Extracto
El análisis molecular de las células de la orina proporciona un enfoque práctico para la detección no invasiva de cáncer de vejiga. El uso práctico de las pruebas basadas en células urinarias a menudo se ve obstaculizada por dificultades en el manejo y análisis de grandes volúmenes de muestra, la necesidad de un procesamiento rápido de las muestras para evitar la degradación del contenido celular, y una baja sensibilidad debido a un alto fondo de las células normales. Se presenta un dispositivo de filtración, diseñado para uso doméstico o en el punto de atención, lo que permite la recopilación, almacenamiento y transporte de las células urinarias. Una característica especial de este dispositivo es un cartucho extraíble que aloja un filtro de membrana, que después de la filtración de la orina pueden ser transferidos a una unidad de almacenamiento que contiene una solución de conservación apropiada. En experimentos de adición, el uso de este dispositivo proporciona una recuperación eficaz de las células de cáncer de vejiga con eliminación de & gt; 99% de las células de menor tamaño en exceso. El rendimiento del dispositivo se evaluó adicionalmente mediante análisis basado en el ADN de las células recogidas de orina de 57 pacientes sometidos a resección transuretral siguientes cistoscopia flexible que indica la presencia de un tumor. Todas las muestras fueron analizadas para
FGFR3
mutaciones y siete marcadores de metilación del ADN (
BCL2
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CCNA1
,
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2
,
SALL3
y
VIM
). En el grupo de pacientes en los que un tumor de células de transición se confirmó en la evaluación histopatológica, el ADN de orina fue positivo para uno o más marcadores en 29 de los 31 casos (94%), incluyendo 19 con
FGFR3 mutación
(61% ). En el grupo de pacientes con histopatología benigna, el ADN de orina fue positivo para los marcadores de metilación en 13 de los 26 casos (50%). Sólo un paciente en este grupo fue positivo para un
FGFR3
mutación. Este paciente tuvo una etapa Ta tumor resecado 6 meses más tarde. La capacidad para recoger, almacenar y enviar las células de diagnóstico de la orina usando el dispositivo presentado puede facilitar la prueba no invasiva para el cáncer de vejiga
Visto:. Andersson E, Dahmcke CM, Steven K, Larsen LK, Guldberg P ( 2015) para el dispositivo de filtración en el sitio de recolección, almacenamiento y envío de las células de la orina y su aplicación a ADN basada en detección de cáncer de vejiga. PLoS ONE 10 (7): e0131889. doi: 10.1371 /journal.pone.0131889
Editor: Jorg Tost, CEA-Institut de génomique, Francia |
Recibido: 1 de octubre de 2014; Aceptado: June 8, 2015; Publicado: 7 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Andersson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio recibió apoyo donación de la Fundación de caramelo
Conflicto de intereses:. KS y PG se nombran inventores en una solicitud de patente presentada por la Investigación del cáncer Technology Limited, el cual se refiere al dispositivo descrito en este artículo: número de publicación WO2015036781; número de solicitud PCT /GB2014 /052776; Fecha de publicación 19 Mar 2015. Esta patente no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El análisis de células raras presentes en muestras de fluidos biológicos complejos ofrece una potencialmente poderosa herramienta de diagnóstico y evaluación de una serie de enfermedades y condiciones. En particular, el aislamiento, la cuantificación y la prueba de aguas abajo de las células cancerosas presentes en el cuerpo del paciente muestras de fluido son muy prometedores para la detección no invasiva y caracterización de tumores para guiar las decisiones de diagnóstico y terapéuticos. Un enfoque común para el diagnóstico del cáncer a través de muestreo mínimamente invasiva es mediante el aislamiento de las células tumorales intactas o ADN tumoral libre de células a partir de muestras de sangre periférica [1,2]. La capacidad de analizar el material obtenido de tumores circulantes se ha avanzado rápidamente por los grandes avances tecnológicos y el descubrimiento de biomarcadores altamente informativos, incluyendo algunos que representan dianas para terapias contra el cáncer de precisión [3].
