Extracto
El objeto del estudio es identificar los cambios de perfiles de N-glucano asociados con el cáncer gástrico y explorar el impacto de núcleo-fucosilación el comportamiento biológico de las células de cáncer gástrico humano. Se reclutó un total de 244 sujetos, incluyendo el cáncer gástrico, úlcera gástrica y control sano. perfiles de N-glicanos a partir de proteínas de suero y totales en los tejidos gástricos se analizó por electroforesis capilar fluoróforo asistida secuenciador de ADN asistida. La abundancia de los residuos totales de núcleo fucosilado y la expresión de las enzimas que participan en el núcleo-fucosilación se analizaron con blot lectina, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa, transferencia de Western, tinción inmunohistoquímica y tinción de lectina-histoquímica. Los plásmidos recombinantes de transportador de GDP-fucosa y α-1,6-fucosiltransferasa (Fut8) se construyeron y se transfectaron en líneas celulares de cáncer gástrico BGC-823 y SGC-7901. CCK-8 y el ensayo de curación de la herida se utilizaron para evaluar el impacto funcional de la modulación de núcleo-fucosilación sobre la proliferación celular y la migración. perfiles séricos característica de N-glicano fueron encontrados en el cáncer gástrico. En comparación con el control sano, una estructura de abundancia trianntenary, el pico 9 (NA3Fb), fue significativamente mayor en el cáncer gástrico, mientras que la abundancia total de residuos del núcleo fucosilado (sumfuc) se redujo. estructuras de núcleo fucosilado, peak6 (NA2F) y peak7 (NA2FB) habían fallecido en los tejidos tumorales gástricas si se compara con la de los tejidos no tumorales adyacentes. Consistentemente, la lente culinaris aglutinina (LCA) proteínas unión a se redujeron significativamente en el suero de cáncer gástrico, y el nivel de proteína de Fut8 se redujo significativamente en los tejidos tumorales gástricas en comparación con la de los tejidos no tumorales adyacentes. Regulación al alza del PIB-Tr y Fut8 podría inhibir la proliferación, pero no tuvo una influencia significativa sobre la migración de BGC-823 y las células SGC-7901. Core-fucosilación es el regulado en el cáncer gástrico. Upregulation de núcleo-fucosilación podría inhibir la proliferación de las células de cáncer gástrico humano
Visto:. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Usted Q, Yi C-H, et al. (2014) Disminución de Core-fucosilación contribuye al desarrollo de malignidad del cáncer del estómago. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10.1371 /journal.pone.0094536
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Agosto, 2013; Aceptado: March 17, 2014; Publicado: 14 de abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81201697, 81101639 y 81271925 Nº); Ciencia y Tecnología Comisión de la municipalidad de Shanghai (núm 10ZR1439100 y Nº 11JC1416400) .Los donantes no participó en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses.: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. - [3], particularmente frecuente en muchos países asiáticos, especialmente china [4]. La glicosilación de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más comunes a las proteínas [5]. Los glicanos se pueden unir a proteínas ya sea a través de un grupo amida (glicosilación ligada a N) o un grupo hidroxilo (O-glicosilación), que se producen a través de diferentes vías de biosíntesis y potencialmente tener funciones independientes [6]. glicosilación ligada a N desempeña papeles fundamentales en muchos procesos biológicos tales como la adhesión celular, la migración celular, y la transducción de señales [7]. La expresión anormal de glicoproteínas N-ligada se ha observado en varias enfermedades [8] - [10]. Tras la caracterización en profundidad de las glicoproteínas N-ligados y los cambios de glicosilación asociados a la enfermedad, varios se han desarrollado metodologías. En nuestro estudio anterior, hemos identificado algunos marcadores de N-glucano en el carcinoma heptatocellular (CHC) y el cáncer de colon utilizando una electroforesis capilar a base de ADN denominada electroforesis capilar fluoróforo asistida secuenciador asistida (DSA-FACE) [11]. Además, se ha informado de que α-1, 6-fucosiltransferasa (Fut8) la actividad y la expresión se incrementa en varios cánceres humanos, lo que sugiere un papel de esta