Extracto
Nuestro trabajo previo identificó un sitio de unión intermedia de taxanos en los microtúbulos nanoporos. El objetivo de este estudio fue probar derivados de paclitaxel diseñado para unirse a este sitio intermedio diferencialmente dependiendo del isotipo de β-tubulina. Desde isotipos de beta-tubulina tienen tejidos que dependen de expresión, específicamente, el isotipo βIII es muy abundante en los tumores agresivos y mucho menos común en los tejidos normales, se espera que esto conducirá a tubulina dirigida fármacos que son más eficaces y tienen menos efectos secundarios. Siete derivados de paclitaxel fueron diseñados y cuatro de ellos eran susceptibles para la síntesis de suficiente pureza y rendimiento para su análisis posterior en líneas celulares de cáncer de mama modelo. Ninguno de los derivados estudiados fueron superiores a los taxanos utilizados actualmente, sin embargo simulaciones por ordenador proporcionó información sobre la actividad de los derivados. Nuestros resultados sugieren que ni obligatorio al sitio de unión intermedia ni el sitio de unión final es suficiente para explicar las actividades de los taxanos derivados estudió. Estos resultados ponen de relieve la necesidad de mejorar de forma iterativa en el diseño de los taxanos en función de su actividad en sistemas modelo. Los conocimientos adquiridos en la capacidad de los fármacos diseñados para unirse a los objetivos y llevar a cabo la actividad de una manera predecible es un paso hacia la personalización de las terapias
Visto:. St. George M, Ayoub AT, Banerjee A, Churchill MDL, Winter P, Klobukowski M, et al. (2015) Diseño y ensayo de nuevos taxanos para sondear los mecanismos muy complejos por el cual taxanos unirse a microtúbulos y causar citotoxicidad para las células cancerosas. PLoS ONE 10 (6): e0129168. doi: 10.1371 /journal.pone.0129168
Editor Académico: Shian-Ying Sung, Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 4 Febrero 2015; Aceptado: 5 Mayo 2015; Publicado: June 8, 2015
Derechos de Autor © 2015 St. George et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Financiado por la mama beca de la Fundación canadiense del cáncer adjudicado a JAT, cantidad: RES0010014. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los taxanos, incluyendo paclitaxel y docetaxel, dirigirse a la tubulina, la proteína de la subunidad de los microtúbulos, y se unen a un sitio bien caracterizado en β-tubulina [1]. Los mecanismos de unión y de la acción, sin embargo, son muy complejos. A diferencia de otros fármacos anti-tubulina, los taxanos se dirigen específicamente a los microtúbulos intacta y su sitio de unión está en el lumen de los microtúbulos [2]. El trabajo previo de Freedman et al. [2] mapeado los nanoporos a lo largo de la superficie de los microtúbulos a través del cual taxanos necesitan para pasar el fin de alcanzar el sitio de unión. Un sitio específico en el nanoporo fue identificado como un sitio de unión taxano intermedio. Una segunda cuestión es que hay múltiples isotipos de β-tubulina y que éstas difieren tanto en su afinidad por los taxanos y sus funciones y localizaciones subcelulares [3]. Paclitaxel parece ejercer su efecto más grande en el isotipo βII [4], que es también el principal isotipo β-tubulina en las neuronas [3], posiblemente teniendo en cuenta la neuropatía asociada con los taxanos. El isotipo βIII, que es muy abundante en los tumores agresivos y mucho menos común en los tejidos normales, parece ser una buena alternativa de destino [5,6]. Nuestro objetivo era diseñar racionalmente y nuevos derivados de taxano de prueba que se unen al sitio de unión intermedia con afinidad diferencial dependiendo del isotipo β-tubulina expresado en las células.