Para los cánceres urológicos tales como la vejiga cáncer, orina proporciona una fuente más conveniente de material de diagnóstico. Las células se desprenden de los tumores localizados en el tracto urinario se acumulan en la vejiga y pueden ser recogidos y analizados de forma no invasiva por la orina de muestreo [4]. citología de orina se ha utilizado ampliamente para el diagnóstico de cánceres urológicos, en particular como un complemento de la cistoscopia para la detección y la vigilancia del cáncer de vejiga. Sin embargo, para los tumores de vejiga de bajo grado, la citología tiene una sensibilidad tan bajo como 10-20% [5] y ha sido abandonada por muchos centros. Varias pruebas de orina para el cáncer de vejiga han sido aprobados por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA), pero su rendimiento es todavía inferior a la cistoscopia en términos de sensibilidad (tasa de verdaderos positivos) y especificidad (tasa real negativa) [6]. Mayor rendimiento se puede lograr mediante el uso de biomarcadores urinarios basadas en genes tales como mutaciones del conductor y alteraciones de metilación del ADN, que son el cáncer específico y menos afectado por la inflamación y otras condiciones benignas [7-12]. Con el advenimiento de métodos mejorados para la detección y cuantificación de moléculas de ADN raros, incluyendo secuenciación de próxima generación y PCR digital [13], la sensibilidad de la detección basada en el ADN de los tumores de vejiga se puede aumentar aún más.
A pesar de su promesa, el uso de ensayos basados en células urinarias para la detección de cáncer de vejiga está limitada por problemas inherentes de recolección y procesamiento de muestras de orina. El procedimiento más común para analizar el contenido celular de orina implica la sedimentación de las células por centrifugación. Para evitar la lisis celular y la degradación de los componentes celulares, las muestras deben ser procesadas de forma rápida después de la micción. Por estas razones prácticas, el muestreo se realiza generalmente en un sitio dedicado con equipo especializado y personal entrenado. Otro aspecto importante relacionado con la realización de pruebas basadas en orina es la alta variación intra e interindividual en el recuento de células urinaria total y la proporción de células-tumor con respecto a lo normal [14]. Un alto fondo de las células normales limita la sensibilidad de la mayoría de los ensayos de detección y requiere que una fracción más grande del material de la muestra se analiza para aumentar la posibilidad de identificar las células tumorales.
El componente celular de la orina es muy heterogéneo, que consta de células de diversos tipos y tamaños, tales como células epiteliales, células escamosas y macrófagos [15,16]. Nosotros [17] y otros [18-20] han demostrado previamente que la filtración pre-analítica de orina usando un filtro de membrana proporciona un medio para la captura y el enriquecimiento de las células del cáncer de vejiga de la orina. Con un tamaño de poro de aproximadamente 8 micras, tales filtros pueden capturar células uroteliales normales y malignos, que normalmente tienen un diámetro de & gt; 20 micras, mientras que eliminan algunas células de menor tamaño. Un procedimiento típico para la filtración, tal como el utilizado en nuestro estudio anterior [17], implica el uso de una jeringa desechable para forzar la orina a través de un filtro de membrana montada en un soporte de filtro adecuado equipado con una entrada y una salida. Después de la filtración, el filtro se retira con pinzas y se transfiere a un tubo de microcentrífuga para su procesamiento inmediato o almacenamiento en el congelador. Este procedimiento requiere la formación, no es adecuado para el procesamiento de grandes volúmenes, e implica el riesgo de perder material a través de derrame y durante la manipulación de las membranas de filtro delicados.
Se presenta un dispositivo de filtración para el muestreo y almacenamiento de las células a partir de grandes volúmenes de orina u otros fluidos biológicos. Después de la filtración, el filtro con las células capturadas se puede quitar fácilmente del dispositivo de filtración y se coloca en una unidad de almacenamiento estanco al agua, que contiene una solución apropiada para la preparación o la preservación de las células capturadas. La unidad de almacenamiento a continuación, puede enviarse a un laboratorio de pruebas para el análisis de aguas abajo apropiada del contenido celular. Se demuestra el uso de este dispositivo para la caracterización basada en el ADN de los pacientes con lesiones benignas y malignas de los tumores de la vejiga.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de orina
La orina las muestras se obtuvieron de pacientes en los que cistoscopia flexible rutinario en la consulta externa mostró evidencia de tumor de vejiga y que fueron remitidos posteriormente a la resección transuretral de la vejiga (RTU) en el hospital Universitario de Copenhague, Herlev, Dinamarca. El estudio incluyó a los pacientes y los pacientes recién diagnosticados sometidos a cistoscopia revisión de rutina como el seguimiento de tumor de células de transición previamente diagnosticados de la vejiga. Las muestras se trasladaron a temperatura ambiente a la Sociedad Danesa del Cáncer y procesados dentro de las 4-6 horas después de la micción. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Biomédica de la región de la capital de Dinamarca (H-2-2010-045), y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los sujetos antes de participar en el estudio.