enzima en el desarrollo y progresión del tumor, tales como HCC [12], cáncer colorrectal [ ,,,0],13], el cáncer no microcítico de pulmón de células [14] y de ovario adenocarcinoma seroso [15]. Altered núcleo-fucosilación es uno de la modificación glicosilada anormal más importante identificado en tumores malignos. Fut8 cataliza la transferencia de fucosa de guanosina difosfato (GDP) -fucose a la GlcNAc más interna de híbridos y complejos oligosacáridos ligados a N a través de un α-1,6-enlace, resultando en glicoproteínas básicas fucosilados [16] - [17] y alteración de la función biológica de las glicoproteínas resultantes [18]. Aunque muchos estudios han informado de la asociación entre la alteración de núcleo-fucosilación y otros tumores agresivos, a nuestro conocimiento, sigue siendo desconocida la influencia de núcleo-fucosilación en cáncer gástrico. En este estudio, se analizaron los perfiles de N-glicanos con DSA-FACE en ambas muestras de suero de cáncer gástrico, úlcera gástrica, controles sanos y proteínas de los tejidos de tumores y que no son tumores adyacentes. A continuación, extender la investigación funcional a los glycosylations específicos identificados.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de China de Recursos Humanos en la Segunda Universidad médica militar. consentimiento informado úlcera gástrica todos los participantes en el estudio siempre y escritos.
Estudio de la población
En total, 105 pacientes con cáncer gástrico (n = 80) y (n = 25) fueron reclutados entre diciembre de 2007 y octubre 2010 en el hospital Changzheng de la Segunda Universidad médica Militar (Shanghai, china). Todos los casos con cáncer gástrico fueron confirmados histopatológicamente por 2 patólogos y los casos con úlcera gástrica reclutado inscrito fueron confirmados por gastroscopio. Los pacientes con cáncer gástrico que recibieron quimioterapia preoperatoria, y que tenían otras enfermedades que incluyen infecciones fueron excluidos del estudio. Las muestras de suero se obtuvieron antes de resecciones quirúrgicas. Para un grupo de control, 139 emparejados por edad, voluntarios sanos se inscribieron entre un grupo de individuos libres de cáncer que visitó el mismo hospital para un examen físico regular y que se ofrecieron voluntarios para unirse a la investigación durante el mismo período. Hemos definido un individuo sano como alguien que se considera libre de enfermedades (incluyendo sin antecedentes de cáncer) en el chequeo de salud. Las siguientes características clínicas de los sujetos se obtuvieron en el momento de la recogida de la sangre entera. Un resumen de los datos de estos sujetos se proporciona en la Tabla 1. La progresión de todos los pacientes con cáncer gástrico se clasificó según la Unión Internacional para el Control del Cáncer (UICC) Criterios de estadificación TNM para el cáncer gástrico, 13 pacientes (16,25%) tenían etapa I, 24 pacientes (30,00%) en estadio II, 30 pacientes (37,5%) presentaron en estadio III y 13 pacientes (16.25%) en estadio IV. La edad media de todos los pacientes fue 54,35 ± 6,69 entre ellos 60 hombres y 20 mujeres. Se recogió suero usando un protocolo estándar de la sangre entera, se trató por centrifugación a 10.000 g durante 20 minutos, y se almacenó a -80 ° C.
perfiles de N-glicanos a partir de proteínas de suero
análisis de proteínas de suero de N-glucano se realizaron como se describe anteriormente [11]. Brevemente, los N-glicanos presentes en las proteínas en 2 l de suero fueron liberados con el péptido N-glicosidasa F (PNGasaF) (New England Biolabs, Boston, Mass) y luego marcadas con 8-aminonaphtalene-1, 3, 6 ácido trisulfónico (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, California) ácido .Sialic se eliminó con Arthrobacter ureafaciens sialidasa (Roche Bioscience, Palo Alto, California), y las muestras procesadas se analizaron con la tecnología DSA-FACE usando un ABI3500 genético basado en electroforesis capilar Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las 9 picos más intensos que se detectaron en todas las muestras (en conjunto, estos picos representaron & gt; 90% del total de suero N-glicanos) se analizaron utilizando el software GeneMapper (Applied Biosystems). Cada estructura de N-glicanos se describe numéricamente por la normalización de su altura a la suma de las alturas de todos los picos.
