ratón-HRP (# 7076S, 1:. 5000, Cell Signaling)
fosfatasa alcalina tinción inmunocitoquímica y tinción de células vivas
tinción de fosfatasa alcalina se realizó utilizando el kit de tinción de fosfatasa alcalina II de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stemgent). Para la tinción inmunocitoquímica de células vivas, las células cultivadas en una placa de 12 pocillos hasta que muestra colonias visibles se trataron con anticuerpo solución preparada en medio de cultivo celular fresco con una concentración final de 2,5 g (StainAlive ™ SSEA-1 (DyLight 550 ™), Stemgent) /ml. Después de incubación durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO
2, se examinaron las células bajo un microscopio de fluorescencia (microscopio automatizado, Nikon, Japón) con el filtro TRITC.
Ensayo de proliferación celular
ensayo de proliferación celular se realizó mediante la utilización de ensayo de recuento de células kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, MD). En pocas palabras, los 100 l de suspensión de células (3000 células /pocillo) se sembraron en la placa de cultivo de 96 pocillos recubierta con Geltrex (Invitrogen). Durante el período de crecimiento, se midió la proliferación de células en cada pocillo después de 1 h de incubación con 10 l de solución de CCK-8 usando un lector de microplacas (Spectramax 250, Molecular Device Inc., Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de 540 nm. Después de la sustracción de la absorbencia intrínseca de los medios de comunicación a una longitud de onda de 540 nm, la proliferación celular relativa (%) se calculó a partir de ([Absorbancia]
test /[Absorbancia]
de control) x 100. [Absorbancia]
control se refiere a la absorbancia de las células cultivadas en medios en el día 1 después de la siembra de las células a la placa.
en la producción de tumores in vivo utilizando mESCs modificados y la evaluación histopatológico del tejido
Este estudio se llevó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Utah (Número de Permiso: 14-08011).
Tanto, mESCs modificados y mESCs ingenuos (control) se cultivaron durante una semana en el MEF células de alimentación hasta que las colonias visibles se observaron implantación anterior. Para ortotópico inoculación bolsa ovárica de las células de los animales, de seis a ocho semanas de edad, hembras C57BL /6 ratones (laboratorio Jackson, puerto de bar, ME) se pesaron antes intraperitoneal inyecciones de anestesia (xylazein-ketamina; 0,1 ml /10 g de peso corporal). Cada animal se coloca en posición de decúbito prono se recibió alrededor de ~ 1,5 cm de longitud de la incisión dorsal, ligeramente a la izquierda de la línea media. La dermis se separó de los tejidos subyacentes, y una incisión más pequeña se hizo a través del músculo dorsal plana fascia para acceder al peritoneo abdominal. Después de identificar riñón izquierdo, la zona inmediatamente por debajo del riñón se diseccionó para localizar el ovario izquierdo, que luego fue exterioriza a través de la incisión. 1x 10
5 células (50 l en mezcla 1: 1 de PBS y matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury, MA)) se inyecta directamente en bolsa ovárica usando una jeringa Hamilton (30 G de la aguja). Después de la inoculación de células, el ovario fue lugar de nuevo a su posición original en la cavidad peritoneal. 4-0 suturas se utilizaron para suturar la incisión de la pared del fondo y la piel [19, 20]. inoculación ortotópico de las células a mama de ratones se llevó a cabo por inyección directa de 1x 10
5 células (50 l en 1: 1 mezcla de PBS y matrigel (# 354248, Corning, Tewksbury, MA)) a la grasa de mamífero inferior derecha . pAD
Este piloto
in vivo
estudio incluyó (n = 16; Tabla S1) los animales. En resumen, según el sitio del tumor (glándula mamaria frente bolsa ovárica), ya sea teratomas inmaduros con propiedades malignas (ovario) o teratomas maduros (mama) formadas. El número total de animales (n = 16) se dividieron en cuatro grupos experimentales. Grupo 1: Glándula mamaria inoculado con mESC; Grupo 2: bolsa ovárica inoculado con mESC; Grupo 3: Glándula mamaria inoculado con mESC-Ras-LTG (iCLSCs), Grupo 4: bolsa ovárica inoculado con mESC-Ras-LTG (iCLSCs). Después de la inoculación de células ortotópico, los ratones se controlaron dos veces por semana a lo largo de la totalidad de los períodos experimentales 15 la semana. Los animales fueron alojados en condiciones normales en el Centro de Medicina Comparada Fondo animal de conformidad con las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Utah. Para la evaluación histopatológico de los tejidos, hematoxilina y eosina (H & amp; E) las manchas se realizaron en secciones representativas de la masa tumoral de laboratorio ARUP (ARUP, Salt Lake City, UT). Un patólogo con especialización en oncología ginecológica evaluó imágenes microscópicas digitales.