Colección de células y el aislamiento de ADN
muestras de orina anulados (100-400 ml) o suspensiones de células cultivadas se procesaron utilizando un dispositivo de filtración (Fig 1) montado con un filtro de pista grabada Nuclepore de policarbonato hidrófilo de membrana (diámetro 25 mm, tamaño de poro 8 micras; Whatman, Maidstone, Reino Unido). Después de la filtración, el cartucho de filtro se transfirió a la gaveta de almacenamiento, que entonces fue montado con la tapa a partir de un kit Auto-Collection ADN Oragene que contiene 1,7 ml de tampón de lisis /de estabilización (formato de disco OG-250; ADN Genotek, Ottowa, Ontario, Canadá). Según el fabricante, el ADN es estable en esta solución durante & gt; 5 años a temperatura ambiente. El ADN se purificó a partir de 0,5 ml de la muestra utilizando la solución de purificación de ADN Oragene (DNA Genotek), de acuerdo con el protocolo de precipitación con etanol proporcionado por el fabricante. Para la recogida del componente celular total, se centrifugaron 25 ml de orina a 2.000 g durante 10 min. El sedimento se resuspendió en 200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacenó a -80 ° C. Se extrajo el ADN utilizando el kit Qiagen Mini Prep (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Protocolo para la purificación de ADN a partir de tejidos). rendimiento de ADN se estimó por análisis de PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando un sistema LightCycler 2.0 (Roche, Mannheim, Alemania), el Maestro de ADN FastStart
PLUS SYBR Green I Kit (Roche), Human Genomic DNA (Roche) como referencia y los siguientes cebadores para
GAPDH
:. 5'-TAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAG-3 'y 5'-GGCGACGCAAAAGAAGATGC-3'
El dispositivo se compone de una unidad de filtración (a, componentes individuales; B, dispositivo montado; C, después de la filtración) y un estuche de almacenamiento estanco al agua (D, los componentes individuales;. e, casete ensamblado) guía empresas
cultivo de células y sistema modelo
El carcinoma urotelial líneas celulares -derivado 639V y 97-7 fueron desde el laboratorio de Margaret A. Knowles y albergan los
FGFR3 mutaciones
p.R248C y p.S249C, respectivamente [21]. Las células se mantuvieron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2. Los linfocitos de un donante sano se prepararon a partir de sangre periférica de acuerdo con un protocolo descrito previamente [22]. Las células se congelaron en AIM V (Gibco) que contiene 45% derivado de plasma humano-suero + 10% de DMSO y se almacenaron a -80 ° C. Las células congeladas se descongelaron en un baño de agua caliente 37 ° C, y se recuperaron en AIM V medio a 37 ° C durante 30 min antes de su uso. Las células en suspensión se contaron y su diámetro se midió utilizando un contador celular condesa automatizada (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los linfocitos y las células de carcinoma se mezclaron en diferentes proporciones en 100 ml de PBS y se procesaron usando el dispositivo de filtración.