Los taxanos son algunos de los agentes antitumorales más activos en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, en particular de mama, de ovario y cáncer de pulmón [7,8]. La resistencia a taxanos es un problema para quimioterapia con éxito y, potencialmente, puede surgir a partir de al menos tres mecanismos distintos. En primer lugar, es el mecanismo clásico que surge de la acción de la P-glicoproteína (P-gp, codificada por el
MDR1
de genes), que bombea esencialmente fármacos fuera de las células del cáncer [9]. Estructuralmente diferentes taxanos podrían, en principio, tener diferentes susceptibilidades a la acción de la P-gp. En segundo lugar, β-tubulina, el objetivo de los taxanos, existe como numerosos isotipos que difieren en secuencia de aminoácidos y codificada por diferentes genes [3]. Uno de los taxanos, paclitaxel, tiene sus efectos más fuertes en el isotipo βII [4]. Desde βII se expresa sobre-en muchos tumores [10] Esto no es sorprendente, sin embargo, βII es también un componente importante del sistema nervioso [5], lo que puede explicar la neurotoxicidad de los taxanos. El isotipo βIII sería una mejor diana ya que se produce en gran medida en las neuronas, pero a niveles mucho más bajos que βII, mientras que su expresión es muy común en cánceres agresivos y metastásicos [6]. En tercer lugar, la unión de taxanos a los microtúbulos es muy compleja, y el fármaco tiene que atravesar desde el medio exterior al sitio de unión en el lumen (interior) de los microtúbulos [11] para llevar a cabo la secuencia catalítica de eventos que conducen a la polimerización o despolimerización. Esto significa que el taxano tiene primero de unirse a un sitio intermedio en la superficie de los microtúbulos y luego hacer su camino en el interior. Este sitio intermedio también difiere entre los isotipos. Los medicamentos descritos aquí han diseñado y probado tanto
in vitro
y
in silico
en un esfuerzo para hacer frente a los tres de las cuestiones antes mencionadas.
Las estructuras químicas de paclitaxel y docetaxel se muestran en la Fig 1. El docetaxel fármaco semisintético de segunda generación se diferencia en dos posiciones de paclitaxel. La sustitución del éster de acetato en la posición C-10 con un grupo hidroxilo hace docetaxel más y biodisponible que paclitaxel [12,13], y como resultado docetaxel soluble en agua es el favorecida de los dos compuestos para uso en aplicaciones clínicas. Muchos fármacos de tercera generación están siendo desarrollados para mejorar los compuestos parentales, con los objetivos de mejorar la solubilidad en agua, la permeabilidad del tumor, y la retención celular, lo que resulta en mejores resultados y una mayor supervivencia de los pacientes [14].
los taxanos se dirigen específicamente a la subunidad β-tubulina de la α /β-tubulina heterodímero [15,16]. La ubicación del sitio de unión se encuentra en el lumen de la estructura de microtúbulos hueco. Dado que los microtúbulos están compuestos de repetir las proteínas globulares, los espacios intersticiales (nanoporos) están situados a lo largo de la longitud de los microtúbulos entre protofilamentos adyacentes [2]. Es a través de estos nanoporos que los taxanos han sido mostrados para mover y tener acceso al sitio de unión en el lumen [11,17]. Una vez unido al sitio de unión final ocurre un cambio conformacional, en el que un motivo de β-tubulina conocido como el M-bucle se estabiliza, lo que impide el desmontaje de los microtúbulos [16]. Los taxanos se unen en una relación 1: 1 con heterodímeros a lo largo de la longitud de los microtúbulos [18]. Aunque taxanos potencialmente se pueden unir a cada heterodímero en una estructura de microtúbulos, sólo se requiere una molécula de taxano para estabilizar cientos de heterodímeros de tubulina [18,19].
Tanto α-tubulina y β-tubulina se encuentran en múltiples isotipos expresado por diferentes genes [20]. Hay por lo menos ocho isotipos de beta-tubulina humanos, y la expresión de estos isotipos se ha observado que difieren en tejidos normales y muestras de tumores [21]. Clase ha observado III β-tubulina (βIII), en particular, que se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer, en particular cáncer resistente a fármacos [6], mientras que βI se expresa constitutivamente, y βII es altamente expresado en el tejido cerebral [21]. Sobre la base de la consideración de la estructura de los microtúbulos, el sitio de unión intermedia en la nanoporos, y las variaciones de secuencia entre los isotipos de beta-tubulina, la hipótesis de que los taxanos diseñados para interactuar diferencialmente con tubulins ejercerá actividades biológicas influenciada por factores estéricos y /o afinidades de Los restos de ingeniería a los sitios de unión, la abundancia relativa de las isoformas tubulina, barreras impuestas por bicapas lipídicas (solubilidad relativa) y energías libres de asociación o disociación [2]. Los objetivos específicos abordados en este estudio son los siguientes:
Para investigar los enlaces de hidrógeno entre el hidroxilo en C-7 de taxanos con Ser275 en
α
I y
β
II, sus interacciones relativas con la nanoporos, y la difusión resultante de los taxanos al sitio de unión.