Las muestras de tejido
Todos los tejidos se utilizan de acuerdo con el Reglamento de la Junta de Revisión Institucional de la Segunda Universidad médica Militar. Las muestras de tejido se obtuvieron from10 de 80 pacientes con cáncer gástrico. Las muestras de tejido incluyeron 2 rebanadas, un tejido tumoral y un tejido no tumoral adyacente. muestras de tejidos emparejados (aproximadamente 0,5 × 0,5 × 0,5 cm
3, duplicado para cada muestra) seleccionado se congelaron inmediatamente a -80 ° C para la extracción de ARN y proteínas o fija en formalina al 10% durante 24 horas y luego procesados en un bloque embebido de parafina y se almacena a temperatura ambiente durante la tinción histoquímica.
N-glicanos de perfiles de proteínas del tejido y el análisis estructural utilizando digestión exoglicosidasa
Las proteínas se extrajeron de aproximadamente 25 mg de muestras de tejido congeladas . Las muestras de tejido fueron suspendidos y pestled en tampón de lisis que contiene inhibidores de la proteasa cóctel (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). partes no lisadas se eliminaron por centrifugación (12.000 g durante 10 minutos a 4 ° C) dos veces. La concentración de las proteínas solubilizadas se determinó utilizando el kit BCA (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), y las muestras de proteína se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Un total de 40 mg proteínas del tejido se utiliza para establecer de N-glicanos de perfiles utilizando ordinario método de perfiles de N-glicanos el mismo que el realizado en el suero se ha descrito anteriormente. Para identificar core-α-1, las estructuras de N-glucano 6 fucosilados-, un número adecuado de pisos-etiquetados N-glucanos se digirieron con tanto Arthrobacter ureafaciens sialidasa y riñón bovino α-1, 6-fucosidasa (Prozyme, San Leandro, CA , ESTADOS UNIDOS). La tecnología DSA-FACE se utilizó para analizar los productos de la digestión y el software GeneMapper se utilizó para analizar la altura de los picos.
extracción de RNA y en tiempo real PCR cuantitativa
ARN totales se extrajeron de congelados tejidos y células, usando el kit de extracción de ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Axygen Biosciences, Hangzhou, china). La pureza y la concentración de ARN se determinó por espectrofotómetro (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), y luego se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. El cDNA se sintetizó usando el kit ReverTra Ace-α-RT-PCR (Toyobo Co., Osaka, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores se diseñaron utilizando el programa Primer Express (Applied Biosystems; las secuencias se muestran en la Tabla S1). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó usando el tiempo real SYBR Green PCR Master Mix Kit (Toyobo Co., Osaka, Japón) y se analizó en 7300 el sistema de PCR de Applied Biosystems en tiempo real (ABI, Foster City, CA, EE.UU.) . Todos los ensayos se llevaron a cabo de forma independiente por triplicado. PCR de ciclo consistió en la desnaturalización a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y a 59 ° C o 55 ° C durante 15 segundos, y la detección de 45 segundos a 72 ° C. La cantidad relativa de los transcritos de guanosina difosfato (GDP) transportador -fucose (PIB-Tr) Fut8 o en cada muestra se normalizó a la limpieza de genes β-actina y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) restando el ciclo. Los niveles de expresión génica se determinaron utilizando el método Delta-Delta Ct. Los valores absolutos de transcripción de expresión más allá de 40 ciclos se consideraron por debajo de los niveles detectables. Derretir curvas se comprobaron para cada reacción para garantizar que un solo producto se amplificó.