análisis de la mutación
detección y cuantificación de
FGFR3
mutaciones (p. R248C, p.S249C, p.G370C y p.Y373C) y las correspondientes secuencias de tipo salvaje se realizó mediante PCR gotita digital (ddPCR), utilizando el sistema QX200 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y ensayos basados en sondas de hidrólisis ( PrimePCR ddPCR ensayos de detección de mutaciones; Bio-Rad). La mezcla de PCR contenía 11 l de ddPCR supermix gotita para sondas (no dUTPs), 1,1 l de cebador de mutación /mezcla de sondas (FAM), 1,1 l de tipo salvaje de cebador /mezcla de sondas (HEX) y 2 l de ADN en un volumen final de 22 l. Veinte microlitros de esta mezcla y 70 l de aceite de generación de gotas fueron transferidos a diferentes pocillos de un cartucho de generación de gotas. Después de la formación de gotitas utilizando el generador de gotas, las muestras se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se sometieron a PCR de amplificación durante 40 ciclos a 94 ° C durante 30 seg. y 55 ° C durante 60 segundos. Las gotitas (en promedio ~ 16.000 por reacción) se analizaron en el lector de gotas, y software Quantasoft (versión 1.4.0.99) se utilizó para el análisis de las concentraciones de ADN. ajustes de corte se determinaron utilizando muestras de ADN de control mutación positiva y negativa. Para las muestras de orina procesados tanto por filtración y sedimentación, cantidades equimolares de ADN se utilizaron como plantilla.
análisis de metilación de ADN
ADN (hasta 500 ng) se trató con bisulfito usando el EZ metilación del ADN Kit -oro (Zymo Research Corp, Orange, CA, EE.UU.), se eluyó en 20 l de H-tampón de elución y se almacena a 80 ° C. El análisis cuantitativo de los niveles de metilación en las islas CpG promotoras de
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Eomes
,
Hoxa9
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POU4F2
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SALL3
y
VIM
se realizó mediante ensayos basados en TaqMan PCR en tiempo real (MethyLight), utilizando los cebadores descritos anteriormente, sondas y condiciones [17]. Las reacciones se realizaron en la plataforma 480 LightCycler usando el LightCycler 480 Sondas Maestro Kit (Roche, Mannheim, Alemania) y 1 l de ADN tratado con bisulfito por reacción.
in vitro
ADN metilado (IVM; CpGenomeTM ADN metilado universal, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) y de todo el genoma de ADN amplificado sirvieron como controles positivos y negativos para la metilación, respectivamente. los niveles de metilación se calcularon como porcentaje de referencia metilado (PMR; Ref. [23]) mediante la normalización de los valores de reacción-marcador específico de
ALUC4
valores relativos a los mismos valores para el control totalmente metilado (IVM). Las muestras con una concentración inferior al equivalente de 0,25 ng /fueron excluidos de ADN tratado con bisulfito no l. Para cada marcador, el valor de corte por encima del cual se considera una muestra positiva se determinó mediante análisis de ADN de la orina filtrada de 11 controles sanos [17]. Valores de corte PMR para
Hoxa9
,
POU4F2
,
SALL3
y
VIM
eran 3, 2, 0,5 y 2, respectivamente, mientras que no se se observó amplificación de fondo para
BCL2
,
CCNA1
y
Eomes
.
Resultados
Esquema del dispositivo de filtración
el prototipo del dispositivo de filtración y de sus componentes individuales se muestran en la figura 1. el conjunto de dispositivo completo comprende 1) una unidad de filtración para la filtración de una muestra de fluido biológico, 2) un cartucho de filtro extraíble que contiene un filtro adecuado para la captura de material pertinente y 3) una unidad de almacenamiento para la preparación y /o preservar el contenido del filtro. La unidad de filtración tiene una cámara de recogida, un depósito de residuos, y una plataforma de soporte de filtro que aloja el cartucho de filtro extraíble (Fig 1A). Estas tres partes están conectadas para permitir el paso de un fluido desde la cámara de recogida en el depósito de los residuos a través del filtro del cartucho de filtro (Fig 1B). La cámara de recogida consiste en una bolsa cilíndrica rodeado por un resorte helicoidal, que puede ser comprimido de forma manual para generar una presión que obliga al fluido a través del filtro (Fig 1C). La plataforma de soporte de filtro contiene una válvula que se libera a alta presión si el filtro se atasca con el material, que permite el paso directo del fluido desde la cámara de recogida en el depósito de residuos. El depósito de residuos contiene material absorbente para permitir la eliminación de dispositivos y de los residuos líquidos. El prototipo de este dispositivo fue diseñado con una capacidad de fluido máxima de 500 ml para acomodar y procesar los huecos enteros de orina.