El análisis estadístico
El análisis estadístico y el trazado de los gráficos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.) . Todos los resultados se expresan como la media ± desviación estándar, y p. & Lt; 0,05 se utilizó para la significación estadística
Resultados
Construcción de pMSCV-HrasV12 y pMSCV-LTG
plásmidos retrovirales con la MSCV LTR (virus de células madre de ratón repetición terminal larga) se construyeron a través de sub-clonación de cualquiera de H
ras
V12 o gen SV40 LTG en un sitio de clonación múltiple (MSC), seguido de una expresión de conducción IRES de la GFP o RFP gen se muestra como diagrama esquemático en la figura 1A. Las inserciones en las construcciones fueron verificadas a través de la digestión enzimática (Fig 1B), y secuenciación de ADN.
(A) Los genes de interés (es decir HrasV12 o LTG) se inserta en el medio MSCV LTRs, y, o bien GFP o RFP gen era utilizado como gen trazador. (B) insertos clonados en plásmidos pMSCV fueron confirmados por digestiones enzimáticas, ya sea con BamHI o EcoRI. M: escalera de ADN, 1: pMSCV-GFP; 2: pMSCV-H
ras
V12-GFP; 3: pMSCV-GFP
corte; 4: pMSCV-H
ras
V12-GFP
corte; 5: pBABE-H
ras
V12
corte (+ control); 6: pMSCV-RFP; 7: pMSCV-SV40 LTG-RFP; 8: pMSCV-RFP
cortó 9: pMSCV-SV40 LTG-RFP
corte; 10: pBABE-SV40 LTG
corte (+ control). Las flechas blancas indican inserciones. Las secuencias de inserción también se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Establecimiento de GP2-293 derivados para generar retrovirus
Para establecer líneas celulares estables que producen retrovirus, GP2-293 células, un derivado de la 293 línea celular de riñón humano con la integración estable de
gag /pol
componentes retrovirales, fueron transducidas con plásmidos pMSCV. Las células que expresan GFP o RFP clasificado por FACS (Fig 2A y 2B) se verificaron además de observar sus correspondientes expresiones de genes con el análisis de inmunotransferencia se muestra en la figura 2C. Las células estables verificadas se utilizaron además para generar retrovirus a través de la transfección de un plásmido de la cubierta viral, pVSV-G. capacidad Infección de los retrovirus se demostró por análisis FACS a través de la medición de la cantidad de células de fibroblastos de ratón NIH3T3-infectadas con retrovirus que expresan GFP o RFP (Fig 2D).