para investigar los enlaces de hidrógeno entre las conservadas en Ser278 isotipos de tubulina (
β
I,
β
II y
β
III) con diferentes cadenas laterales de ingeniería en el extremo C-10 de los taxanos, sus interacciones relativas con el nanoporos y la difusión resultante de los taxanos al sitio de unión.
la premisa subyacente de la primera objetivo se basa en el modelado computacional, que encontró que en βIII tubulina, que tiene alanina en lugar de serina en la posición 275, no es capaz de formar un enlace de hidrógeno con el hidroxilo C-7 en paclitaxel, que a su vez debilita la interacción de paclitaxel con el nanoporos, inhibe la difusión del paclitaxel al sitio de unión intermedia, y los resultados en una pérdida efectiva de la actividad de paclitaxel en los microtúbulos que contienen βIII tubulina [2].
la prueba del primer objetivo requiere la síntesis de derivados de paclitaxel con el hidroxilo C-7 sustituido por un grupo funcional (Tx-a y Tx-B, Fig 1) o flúor (Tx-C, Fig 1) no polar. Esperábamos ver disminuida la promoción de la polimerización por paclitaxel de microtúbulos formados por el isotipo βIII. Cuando cualquiera Tx-A o Tx-B se probaron sin embargo, esperamos ver que la promoción de la polimerización es menos afectado por el isotipo de β-tubulina; en otras palabras, los efectos de Tx-A o Tx-B deben ser insensibles (o al menos menos sensible) al isotipo β-tubulina. Tx-C debe tener una actividad intermedia, debido a la menor energía asociada con el enlace de hidrógeno al átomo de flúor (3 kcal /mol en comparación con 5 kcal /mol). Hemos sido capaces de sintetizar compuestos Tx-A y Tx-C, y estos fueron probados con
in vitro
ensayos de polimerización en o con los modelos de línea celular para la actividad citotóxica.
La premisa para la segunda objetivo es que un intervalo de entre 4 y 9 Å necesita ser abarcó acceder a la Ser278, y por lo tanto un resto de cadena lateral podría ayudar a cerrar esta brecha. El enlace de hidrógeno entre paclitaxel y Ser278 se predice para hacer que la estabilización de la interacción de taxano en la nanoporos, que resulta en un movimiento más rápido del fármaco al sitio de unión dentro de los microtúbulos, la polimerización de microtúbulos mejorada, y el aumento de la citotoxicidad. La prueba del segundo objetivo requiere la síntesis de varias modificaciones en la posición C-10 de paclitaxel. Hemos diseñado taxanos que tienen diferentes longitudes de cadena en la posición C-10 utilizando un guanidinio (compuestos Tx-E y Tx-G, figura 1) o un carboxilato (compuestos Tx-D y Tx-F, Fig 1) grupo funcional. Se espera que estos compuestos sean más activos que paclitaxel. Hemos sido capaces de sintetizar compuestos Tx-D y F-Tx y estos fueron probados con
in vitro
ensayos de polimerización o con modelos de líneas celulares para la actividad citotóxica.
Materiales y Métodos
Síntesis química
compuestos inicialmente comprados Tx-a, Tx-C, D y Tx-Tx-F (de entre los
in silico
compuestos diseñados Tx-a a G-Tx ; la figura 1), debido a su relativa facilidad de la síntesis con el suficiente rendimiento y pureza relativa a prueba los objetivos propuestos. Las identidades de los compuestos se evaluaron mediante resonancia magnética nuclear (RMN), y la pureza por cromatografía en capa fina (TLC); compuestos Tx-A, Tx-C, Tx-D y Tx-F fueron 88%, 94%, 94% y 96% de pureza, respectivamente, con rendimientos de 6%, 10%, 3,6% y 3,3%, respectivamente. Todos los compuestos se sintetizaron personalizada a través del proveedor de servicios contratados Helios Biotech Ltd., Edmonton, Alberta, Canadá.