Western blot y lectina blot
Las proteínas se extrajeron a partir de tejidos congelados con el procedimiento descrito anteriormente, y un total de 50 proteínas g se separaron por electroforesis en 10% de dodecil de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Los geles se tiñeron con azul de Coomassie G250 o las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa () para la detección de Fut8 o el porcentaje de proteínas del núcleo fucosilado. Para las muestras de suero, se utilizaron un total de 85 casos de cáncer gástrico (n = 80), úlcera gástrica (n = 25) y controles sanos (n = 30) para SDS-PAGE y lectina-blot. Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 ° C con 5% de proteína de leche sin grasa o 5% de albúmina de suero bovino en tampón Tris-solución salina tamponada [NaCl 140 mM, 10 mM Tris-HCl (TBS)] y después se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con 1:100 diluida anticuerpo Fut8 anti-humana (15C6, anti-humano Fut8, Fujirebio Corp., Japón) o 5 mg /ml de lente biotinilado culinaris aglutinina a (LCA) (vector Laboratories, Burlingame, CA) en TBS que contiene 0,05% Tween-20 (tampón de TBST), y después se incubó con una dilución 1:10,000 de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) o IRDye 800CW-estreptavidina (LI-COR Biosciences) durante 1 hora a temperatura ambiente . Las membranas se revelaron con el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey. actina se utilizó anti-beta (1:2000) para el anticuerpo de referencia interno de Western-blot. albúmina purificada se utilizó como control negativo para la transferencia de lectina y proteínas totales se tiñeron con azul de Coomassie se utilizó para calcular el porcentaje de proteína del núcleo fucosilado.
inmunohistoquímica (IHC) y la tinción histoquímica de lectina tinción
Las muestras de tejido fijadas embebidas en parafina se cortaron en rodajas de 4 mm de enfermos para la tinción inmunohistoquímica para Fut8 y tinción histoquímica de lectina-LCA. Después de someterse a desparafinación, rehidratación, bloqueo de la peroxidasa endógena, y la recuperación de antígeno (mM Tris 10 mM EDTA /1, pH 9,0, autoclave tratada), las muestras se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra Fut8 humana (1:100) o LCA biotinilado (1 :500) durante la noche a 4 ° C y, a continuación, con rábano picante anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa o estreptavidina marcada con fluoresceína a 37 ° C durante 30 min. Los núcleos se counterstained con hematoxilina o DRAQ5. control negativo se compone de secciones histológicas tratados idénticamente con IgG de ratón para reemplazar ratón Fut8.
Líneas celulares y cultivo
Las líneas celulares de cáncer gástrico humano, BGC-823 y SGC-7901, se adquirieron del Instituto de Shanghai de Biología celular, Academia de Ciencias de china y se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2 en medio RPMI 1640 y medio DMEM (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), respectivamente, con un 10% de SFB, glutamina al 1%, y la solución de antibióticos al 1%.
Construcción de PIB-Tr y Fut8 plásmidos recombinantes y transfección de células de cáncer gástrico
el pEGFP-N1-PIB-Tr y el pEGFP-N1 -Fut8, el plásmido vector de codificación humana PIB-Tr o Fut8, se generó mediante la inserción de PIB-Tr o Fut8 ADNc en un vector pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EE.UU.), que contiene un promotor CMV y promotor temprano de SV40, así como el gen de resistencia a neomicina /kanamicina de Tn5. El esqueleto del vector también contiene un origen de replicación de SV40 en células de mamífero. El sitio de clonación múltiple (MCS) está al lado del promotor temprano inmediato del CMV. El gen PIB-Tr o Fut8 humano fue clonado a partir del ARNm se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) a partir de tejido de hígado humano mediante la realización de RT-PCR usando los cebadores (Tabla S2) en la que el Xho I o Kpn I sitios de restricción se incluyeron, digestión con Xho I o Kpn I y ligando en el pEGFP-N1. El pEGFP-N1-PIB-Tr o el pEGFP-N1-Fut8 se transfectaron en Escherichia coli DH5a para la amplificación y secuenciación del ADN se utilizó para garantizar la fidelidad. El ADN del plásmido se preparó usando el Qiagen DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se transfectaron en las líneas gástrico humano de células de cáncer, BGC-823 y SGC-7901 a 80% de confluencia y 5 × 10
5 células por pocillo en una placa de seis pocillos usando el Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU. ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas que expresaban gen diana fueron confirmados por RT-PCR cuantitativa.
proliferación de las células de ensayo
Ensayos de proliferación celular se realizaron con Kit-8 de conteo celular (CCK-8, Dojin, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El crecimiento celular se controló cada 24 h durante 5 días, y para cada punto de tiempo se llevó a cabo por duplicado. Se midió la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm.