(A) Confirmación de la expresión de GFP éxito en GP2 -293 células, y (B) Confirmación de la expresión de RFP éxito en GP2-293 células después de la introducción de los plásmidos pMSCV. BF: la imagen de campo brillante; FL: imagen de fluorescencia. Escala desnuda es de 400 micras. (C) El análisis por inmunotransferencia que muestra la expresión estable de H
ras
V12 y SV40 LTG en GP2-293 derivados de células; 1. BL: GP2-293 celda en blanco; 2. GFP: GFP que contiene células GP2-293 3. HrasV12-GFP: H
ras que contienen
celular GP2-293; 4. BL: GP2-293 celda en blanco; 5. RFP: RFP que contiene células GP2-293 6. SV40LTg-RFP: SV40LTg y RFP que contiene GP2-293 celular; M: Escala de proteína. (D) el análisis de citometría de flujo (FACS) de 1x 10
5 NIH-3T3 de fibroblastos de ratón después de la infección con el retrovirus producido a partir de GP2-293 derivados.
Generación de mESCs modificados genéticamente
ratón (mESC) fueron transformadas por la infección con retrovirus producidos a partir de derivados de células GP2-293 estables. La expresión de genes introducidos en mESCs se verificó mediante análisis de inmunotransferencia (Fig 3A y 3B). Para confirmar los cambios en la proliferación celular, ensayos de proliferación celular se realizaron en mESCs transformadas, que también se compararon para controlar mESCs (figura 3C). mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG mostró aumento significativo en la proliferación en comparación con mESC-GFP y -H
Ras V12
en el día 7 (figura 3D). comparando una mayor proliferación de mESC-SV40 LTG y mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG con mESC-RFP, mESC-SV40 LTG y mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG mostró una mejora significativa de la proliferación (Fig 3D). Sin embargo, no hubo diferencias en la proliferación entre mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG y mESC-LTG SV40 (figura 3D)
Imágenes representativas de análisis de inmunoblot:. (A) H
ras
V12, (B) SV40 LTG. Ensayo de proliferación (C) CCK células durante 7 días del período de proliferación de mESCs y mESCs transformadas. (D) Comparación de las proliferaciones en el día 7. La media ± S. D. (N = 3), *, **, y #, ## p & lt; 0,05. prueba de ANOVA se realizó con el post-test de Tukey utilizando el software GraphPad Prism.
Mantenimiento de stemness después de la modificación retroviral de mESCs
Para confirmar la troncalidad de mESCs transformadas, la expresión de alcalina se evaluó la fosfatasa (AP) y la etapa específica embrionaria anitigen-1 (SSEA-1) detener marcador de células. Los mESCs transformadas (Figura 4A-(c) - (e)) expresaron niveles similares de tinción de AP en comparación con mESCs ingenuos (no transformadas) (Figura 4A-(b)) que indica el mantenimiento ininterrumpido de células indiferenciadas que conservan su potencial de auto-renovación . Durante su posterior verificación del estado indiferenciado de mESCs transformadas con SSEA-1 anticuerpo específico, mESCs transformadas (Fig 4B- (b) - (d)) mostraron un resultado positivo para este marcador de superficie como mESCs como no transformadas (Fig 4B- (una )). La detección tanto de AP y SSEA-1 en mESCs transformadas demostró no parecía que los procedimientos de transformación para afectar a la troncalidad de mESCs.
(A) de la fosfatasa alcalina (AP) tinción. áreas de color rojo indican actividad de la fosfatasa alcalina. (un). la imagen de campo claro de mESCs; AP tinción: (b). mESCs; (do). mESC-H
ras
V12; (re). mESC-SV40 LTG; (mi). mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG. Escala desnuda es de 10 micras. (B) tinción inmunocitoquímica de las células vivas que expresan SSEA1. Pares de brillantes e imágenes presentadas SSEA1: (a). mESCs; (segundo). mESC-H
ras
V12; (C) .mESC-SV40 LTG; (re). mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG. Las imágenes representativas se obtuvieron de microscopio de fluorescencia con filtro TRITC. La barra de escala es de 100 micras.