Cell Cultura y
líneas celulares de cáncer de mama SK-BR-3 [22], MDA-MB -231 [23], y T-47D [24] fueron amablemente proporcionados por el Dr. Ing Swie Goping (Universidad de Alberta, Canadá). Estas son líneas celulares de cáncer de mama representativos que reflejan la heterogeneidad molecular observado en los tumores en un entorno clínico. La ayuda líneas celulares seleccionado en la generalización de los resultados y ayuda a descartar una influencia directa del genotipo-fenotipo de una línea celular en el potencial de unión y citotóxicos del paclitaxel y sus análogos. Por otra parte, las líneas celulares de cáncer de mama seleccionados han sido reportados previamente para exhibir diversos grados de resistencia a paclitaxel [25], y nuestro interés era replicar estos hallazgos e interrogar si la resistencia intrínseca dificulta las relaciones estructura-actividad de los análogos de taxanos descritos en el objetivos del estudio. tumores de cáncer de mama se caracterizan en términos de su expresión de diversos receptores de la superficie celular, tales como HER2 (factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2), receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PR), que están involucrados en la señalización celular y la proliferación celular.
La línea de células SK-BR-3 es HER2
+, ER
- y PR
-.
La línea celular MDA-MB-231 no expresa o tiene muy baja expresión de los receptores (HER, ER o PR) y que se denomina el triple negativo. Los pacientes con la condición de receptor triple negativo se someten a tratamientos con terapias citotóxicas tales como paclitaxel o docetaxel
La línea de células T-47D es ER
+ pero HER2
. -. Los tumores que son ER
+ y HER2
- (PR si
+ o PR
-) se denominan tumores luminales A
El pronóstico es mejor para luminal. y lo peor para el triple negativo; HER2
+ tumores (Her2
+ y ER
-) tienen un pronóstico intermedio [26]
Un segundo conjunto de líneas celulares de cáncer de mama no también se utilizaron para evaluar la generalidad. de los resultados con respecto a paclitaxel y sus análogos, excepto que estas líneas celulares están bien caracterizados para la P-glicoproteína (P-gp) expresión, y se clasifican como fenotipos sensibles o resistentes a cualquiera de los fármacos. MES-SA (P-gp negativo, de tipo salvaje) [27] y-SA MES /Dx5 (, resistente drogas P-gp positivo) [28] líneas celulares de sarcoma uterino, y el tipo K-562 (P-gp negativo, salvaje ) [29] y K-562 /R7 (P-gp positiva, resistente a los medicamentos) [30] líneas celulares de leucemia mielógena crónica fueron amablemente proporcionados por el Dr. Charles Dumontet (Universidad de Lyon, Francia). Se seleccionó este panel para determinar si los cambios realizados en las estructuras de taxano tuvieron un efecto sobre la especificidad de sustrato de la bomba de eflujo de resistencia a múltiples fármacos, P-gp. MES-SA y MES-SA /Dx5 son células adherentes, mientras que K-562 y K-562 /R7 son células en suspensión. Se ha informado anteriormente que el MES-SA /Dx5 y 562 K-líneas celulares /R7 sobreexpresan la proteína P-gp y muestran resistencia cruzada a una variedad de compuestos quimioterapéuticos [28,31].
Todo celular líneas se mantuvieron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), a 37 ° C, 5% de CO
2 y en un ambiente humidificado. Las células adherentes se mantuvieron en medios hasta ~ 90% de confluencia. Las células se trataron con tripsina en una solución de tripsina-EDTA (Gibco, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) a una concentración final de 0,25%.
microtúbulos polimerización Ensayo
cerebro bovino preparación de tubulina y purificación de la αβII y αβIII dímeros (α-tubulina era una mezcla de isotipos, y sólo β-tubulina se purificó en βII y βIII, respectivamente) se realizaron como se describe anteriormente [32]. ensayos de polimerización de microtúbulos se realizaron como se describe anteriormente [33]. Alícuotas (200 l) de isotypically puro tubulina de cerebro bovino (1,4 mg /ml) en tampón de tubulina (100 mM MES-Na, EGTA 1 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl 0,5 mM
2, mM GTP 1, pH 6,4) se incubaron en la presencia de drogas (1-16 mM) a 37 ° C durante 15 min en un modelo DU espectrofotómetro (Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN, EE.UU.) y la turbidez de las muestras se monitorizó a 350 nm cada 8 s. Los datos en bruto se adquirieron y procesaron con el programa KINLOTUS. Los datos brutos fueron posteriormente línea de base corregida y los valores de turbidez se representaron frente al tiempo.