Después de la filtración, el cartucho de filtro con el filtro se puede retirar de la unidad de filtración y se inserta en la unidad de almacenamiento (Fig 1D). La tapa de la unidad de almacenamiento contiene una solución de tratamiento o almacenamiento adecuado que se libera en el filtro cuando está montado la tapa. Cuando se activa con el cartucho de filtro y la tapa, la unidad de almacenamiento se forma un conjunto de sellado que puede ser transportado fácilmente y con seguridad (Fig 1E). Una vez recibido por un analista, el material biológico capturado se puede recuperar fácilmente a partir de la unidad de almacenamiento de la eliminación de la tapa.
Evaluación del rendimiento del dispositivo
Como un sistema modelo para evaluar la capacidad de la dispositivo para capturar y enumerar células tumorales de muestras de fluidos, se utilizó la línea celular de carcinoma urotelial 639V, que tiene una mutación puntual (p.R248C) en el gen que codifica el factor de crecimiento de fibroblastos receptor 3 (
FGFR3
) con la pérdida de del correspondiente alelo de tipo salvaje (figura S1). En la primera serie de experimentos, 100 ml de PBS que contienen entre 1,000 y 5 × 10
se añadieron 6 639V células (diámetro, 11 a 18 micras) a la cámara de recogida del dispositivo y fuerzan a través de un filtro de membrana de policarbonato con una tamaño de poros de 8 micras. Para cuantificar el número de células capturadas en el filtro, se extrajo ADN total y se determinó el número de mutante
FGFR3
moléculas usando una PCR (ddPCR) de ensayo digitales de gotas. En esta configuración, un evento positivo es equivalente a una célula. Las señales positivas se obtuvieron de forma reproducible para todas las muestras cuando se utilizó 2 l (4%) del ADN extraído como plantilla para ddPCR (Fig 2A). En particular, para la concentración más baja de las células (1.000 en 100 ml), la recuperación fue de ~ 70% (Fig 2B). A concentraciones más elevadas de células, hubo una disminución en la tasa de recuperación, hasta ~ 5% a 5 × 10
6 células /100 ml. Esta recuperación inferior se esperaba como la saturación del filtro provocará la liberación de la válvula de presión y un flujo directo del fluido restante y su contenido celular en el depósito de residuos. Esta prueba inicial sugiere que el dispositivo de filtración puede ser utilizado para capturar eficazmente las células de cáncer de vejiga de un fluido, y que la tasa de recuperación es particularmente alta a bajas concentraciones de células en las que todavía no se ha alcanzado la capacidad del filtro.
PBS (100 ml) que contiene entre 1,000 y 5 × 10
6 639V células se procesó utilizando un dispositivo montado con un tamaño de poro del filtro de membrana de policarbonato de 8 micras. Se extrajo el ADN de los filtros y la prueba de moléculas mutantes
FGFR3
(p.R248C) utilizando ddPCR. Se utilizó ADN de linfocitos de sangre periférica normal como control de tipo salvaje
FGFR3
. Una, la trama de amplitud de fluorescencia ddPCR. Las líneas verticales representan ajustar manualmente la configuración de corte. Los resultados mostrados son de uno de los dos experimentos independientes. B, Gráfico de barras que muestra el número de células recuperadas (calculado sobre la base del mutante
FGFR3
moléculas) con respecto al número de celdas de entrada. recuento total de moléculas mutantes se calcularon sobre la base de tres ensayos independientes, cada una ddPCR moléculas mutantes de medición en el 4% del total de la muestra de ADN. Los datos de mediciones por triplicado (cada uno el 4% del ADN total) de un experimento se representan como media ± desviación estándar. Los porcentajes anteriores barras representan el número de células recuperadas en relación con el número de células de entrada.
Para probar la capacidad del dispositivo de filtración para aumentar la concentración de células de cáncer de vejiga presente en un fondo de menor tamaño las células normales, que se dispararon entre 1.000 y 50.000 639V células en 100 ml de PBS que contenía 10
7 purificados cultivos de linfocitos humanos normales (de diámetro, 7-8 micras) y procesadas mediante la suspensión del dispositivo de filtración. El análisis de ADN extraído de los filtros por ddPCR mostró señales para los dos mutantes (p.R248C) y de tipo salvaje
FGFR3 gratis (Figura 3A). Lo más importante, la tasa de recuperación de ADN mutante fue similar a la conseguida con soluciones puras de células 639V (Figura 3B). Aunque el procesamiento de las muestras por filtración eliminó la mayoría de los linfocitos (& gt; 99%), hubo un fondo consistente de tipo salvaje
FGFR3
alelos (Fig 3), que pueden derivarse a partir de monocitos residuales (diámetro, 15 a 25 micras) presente en las preparaciones de linfocitos.