cicatrización de heridas ensayo
Para el ensayo de cicatrización de la herida, las líneas celulares de cáncer gástrico humano, BGC-823 y SGC-7901 ( 1 × 10
5 células /35 × 11 mm platos) se sembraron y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C y luego transfectadas con plásmidos recombinantes. Después de alcanzar la confluencia, la capa celular en cada placa se rascó con una punta de pipeta de plástico. La migración de las células en el borde de la cero se analizó a las 0, 24 y 48 horas, las imágenes fueron capturadas y analizadas por microscopio de fluorescencia Leica y emparejado software de análisis de imágenes (Comet Assay IV sistema de análisis de imágenes, PI, UK).
rutina tumor fabricante
los datos clínicos y bioquímicos de los pacientes se resumen en la Tabla 1. las pruebas bioquímicas de rutina se midieron utilizando métodos estándar y reactivos emparejados (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokio, Japón) . índices de marcadores tumorales, incluyendo antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9), antígeno carcinoembrionario (CEA), citoqueratina 19 (CK19), CA125 y CA724, se determinaron en un modular de Roche E170 con reactivos emparejados.
Análisis estadístico
Todas las variables cuantitativas se expresan como medias ± desviaciones estándar a menos que se indique lo contrario. Las variables cuantitativas se compararon con las pruebas de la t de Student, análisis de varianza (ANOVA), o pruebas no paramétricas. coeficientes de correlación de Pearson (Spearman coeficientes de correlación se calcularon para las variables categóricas ordinales) y sus probabilidades asociadas (
p
) se utilizaron para evaluar las correlaciones entre los parámetros. Todos los reportados
p
valores fueron de 2 colas, y
p
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 16.0 para el software estadístico de Windows (SPSS Inc.).
Resultados
Diferentes suero de N-glicanos patrones en el cáncer gástrico, úlcera gástrica y controles sanos
Uso de DSA-FACE, se examinaron los perfiles de N-glicanos en sueros desialilada de pacientes con cáncer gástrico (n = 80), úlcera gástrica (n = 25), y la edad se correspondía con los individuos sanos (n = 139). Hemos cuantificado y comparado estadísticamente entre estos picos 3 grupos diferentes. Al menos 9 estructuras de N-glucano (picos) se identificaron en todas las muestras (Figura 1A). El análisis estructural de estos N-glicanos se publicó anteriormente por Callewaert [11]. La abundancia relativa media de estas estructuras de N-glucano se describe en la Tabla 2. La abundancia de estructuras en los picos 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 9 revelaron diferencias estadísticamente significativas entre los cáncer gástrico, úlcera gástrica, y el control sano grupos, lo que indica que los diferentes patrones de N-glicanos aparecieron en diferentes condiciones fisiopatológicas. En comparación con el grupo de control sano, peak5 (bigalacto glicano biantenario, NA2) y peak9 (ramificación α-1,3-glucano triantenario fucosilado, NA3Fb) fueron elevados (P & lt; 0,001) (Figura 1B); mientras que los picos fucosilados sin núcleo, como peak2 (agalacto núcleo-α-1,6-glucano fucosilado bisectriz biantenario, NGA2FB), peak3 (solo agalacto glicanos biantenarios núcleo-α-1,6-fucosilado, NG1A2F), peak6 (bigalacto núcleo glicanos fucosilados--α-1,6 biantenarios, NA2F) y peak7 (bigalacto núcleo-α-1,6-glucano fucosilados bisectriz biantenario, NA2FB) se redujo en el grupo de cáncer gástrico (P & lt; 0,001). Del mismo modo, la abundancia de glicanos estructura de núcleo fucosilado nombre sumfuc (indica estructuras totales de núcleo fucosilado, incluyendo pico 1, 2, 3, 4, 6, y 7) fue significativamente menor en el cáncer gástrico (P & lt; 0,001) (Figura 1C ). El grupo de cáncer gástrico se clasifica en 4 subgrupos de acuerdo con la estadificación TNM de la UICC para el cáncer gástrico. La abundancia estructura y sumfuc no varió significativamente entre los 4 subgrupos diferentes; Sin embargo, sumfuc se disminuyó gradualmente con etapas de progresión del cáncer gástrico (Tabla 3).