MTS Ensayo
La viabilidad celular en presencia del fármaco se determinó utilizando el CellTiter 96 AQ
ueous no Cell radiactivos Ensayo de proliferación (MTS) (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Nalge Nunc International, Rochester, NY, EE.UU.) a niveles proporcionales a su tasa de crecimiento (que van desde 5 a 10.000 células por pocillo) en un volumen de 100 l y se permite que se adhieran a la placa durante la noche. El día siguiente las células se trataron con una gama de 100 l de concentraciones de fármaco 2x para una concentración de fármaco final 1x por pocillo. Cada concentración de fármaco se administró a seis pozos diferentes, para evaluar la reproducibilidad técnica del ensayo. Este tratamiento se mantuvo sin cambios durante un período de 72 horas. Después de 72 horas de tratamiento, se añadieron 30 l de reactivo MTS a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 ° C durante un período de tiempo de 30 minutos a 4 horas, dependiendo de desarrollo del color, una velocidad que es variable de la línea celular a línea celular. la viabilidad celular relativa se determinó midiendo la absorbancia de cada pocillo a 490 nm y se convierte en un porcentaje de la viabilidad total en comparación con un control no tratado. Los resultados experimentales son un promedio de al menos n = 3 experimentos.
SDS-PAGE
dodecil sulfato de sodio poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE) se realizó un análisis por Western Blot. 10% geles de poliacrilamida (de una solución madre de 40% 29: 1 de acrilamida /solución de bis, 0,375 M Tris, 0,1% (v /v) SDS, 0,1% (v /v) de persulfato de amonio, 0,1% (v /v) TEMED (N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina), agua a volumen) se utilizaron para todos los experimentos de transferencia Western. Poliacrilamida (7,5%) geles se utilizaron para el análisis de transferencia de Western de la proteína P-gp (170 kDa) para la resolución necesaria de las bandas de proteínas en este rango de tamaño. Total de lisados de proteínas (25 g) se cargaron en 10 o 15 geles de poliacrilamida utilizando así 1x tampón de muestra Laemmli (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU.). Los geles se corrieron a 200 V durante ~ 1 h en 1 x Tris /glicina /SDS tampón de ejecución (ICN Biomedicals Inc., Irvine, CA, EE.UU.) antes de ser eliminado y se tiñeron con azul de Coomassie o se transfirieron a membrana de nitrocelulosa para el análisis de transferencia Western. geles teñidos con Coomassie se destiñeron usando una solución de 50% H
2O, 40% de metanol y ácido acético glacial al 10%. geles destained fueron digitalizadas en un CanoScan LiDE 600F (Canon Inc., Tokio, Japón) y se visualizaron utilizando el software Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, CA, EE.UU.).