Entre 1.000 y 50.000 639V células se enriquecieron en 10
7 linfocitos normales en 100 ml de PBS, y la suspensión se procesó utilizando el dispositivo de filtración. Se extrajo ADN de los filtros y se prueba para mutante (p.R248C; mut) y de tipo salvaje (WT)
FGFR3
usando ddPCR. A, ddPCR parcelas de amplitud de fluorescencia de
FGFR3
señal de fluorescencia de la sonda R248C-FAM (azul, panel superior) y
señal de fluorescencia de la sonda FGFR3
WT-HEX (verde, panel inferior). Las líneas verticales representan ajustar manualmente la configuración de corte. Los resultados mostrados son de uno de los dos experimentos independientes. B, Gráfico de barras que muestra el número de células recuperadas (calculado sobre la base de mutantes y WT
FGFR3
moléculas) con respecto al número de células tumorales de entrada. recuento total de
FGFR3
moléculas se calcularon sobre la base de tres pruebas ddPCR independientes, cada uno usando 4% del ADN total como molde, y se representan como medias ± SD. Los porcentajes por encima de las barras representan el número de células recuperadas en relación con el número de células de entrada.
Para evaluar la variabilidad de los resultados, se filtraron 100 ml de PBS que contiene 500, 1000 o 5000 97-7 células (diámetro, 18 a 25 micras), cada uno con 3-5 puntos de datos de tres experimentos independientes. Se aisló el ADN y el número de mutante
FGFR3
(p.S249C) moléculas se cuantificó usando ddPCR. En este modelo, la variabilidad intra-muestra fue en general bajo y disminuyó con el número de células de mayor tamaño (Fig S2).
La detección de cáncer de vejiga en muestras de orina
A continuación se evaluó el rendimiento del dispositivo mediante el procesamiento de orina de 59 pacientes inmediatamente antes de la RTU. Todos los pacientes habían mostrado evidencia de tumor de vejiga cuando se examina por primera vez por cistoscopia flexible guiada por fluorescencia. Sobre la base de la evaluación histopatológica de las biopsias, 33 de los pacientes fueron diagnosticados con tumores de vejiga, mientras que los restantes 26 pacientes tenían lesiones benignas o epitelio normal de la vejiga. Las Tablas 1 y 2 muestran los datos demográficos y patología para estos pacientes. La mayoría de los tumores eran no invasiva (estadio Ta; 73%), uno era una neoplasia papilar urotelial de bajo potencial maligno (NUPBPM), dos fueron clasificados como tumores in situ (Tis), cuatro eran estadio T1 y dos eran estadio T2. Veinte tumores (61%) eran de bajo grado.
Con el fin de probar si la filtración podría aumentar la proporción de células de normal a tumoral, primero a prueba 13 muestras de orina en una dividida configuración de la muestra, donde se sedimentaron 25 ml de cada muestra por centrifugación, y el resto se procesaron por filtración. ADN aislado de todas las muestras de filtros de sedimentos y se hacen pruebas de cuatro común
FGFR3
mutaciones (p.R248C, p.S249C, p.G370C y p.Y373C) utilizando ddPCR. Ocho de las muestras (58%) fueron positivos para una de estas mutaciones (Tabla 1). El análisis cuantitativo usando cantidades equimolares de ADN total de los filtros y los sedimentos mostró que la proporción de ADN de tipo mutante a salvaje fue mayor en las muestras filtradas que en los sedimentos correspondientes (Tabla 3). Lo más importante, se lograron los mayores enriquecimientos (6,5 y 8,0 veces, respectivamente) para las dos muestras que representan las proporciones más bajas de tipo mutante a-salvaje (Fig 4).