(A) Los tres paneles (de arriba a abajo) son típicas de suero N-glicanos perfiles de control sano, úlcera gástrica y gástrica tipos de cáncer. Nueve picos principales se pueden identificar. Las estructuras de los picos de N-glicano se muestran debajo del gráfico. Los niveles en picos 5 y 9 están elevados (hasta flechas), y se disminución de los niveles en los picos 2, 3, 4, 6, 7 y 8 (flechas hacia abajo) en el cáncer gástrico en comparación con la de los controles sanos y enfermedades. Los picos 1, 2, 3, 4, 6 y 7 son glicanos de núcleo fucosilado. (B) El valor de peak9 (ramificación triantenario fucosilado-α-1,3 N-glicanos, NA3FB) se eleva de forma secuencial a partir de controles sanos, úlcera gástrica para el cáncer gástrico (P & lt; 0,001), barras de error representan intervalos de confianza del 95% (95 IC%) para los medios. (C) El valor de sumfuc se reduce en el cáncer gástrico (P & lt; 0,001). Sumfuc indica la abundancia total de glicanos de núcleo fucosilado estructura (picos 1, 2, 3, 4, 6 y 7). Las barras de error representan IC del 95% para los medios.
Correlación entre la N-glucanos y marcadores tumorales rutina
Hasta la fecha, CEA todavía se utiliza ampliamente para el cribado y seguimiento de cáncer gástrico. Se analizaron las correlaciones entre los marcadores de N-glicanos individuo con CA19-9, CEA, CK19, CA125 y CA724. El análisis de correlación de Pearson indicó que CEA se asoció positivamente con pico 1 (r = 0,19; P & lt; 0,01), y peak9 (r = 0,28; P & lt; 0,01), mientras que negativamente con peak6 (r = -0,18; P & lt; 0,01) y peak8 (r = -0,23; p & lt; 0,01) (Tabla 4)
Comparación de sumfuc entre el cáncer gástrico y otros cánceres del sistema digestivo
Anteriormente hemos estudiado los perfiles de N-glucano. de carcinoma hepatocelular (HCC) [19] y el cáncer colorrectal (CRC) [20]. La abundancia de sumfuc reveló diferencias estadísticamente significativas entre el cáncer gástrico (41,32 ± 6,39), HCC (50.99 ± 8.39), CRC (45,33 ± 5,96) y controles sanos (47.67 ± 5.08) grupos (P & lt; 0,001, Tabla 5), lo que indica que nivel diferente de núcleo-fucosilación apareció en los cánceres de diferentes orígenes tisulares. Entre los 4 grupos, el nivel de núcleo-fucosilación en el CHC fue la más alta, mientras que el nivel fucosilación en el cáncer gástrico fue el más bajo, y fue incluso menor que en controles sanos.
N-glicanos de perfiles de patrones en los tejidos tumorales gástrico y no tumorales
perfiles de N-glicano se examinaron en proteínas desialilada partir de tejidos tumorales gástrico y no tumorales. Los tres más abundante bigalacto glicanos biantenarios mostraron en el suero, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) y preak7 (NA2FB) se identificaron también en las proteínas del tejido (Figura 2A). Peak6 y Peak7 se confirmaron a ser estructuras de núcleo fucosilado dervied de peak5 después tratados con núcleo-α-1, la digestión 6-fucosidasa (Figura 2A). Las alturas de estos tres picos fueron analizados utilizando el software GeneMapper. La relación de peak6 a peak5 fue menor en los tejidos tumorales que en los tejidos adyacentes no tumorales (0,83 ± 0,18 vs. 1,05 ± 0,42, Figura 2B), así como la relación de peak7 a peak5 (0,13 ± 0,06 vs. 0,16 ± 0,04, Figura 2C). Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas (P & gt; 0,05). Entre los tejidos tumorales y no tumorales
(A) Los cinco paneles (de arriba a abajo) se desialilados perfiles de N-glucano de suero como referencia, perfiles desialilada N-glicanos a partir de tejidos tumorales, desialilada perfiles de N-glicanos a partir de tejidos tumorales tratadas con la digestión α-1,6-fucosidasa, desialilada perfiles de N-glicanos a partir de tejidos no tumorales adyacentes, y desialilada perfiles de N-glicano de no adyacentes tejidos tumorales tratados con digestión α-1,6-fucosidasa. Las líneas de flechas indican los cambios de picos de N-glucano tratadas con la digestión α-1,6-fucosidase. Peak6 y peak7 eliminan hacia adelante después de la digestión α-1,6-fucosidase, que reveale que peak5, 6 y 7 tienen las mismas estructuras que en el suero, y peak6 y peak7 son fucosilados α-1,6 N-glucanos. (B) El valor de peak6 /peak5 se disminuye en los tejidos tumorales, pero la diferencia no es estadísticamente significativa. Las barras de error representan CI 95% para medios. (C) El valor de peak7 /peak5 también disminuye en los tejidos tumorales, pero la diferencia no es estadísticamente significativa.