caracterizaciones de células madre de cáncer similar a la bioingeniería
para confirmar el potencial oncogénico de mESCs reprogramadas, mESC-H
ras
V12 /células SV40 LTG fueron inoculados ya sea de forma ortotópica a la bolsa ovárica izquierda o borran almohadillas de grasa mamaria inguinal. A los 31 días después de la inoculación, una masa ovárica se había formado en los ratones que fueron sometidos a la inoculación ortotópico de la bolsa ovárica. En contraste, los ratones que han sido sometidos a la inoculación ortotópico de la almohadilla de grasa mamaria inguinal no formó ningún masas. El situs abdominal en ratones después de la inoculación de ovario demostró una masa ovárica (figura 5A) en forma de ovario izquierdo agrandado en comparación con el contra-lateral ovario derecho normal, no inyectada (Figura 5B). Tras el examen macroscópico adicional, el ovario izquierdo inyectado también demostró visiblemente la masa formada romper a través de la superficie del ovario, así como adhiriéndose a la pared lateral peritoneal. También se ha encontrado el espacio retroperitoneal para ser ocupado por la adherencia de masa a la pared posterior, y riñón izquierdo (Fig 5C). No hubo evidencia de metástasis abdominales bruto que surgen de esta masa ovárica.
(A). El sitio abdominal con masa ovárica (círculo azul); (SEGUNDO). Cuello uterino con el útero, ovario derecho normal (flecha azul) y la masa ovárica izquierda (flecha blanca); (DO). El ovario izquierdo con la cápsula parcialmente intacta y la masa se rompe a través de la superficie del ovario (círculo azul).
El análisis histopatológico de los ovarios inyectados con mESC reveló la generación de un teratoma maduro que presenta epitelio escamoso bien diferenciado con queratinización y el epitelio respiratorio similar (Fig 6A (b)) en comparación con características histológicas de ovario normal (Fig 6A (a)). Curiosamente, los ovarios inyectados con mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG también formó teratomas maduros, pero además reveló partes de un teratoma inmaduro que contiene focos dispersos de una neoplasia maligna de alto grado, que se caracteriza por células malignas dispuestas linealmente , en pequeños grupos, y ocasionalmente como estructuras glandulares rudimentarios (figura 6A (c) pequeña ventana). Mayor aumento reveló estas células malignas ser pobremente diferenciado con alta núcleo: citoplasma proporciones, núcleos muy atípicos con toscamente agrupada cromatina, nucleolos prominentes de forma variable, y numerosas figuras mitóticas (Figura 6A (c)). Los ratones que tenían sus almohadillas de grasa mamaria inguinal inyectados con mESCs parecían haber generado teratomas maduros que presentan un epitelio escamoso bien diferenciado, también contienen tejido pancreático, y el epitelio respiratorio similar al de cilios bien formado (Fig 6B- (b)) en comparación con el evaluación histológica del tejido mamario normal (Fig 6B- (a). Por el contrario, la mama inyecta mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG no mostró diferencias histológicas notables en comparación con el normal, no inyectada, ... el tejido mamario
(a) Panel de ovario: (a) normal ovario derecho (no inyectado) (100X) la barra de escala es de 100 micras; (b) la masa ovárica izquierda (después de la inoculación con ortotópico mESC. ) que muestra signos de un teratoma maduro (pequeña ventana, 100X) caracteriza con un enfoque de maduro, queratinizado epitelio escamoso dentro de la zona representada dentro de la caja (200X) la barra de escala es de 100 micras;.. (c) la masa ovárica (después de la inoculación ortotópico con mESC-H
ras
V12 /SV40-LTG) que muestra signos de teratoma inmaduro (pequeña ventana, 100X) que se caracteriza con focos dispersos de una neoplasia maligna de alto grado dentro de la zona representada dentro de la caja (400X). La barra de escala es de 100 micras. (B) Panel de mama: (a). El tejido normal murino mamario (100X). La barra de escala es de 100 micras; (segundo). masa en la mama (después de la inoculación ortotópico de mESC en almohadilla de grasa mamaria inguinal aclarado) que presenten síntomas de teratoma maduro (pequeña ventana, 100X) caracterizado con el epitelio respiratorio, como tener cilios bien formado dentro de la zona representada dentro de la caja (200X). La barra de escala es de 100 micras.