Análisis de Western Blot
Después de la electroforesis en gel y la transferencia de las proteínas a membranas de nitrocelulosa, las membranas se bloquearon con 5% solución salina amortiguadora Tris (TBS), además de la leche y Tween (TBSMT) (154 mM Tris HCl, 1,37 M NaCl, 0,1% (v /v ) Tween20, 5% (w /v)) solución de leche durante 1 hora. Las proteínas en las membranas se expusieron durante la noche a la solución de anticuerpo-TBSMT primaria. Al día siguiente, las membranas se lavaron en solución salina amortiguadora Tris, más Tween (TBST) (154 mM Tris HCl, 1,37 M NaCl, 0,1% (v /v) de Tween 20, pH 7,6), durante 6 ciclos con 5 min de lavado /incubación para cada ciclo en TBST para eliminar el anticuerpo no unido. Las membranas se expusieron además a anticuerpo secundario en TBST durante 30 min. Después de la incubación el anticuerpo secundario, las membranas se lavaron en TBST durante 12 ciclos con 5 min de lavado /incubación para cada ciclo en TBST para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido. Las proteínas se detectaron después de una exposición de 5 minutos para cualquiera de los reactivos ECL Prime Western Blot Detección (GE Healthcare, Little Chalfont, Inglaterra) o Lumi-Light Western Blot sustrato (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE.UU.) y la película expuesta se desarrolló utilizando una KODAK M35A El procesador X-OMAT (Eastman Kodak, Rochester, NY, EE.UU.). Proteínas detectadas usando anticuerpos anti-humanos primarios de ratón fueron: βIII (ab14545; Abcam, Cambridge, Inglaterra) que se utiliza en una dilución de 1 en 1000, P-gp (ab3366; Abcam, Cambridge, Inglaterra) que se utiliza en una dilución de 1 en 2000 y de cabra anti-actina humana (sc-1616; Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, EE.UU.) se utiliza en una dilución de 1 en 4000. Los anticuerpos secundarios fueron de cabra anti-ratón (115-035-003; Jackson ImmunoResearch Laboratorios Inc., West Grove, PA, EE.UU.), a una dilución de 1 en 10.000 y conejo anti-cabra (305-035-045; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EE.UU.) utilizó a una dilución de 1 en 40.000. Las películas originales escaneadas y las imágenes se importaron en PowerPoint. Las bandas situadas en el rango de tamaño esperado fueron cosechadas de las películas. El tamaño y el contraste de cada figura, de tal modo que todas las cifras coinciden en tamaño y luego se agrupan. El contraste de todo el grupo se ajustó de modo que las bandas podrían ser mejor visualizados y el color era consistente.
Análisis estadístico
GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) se utilizó para crear figuras y realizar análisis estadísticos de los resultados. Se utilizó la prueba T de Student estándar para comparar los resultados de citotoxicidad para cada uno de los análogos relativos al paclitaxel inducidos perfiles citotóxicos; como también para todos los resultados de ensayo citotóxico con y sin otras variables (por ejemplo, verapamilo). Una forma ANOVA (análisis de varianza) se utilizó para demostrar la significación estadística entre la resistencia bajo, intermedio y alto droga en líneas celulares tratados con paclitaxel y derivados.
Simulaciones computacionales
La unión al taxano Binding Site.
las coordenadas del complejo receptor-ligando tubulina-taxano se obtuvieron de la estructura cristalina PDB 1JFF [34], que representa paclitaxel co-cristalizado con la tubulina. Las coordenadas de esta estructura cristalina se utilizaron para construir los complejos de los otros derivados de taxano. Las estructuras se construyen utilizando software Avogadro 1.0.3 [35]. Nueve complejos fueron construidos, incluyendo Tx-A a través de Tx-G, así como paclitaxel y docetaxel como controles. El receptor se preparó mediante la eliminación de la subunidad alfa de 1JFF, ya que no contribuye directamente a la unión de los taxanos. Se añadió la primera residuo de metionina que falta y el C-terminal se tapó con un residuo de N-metilo. El difosfato de guanosina cofactor (PIB) se incluyó también en la estructura y sus parámetros se obtuvieron de Meagher et al. [36] Los estados de ionización de los residuos de proteínas fueron asignados utilizando el servidor PROPKA [37-39]. Los ligandos se parametrizan según el campo de AMBER general de la fuerza (Gaff) [40] y cargas parciales fueron asignados con el método AM1-BCC [41] utilizando el
antecámara
módulo de ámbar 12 [42]. Los complejos se construyen a continuación, utilizando el
tleap