Disminución de los niveles de fucosilación total del núcleo identificadas en ambos sueros y tejidos de cáncer gástrico
desde ACV puede reconocer específicamente las glicoproteínas con ligada fucosilado-α-1,6 N-acetil-D-glucosamina-asparagina (GlcNAc-Asp) en el núcleo trimanosilo, se investigó el núcleo de las proteínas totales del suero y fucosilados tejidos de cáncer gástrico utilizando LCA para validar el hallazgo en DSA-FACE. En el suero, el nivel de residuos de fucosa de núcleo de unión de LCA-fue menor en el cáncer gástrico que la de la úlcera gástrica y controles sanos (Figura 3A). La abundancia total del núcleo fucosa también tendió a ser menor en los tumores gástricos en comparación a la de los tejidos adyacentes apareados (Figura 3B). Para determinar si la alteración de fucosilación total del núcleo en el tejido tumoral gástrico es relevante a la alteración de la ruta de biosíntesis de glicosilación, RT-PCR cuantitativa se utilizó para analizar la abundancia de mamíferos Fut8 y PIB-Tr en los tumores gástricos y de los tejidos adyacentes. Los resultados revelaron que no se observaron diferencias significativas de Fut8 y expresión PIB-Tr ARNm entre los tumores y los tejidos adyacentes (Figura 3C y 3D). La abundancia relativa de proteína Fut8 fue ilustrado mediante Western blot (datos en bruto se muestra en la Figura S1). El Fut8 en los tejidos adyacentes era significativamente más alta que en los tejidos tumorales (P & lt; 0,05) (Figura 3E). La inmunohistoquímica reveló que la Fut8 se expresa fuertemente positiva en las fronteras luminales de las células gástricas no tumorales (Figura 4B), sin embargo, expresó débilmente positiva en las células tumorales (Figura 4A). La expresión de glicoproteínas básicas fucosilados unión LCA-fue mayor en las células gástricas no tumorales que en las células tumorales (Figura 4C, 4D). Por lo tanto, se identificó el nivel de fucosilación total del núcleo disminuido en ambos sueros y en los tejidos de cáncer gástrico.
(A) transferencias de lectina de proteínas de suero se probaron con LCA. El eje horizontal representa los grupos experimentales: control sano (n = 30), úlcera gástrica (n = 25), y el cáncer gástrico (GC) (n = 30); el eje vertical indica la relación de proteínas fucosilados a las proteínas totales. El nivel de proteínas fucosilados en el cáncer gástrico es la más baja entre los 3 grupos (P & lt; 0,001). Las transferencias (B) de lectina de las proteínas del tejido se sondearon con LCA. El eje horizontal representa los grupos experimentales: los tejidos tumorales (n = 10) y los tejidos adyacentes (n = 10). El eje vertical indica la relación de las proteínas fucosilados a las proteínas totales. El nivel básico fucosilados fue menor en los tumores gástricos, pero la diferencia no mostró significación estadística (p & gt; 0,05). (C) y (D) relativa de ARN mensajero (ARNm) niveles de expresión de Fut8 o PIB-Tr en los tejidos se midieron por RT-PCR cuantitativa. El eje horizontal representa los grupos experimentales: los tejidos tumorales (n = 10) y los tejidos adyacentes (n = 10). El eje vertical indica los niveles relativos de expresión de Fut8 o GDP-Tr. La diferencia entre los grupos no fue estadísticamente significativa (P & gt; 0,05). (E) La abundancia relativa de proteína Fut8 se ilustran mediante Western blot. El eje horizontal representa los grupos experimentales: los tejidos tumorales (n = 9) y los tejidos adyacentes (n = 9). El eje vertical indica los niveles relativos de proteína Fut8. La abundancia relativa de proteína Fut8 en los tejidos adyacentes era significativamente más alta que en los tejidos tumorales (P & lt; 0,05).