Discusión
El presente estudio demuestra que las células madre embrionarias de ratón (mESCs) pueden ser reprogramado en cáncer inducido como células madre (iCLSC) mediante la introducción de bien oncogénicos elementos definidos, (el virus de simio 40 T grande oncogén (SV40 LTG) y un ras oncogénico (H
ras
V12)) mediante el uso de un terminal larga del virus del vástago de repetición del ratón (MSCV-LTR) a base de plásmido retroviral . Los
in vitro
mESCs reprogramadas mostraron aumento de la proliferación y el mantenimiento de las propiedades de células madre bajo
in vitro
condiciones de cultivo in. Además, esas células transformadas también demostraron diferencias específicas de sitio de la formación de tumor ortotópico de después de la inoculación de tejidos de ovario y de mama en ratones inmunocompetentes. Por lo tanto, sugerimos que
in vitro
reprogramación de mESCs con elementos oncogénicos puede ser un enfoque potencial para generar cáncer inducido como células madre.
Se encontró que el sistema retroviral MSCV-LTR ser un potencial herramienta útil para la transformación efectiva, oncogénica de mESCs. La infección retroviral de mESCs parece depender de los virus generados a partir de diferentes tipos de plásmidos retrovirales altamente. En nuestro sistema retroviral MSCV-LTR, se observó una mayor capacidad de infección y el mantenimiento de la expresión génica estable, en comparación con el sistema común a base de virus Moloney retroviral (es decir, series pBABE). Nuestros hallazgos recientes son consistentes con los informes anteriores que retrovirus, que se genera a partir de un plásmido retroviral basado en MSCV-LTR, podría mantener a largo plazo y la expresión estable de genes tanto en células madre embrionarias (ES) las células y madre hematopoyéticas (HS) células [ ,,,0],21, 22].
in vitro
reprogramación de mESCs a iCLSC cumplía con los requisitos de los genes oncogénicos bien definidos, H
ras
V12 y SV40 LTG, por tanto neoplásico transformación y anti apoptosis. ras oncogénico mutación, que se produce en aproximadamente el 30% de todos los tumores humanos, se sabe que está implicado en el proceso de transformación neoplásica de las células
in vitro
y ha sido bien informado [13, 23, 24]. Sin embargo, la introducción de una forma constitutivamente activa de Ras solamente (es decir, H
ras
V12) mostró su potencial de sensibilización de las células a la apoptosis [24-26] e incluso la inducción de la senescencia celular prematura través de la asociación de la acumulación de p53 [27 ]. En nuestro ensayo de proliferación con reprogramado mESC, la falta de una mejora significativa de la proliferación de la mESC reprogramado con H
ras
V12 solo podría ser en parte explicado por la inducción de cualquiera de senescencia celular o apoptosis a través de la expresión de una constitutivamente activa de forma H
ras
V12 solo. Por el contrario, mESC-SV40 LTG y mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG demostrado su mejoren los efectos proliferativos. Considerando una función anti-apoptótica de SV40 LTG por la inactivación de p53 [28], se sugiere que la introducción de SV40 LTG en mESC puede jugar un papel en la prevención mESC de la senescencia celular prematura o la inducción de la apoptosis. Por otra parte, SV40-LTG podría cooperar con H
ras
V12 durante la transformación neoplásica de mESCs con prevención de H
ras
la muerte celular inducida por V12, que se encontró que era consistente con varios informes anteriores [13, 29, 30].