módulo de ámbar 12 en el que la proteína se parametriza usando el campo de fuerza AMBERff12SB [43,44]. El complejo fue solvatado en una caja de octaedro truncado que se extiende 12 Å en cada dirección. A continuación, el complejo se neutralizó mediante la adición de 16 iones de sodio. Se añadieron otros 22 iones sodio y cloruro de lograr una concentración de sal de 100 mM. A continuación, cada complejo se minimizó con restricciones pesados (500 kcal /(mol A)) en la proteína y sin que se mueva en átomos de hidrógeno de 1000 más empinado descenso se ejecuta seguido de 1000 carreras de gradiente conjugado. Otra reducción al mínimo con 3000 carreras gradiente descendente seguido de 3000 carreras de gradiente conjugado se llevó a cabo sin ningún tipo de restricciones. Calentamiento a una temperatura de 300 K bajo volumen constante con movimientos bruscos y las restricciones a la proteína se realizó mediante un termostato Langevin de 20 ps. Densidad de equilibrio a una presión constante de 200 ps se realiza entonces mediante Agitar en átomos de hidrógeno y bajo disminuyendo gradualmente las restricciones sobre los átomos pesados. Esto fue seguido por una fase de producción de 10 ns a 300 K bajo una presión constante, donde se registraron las coordenadas cada 2 ps. Todas las simulaciones se realizaron bajo condiciones de contorno periódicas utilizando la partícula malla Ewald método para el tratamiento de la electrostática de largo alcance. Densidad, temperatura, energía total y RMSD se verificaron para el equilibrio. Los últimos 2 ns de la campaña de producción eran postprocesado para el cálculo de la energía libre de unión utilizando la Mecánica Molecular /Poisson-Boltzmann de superficie (MM /PBSA) [45] o molecular Mecánica /Generalizada la zona del Born de superficie (mm /GBSA) enfoques [46]. Se extrajeron 200 instantáneas uniformemente espaciadas a partir de los últimos 2 ns de la campaña de producción y los usamos para el MM /PBSA y cálculos MM /GBSA. También se realizó un análisis para cada modo normal complejos utilizando 100 instantáneas uniformemente espaciados que se extrajeron los últimos 2 ns de la campaña de producción. Puesto que el análisis modo normal es mucho tiempo, se utilizó un enfoque en el que se trunca la proteína. Específicamente, todos los residuos más allá de 12 Å del ligando fueron truncado, y el análisis se realizó únicamente en el sistema restante. Este enfoque se ha demostrado eficaz y suficientemente precisa por Genheden et al [46]
En nuestro enfoque, se calcula la energía libre de unión de acuerdo con la fórmula:. (1) donde es la energía mecánica molecular medio, incluidas las contribuciones de bonos, el ángulo diedro, de van der Waals y electrostáticas términos. es la energía libre de solvatación calcula resolviendo la ecuación de Poisson-Boltzmann (o Generalizado Born) para obtener la energía libre de solvatación polar y mediante la estimación de la energía libre de solvatación no polar usando un término superficie. -
TS
MM
es el término entropía estimado utilizando el análisis de modo normal. Una vez que la energía libre promedio se calcula para el ligando, receptor, y complejo, la energía de enlace se obtiene mediante la siguiente ecuación:. (2)
La unión a la Nanopore sitio intermedio
A microtúbulos nanoporos modelo fue construido mediante la combinación de datos de microscopía electrónica de microtúbulos (1XRP) [47] con los datos de rayos X para un heterodímero αβ-tubulina (1JFF) [34]. Empezando a partir de los componentes de las proteínas y de nucleótidos del cristal 1JFF, falta residuos (específicamente alfa: 1,35-60 y beta: 1) fueron tomadas de 1Tub [1] y superpuestos en 1JFF. A continuación, se determinó el estado de protonación de los residuos ionizables en 1JFF usando PROPKA y átomos de hidrógeno agregado para obtener un heterodímero completa αβ-tubulina. Por último, este dímero se utilizó para construir una parte de una de microtúbulos a partir de datos de microscopía electrónica de 1XRP. El modelo utilizado fue para el poro tipo 1 [2], y sólo los cuatro monómeros de tubulina adyacentes al poro fueron retenidos.
El modo de unión de paclitaxel al sitio de unión intermedia se tomó de Freedman et al. [2] y superpuestos en la estructura de nanoporos se ha descrito anteriormente, dando como resultado el modelo de nanoporos-paclitaxel usada en este estudio (Fig 2) como una estructura de partida para definir el sitio de unión intermedia en cálculos de acoplamiento. Tenga en cuenta que los contactos interdimer no han sido equilibrada en este modelo. El modo de unión de paclitaxel en el sitio de unión intermedia informado por Freedman et al. difiere de la reportada por Maccari et al. [48], que se encuentra más cerca de a
3-tubulina. Es probable que ambos sitios son estados estables a lo largo de la misma vía de la internalización.