(A) La tinción inmunohistoquímica con Fut8 en las células tumorales (200 ×), la expresión de Fut8 es débilmente positivo. (B) La tinción inmunohistoquímica con Fut8 en células gástricas no tumorales (200 ×), la expresión de Fut8 es fuertemente positiva. tinción (C) lectina-histoquímica con LCA en las células tumorales, bar 75 m, la expresión de las proteínas del núcleo fucosilado unión LCA-positivo débil. (D) tinción histoquímica de lectinas-con LCA en células no tumorales gástricas, bar 75 m, la expresión de las proteínas del núcleo fucosilado es fuertemente positiva.
Efecto de Fut8 y el PIB-Tr sobre la proliferación y la migración en líneas celulares de cáncer gástrico humano
Las líneas celulares de cáncer gástrico humano, BGC-823 y SGC-7901 se utilizaron en el estudio in vitro. Desde BGC-823 expresa un menor nivel de PIB Tr-SGC-7901, mientras que expresa el nivel inferior de Fut8 en nuestra investigación piloto, pEGFP-N1-PIB-Tr se transfectó a CGF-823 para la sobreexpresión de PIB-Tr y pEGFP-N1 fue Fut8 transfectadas en SGC-7901 para que sobreexpresan Fut8. expresiones recombinantes fueron alcanzados con éxito muestran mediante la expresión del indicador gen GFP (Figura S2). Para examinar la posible participación del PIB-Tr y Fut8 en la proliferación tumoral y la migración, BGC-823 y las células SGC-7901 se investigaron después de la transfección usando CCK-8 y la cicatrización de heridas ensayo de migración, respectivamente. Los resultados mostraron que la regulación al alza del PIB-Tr disminuyó BGC-823 proliferación en 2-5 días después de la transfección y la regulación positiva de Fut8 disminución de la proliferación SGC-7901 a los 2 días después de la transfección (Figura 5A y 5B). Estos resultados indican que la alta expresión del PIB-Tr y Fut8 podría suprimir la proliferación de células de cáncer gástrico humano. Herida ensayo de curación demostrado que el PIB-Tr y Fut8 no tienen una influencia significativa sobre la migración en BGC-823 y SGC-7901 a las 48 h después del tratamiento (Figura 5C y 5D).
(A) y (B) La proliferación de BGC-823 células y células SGC-7901 después de la transfección con pEGFP-N1-PIB-Tr y pEGFP-N1-Fut8, respectivamente, se analizó mediante ensayos (CCK-8) Cell Counting Kit-8. Los resultados representativos de cuatro experimentos independientes se muestran. * P & lt; 0,05 comparado con el grupo control. (C) y (D) La cicatrización de la herida ensayo de migración de células BGC-823 después de la transfección con pEGFP-N1-PIB-Tr, así como células SGC-7901 después de la transfección con pEGFP-N1-Fut8. La distancia de separación (micras) en el ensayo de migración se puede evaluar cuantitativamente el uso de softwares. Los resultados representativos de 3 experimentos independientes se muestran. P & gt;. 0,05 en comparación con el grupo de control
Discusión
La glicosilación es una de las modificaciones post-traduccionales más comunes aparecido en aproximadamente 70% de todas las proteínas conocidas. Las alteraciones en la glicosilación desempeñan un papel en un conjunto diverso de fenómenos biológicos, tales como metástasis de células tumorales, la comunicación intracelular y la inflamación [21] - [23]. Más y más estudios indican que las alteraciones de la glicosilación y los niveles de las actividades glicosiltransferasas derivadas de la transformación maligna son relevantes para tumores malignos humanos [24] - [25].