El mantenimiento con éxito de las propiedades de células madre en mESCs reprogramadas se pudo confirmar
in vitro
y
in vivo
. En el proceso de
in vitro
reprogramación de mESCs, se utilizó la infección retroviral para introducir componentes oncogénicos. Aunque introducción retroviral de genes tiene las ventajas de alta infección y la integración estable de genes exógenos en los cromosomas del huésped, la inserción aleatoria de componentes retrovirales en genomas de acogida no puede excluir la perturbación o pérdida de la expresión de propiedades de células madre en mESCs. Sin embargo, observamos una expresión estable de los dos marcadores de células madre, la fosfatasa alcalina (AP) y SSEA-1, después de la transformación retroviral de mESCs. Para obtener una comprensión más completa de los mecanismos de la que subyace a este mantenimiento de la expresión génica del tallo después de la infección retroviral, se requiere un mayor estudio. Además del mantenimiento de las propiedades de células madre
in vitro
, la inoculación ortotópico de mESCs reprogramadas
in vivo
también mostró la formación de teratomas inmaduros en los ovarios de ratones. De hecho, la formación de teratomas observada
in vivo
, incluyendo inmadura, componentes malignos también ejemplifica el mantenimiento con éxito de células madre propiedades
in vivo
lo largo de todo el proceso de reprogramación.
Si el desarrollo de diversos tumores malignos de las células madre será sin duda posible, esto puede requerir estudios adicionales para investigar más a fondo el papel específico de los diferentes microambientes en la tumorigénesis [31]. Nuestros experimentos con animales nos permitieron observar las diferencias de la formación de teratomas en dos lugares de implantación ortotópico diferentes (de ovario y de mama). En la implantación de ovario ortotópico, mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG induce la generación de teratoma inmaduro que exhibe focos dispersos de una neoplasia maligna de alto grado. Sin embargo, mama colocado con el mESC-H
ras
V12 /SV40 LTG no mostró la formación de teratoma. Aunque aún no se ha estudiado la contribución del microambiente en los dos sitios para la generación de malignidad, un informe reciente de Yan T
et al
sugirió la posible contribución de los factores microambientales de tumor favorable durante la transformación de ratón pluripotentes inducidas Las células madre (mIPSCs) en las células madre del cáncer (CSC) [32]. Por lo tanto, creemos que el microambiente de ovario puede ser el lugar propicio para el avance del proceso tumoral en mESC- H
ras
V12 /SV40 LTG en comparación con el lugar de mama.
En conclusión, demostrado la generación con éxito de cáncer inducido como células madre mediante el uso de oncogénico
in vitro
reprogramación de mESCs. Los mESCs reprogramadas se caracterizaron por su expresión de los genes oncogénicos y mantenimiento sin trabas de las propiedades madre
in vitro Opiniones y
in vivo
. Además, estas células modificadas mostraron la formación de teratomas contienen partes inmaduros, malignas al crecer ortotópicamente en el sitio de implantación favorable para la tumorigénesis. Las limitaciones de esta investigación existen basan en la formación de teratomas avanzadas
in vivo
en lo que respecta a la cuestión de tumor- microambientes favorables. Por otra parte, se sugiere la necesidad de un microambiente aberrante para el desarrollo y mantenimiento de los tumores derivados de cáncer inducido como células madre. Para comprender mejor los procesos de tumorigénesis natural, así como para establecer modelos animales de cáncer más predecibles, el estudio continuo de las funciones detalladas se requerirá que el microambiente tumoral, así como la identificación de factores microambientales potencialmente aberrantes para hacerse una idea de la
in vivo
generación de diversos tipos de cáncer derivadas de cáncer inducido como células madre. Nuestro trabajo ha proporcionado pionero bases para permitir una variedad de aplicaciones futuras de investigación adicional para estos cáncer inducido como células madre, pero se necesita más investigación para comprender mejor los mecanismos de tumorigénesis iCLSCs subyacente.
Información de Apoyo
S1 Tabla . La formación de tumores en ratones
doi:. 10.1371 /journal.pone.0141172.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
El autor desea agradecer a Sun por su Dr.Yongen soporte conductor todas las cirugías animales, Sra. Kathy Harvey por su corrección del manuscrito, el grupo de patología molecular (BMP) biorepositorio y en el Instituto de cáncer Huntsman por su amable apoyo en el manejo de la tinción histopatológica de los tejidos, y el Dr. James Marvin y el Sr. Chris Leukel por su amable apoyo de la clasificación de FACS las células dentro de la Universidad de Utah flujo de citometría de núcleo.