Nanopore se ve desde el exterior de los microtúbulos. El círculo azul indica el sitio de unión intermedia
Docking cálculos se realizaron con el entorno molecular de funcionamiento (MOE; Química Computing Group, Montreal, Canadá).. MOE fue seleccionado para el atraque debido a su protocolo de acoplamiento de ajuste inducido y la capacidad de modelar fácilmente ligandos con diferentes cargos y estados de ionización. Los cuatro heterodímeros que componen el poro tipo 1 se utilizaron para definir el receptor, y cinco taxanos (paclitaxel, Tx-A, Tx-C, Tx-D y Tx-F) se acopló al sitio identificado por Freedman et al. [2]. Debido a la baja pKa de los grupos funcionales ácido carboxílico en Tx-D y Tx-F, estos dos taxanos fueron modelados como agentes tensioactivos aniónicos (desprotonado) para representar mejor su estructura a un pH fisiológico. La puntuación se calcula inicialmente con la función de puntuación Londres dG, reteniendo 30 confórmeros (con duplicados eliminados). Posteriormente, el refinamiento se ha realizado mediante el método de Fuerza y listas de hipótesis adicional utilizando la función de puntuación GBVI /WSA dG. Cuatro protocolos de conexión para diferentes fueron utilizados con distintos tamaños de sitio de unión y ya sea con un flexible o un receptor rígido.
Resultados y Discusión
Uso de la polimerización de tubulina paclitaxel y derivados sintetizados
ensayos de polimerización de tubulina se realizaron utilizando los derivados de paclitaxel para medir
vitro
actividad de polimerización en comparación con el paclitaxel. Estos experimentos utilizados βII y βIII isotipos de tubulina purificados por afinidad a partir de una fuente de cerebro bovino; la α-tubulina era una mezcla de isotipos; estas formas de tubulina se conocen como αβII y αβIII, respectivamente
.
curvas de polimerización se establecieron utilizando paclitaxel y cuatro de sus derivados, ya sea con αβII y αβIII. Las curvas de polimerización a concentraciones de fármaco de 10 mM se muestran en la concentración de fármaco Fig 3A de 10 mM fue la concentración a la que eran más claramente visibles las diferencias entre los efectos de todos los fármacos; Sin embargo se observaron las mismas tendencias en todos los niveles de concentración ensayados (1-16 mM)
.
Isotypically pura tubulina cerebral bovina (αβII o αβIII) a 1,4 mg /ml se incubaron en presencia de las drogas y la absorbancia a 350 nm se midió cada 8 segundos durante al menos 11 minutos. La concentración de cada fármaco fue de 10 mM. PTX es paclitaxel.
Los resultados muestran que el paclitaxel se corresponde con la tasa más alta de ensamblaje de los microtúbulos. Esto es seguido por Tx-A, a continuación, por Tx-C. Tx-D y F-Tx tuvieron valores similares, con las tasas más lentas de ensamblaje de los microtúbulos. Ninguno de los derivados ensayados superó paclitaxel en términos de la velocidad de polimerización de la tubulina. Hubo un aumento en la tasa de ensamblaje para paclitaxel con seguido de Tx-A, a continuación, por Tx-C. Tx-D y F-Tx tuvieron valores similares, con las tasas más lentas de ensamblaje de los microtúbulos
Los resultados no fueron consistentes con las predicciones anteriores [2] y la premisa subyacente se ha descrito para el primer objetivo:. No se observó paclitaxel tener polimerización disminuido con βIII tubulina (la observación fue el reverso de la expectativa), y además Tx-a y Tx-C no tienen el comportamiento esperado. Tampoco fueron los resultados consistentes con la premisa subyacente descrito para el segundo objetivo: Tx-D y Tx-F no eran más activos que el paclitaxel. Por lo tanto, este experimento no es compatible con la importancia de los residuos 275 ó 278, o la función prevista del sitio de unión intermedia en la nanoporos microtúbulos.
La citotoxicidad del paclitaxel análogos contra las líneas celulares de cáncer de mama.