Las muestras de orina de pacientes con tumores de vejiga se dividieron en dos fracciones y procesada por filtración dispositivo y la sedimentación, respectivamente. cantidades equimolares de ADN de los filtros y los sedimentos se ensayaron para
FGFR3
mutaciones utilizando ddPCR.
Todas las muestras de orina restantes fueron procesados por filtración solo, y el ADN se extrajo y se examinaron
FGFR3
mutaciones utilizando ddPCR y siete marcadores de ADN de metilación (
BCL2
,
CCNA1
,
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2
,
SALL3 Opiniones y
VIM
) utilizando ensayos MethyLight. Varios estudios de cáncer de vejiga han informado de sensibilidades altas (& gt; 50%) y especificidades (& gt; 90%) para estos marcadores en los tumores de vejiga [7,8,24], y como un panel que proporcionado una sensibilidad del 94% [17 ].
El rendimiento promedio de ADN a partir de muestras de orina de los 33 pacientes con tumores de vejiga fue de 138 ng (rango 6,3 a 3.600 ng). En dos muestras de pacientes con tumores Ta de bajo grado, la cantidad de ADN después del tratamiento con bisulfito era insuficiente para permitir el análisis de todo el panel de biomarcadores. Tabla 1 muestra los resultados para las 31 muestras restantes. Diecinueve de las muestras contenían
FGFR3
mutaciones (61%), con la mayoría de las mutaciones de ser p.Y373C (50%) y p.S249C (45%). Una muestra contenía p.Y373C y p.S249C. Un total de 118 eventos hipermetilación del promotor se identificaron en 29 muestras (94%), con un promedio de 4,1 eventos (intervalo 1-7) por muestra. De acuerdo con estudios anteriores [8,17], la sensibilidad más alta se obtuvo con
VIM
, que fue positiva en el 81% de los casos. Los otros seis marcadores tenían sensibilidades que van desde el 74% (
Hoxa9
) al 29% (
Eomes
). Las dos muestras negativas para todos los marcadores de metilación y mutación eran de un paciente con NUPBPM y un paciente con un tumor de bajo grado Ta, respectivamente.
El rendimiento promedio de ADN de muestras de orina recogidas a partir de los 26 pacientes con una benigna histopatología fue de 271 ng (rango de 21 a 1.605 ng). Un total de 30 eventos de hipermetilación del promotor se identificaron en 13 muestras (50%), con un promedio de 2,3 eventos (intervalo 1-5) por muestra. Las muestras restantes fueron negativos para todos los marcadores. El perfil de los marcadores positivos en este grupo de pacientes era diferente de la de los pacientes con tumores, con
SALL3 gratis (26%),
CCNA1 gratis (22%) y
POU4F2
(19%) es el más frecuente. marcadores de metilación positivos se encontraron en 8 de los 12 pacientes (67%) que habían sido previamente tratadas por cáncer de vejiga y fueron ingresados en el seguimiento, y en 5 de los 14 pacientes (36%) que no tenían antecedentes de cáncer de vejiga . Sólo uno de los pacientes con patología benigna de la vejiga tenían un
FGFR3
mutación detectable en la orina. Este paciente también fue positiva para los cinco marcadores de metilación y fue diagnosticado con un tumor de bajo grado de TA en la repetición cistoscopia 6 meses después de la RTU negativo.
Discusión
Hemos desarrollado y probado un dispositivo de filtración logrando la recolección fácil y barato y transformación de células de diagnóstico de la orina. El dispositivo puede ser utilizado por pacientes o profesionales de la salud para suministrar una muestra de células adecuadas para el análisis de ADN. El tampón en la unidad de almacenamiento asegura la estabilidad a largo plazo de ADN a temperatura ambiente, proporcionando un amplio tiempo para enviar la muestra a un laboratorio de pruebas utilizando el sistema postal estándar. El procedimiento simple para proporcionar células urinarias puede reducir en gran medida la necesidad de un contacto directo entre el paciente y el sistema sanitario, y podría ser una opción atractiva en entornos de bajos recursos, donde la cistoscopia no puede ser ofrecido como un estándar para la detección de cáncer de vejiga. El enfoque en este estudio fue el cáncer de vejiga, pero el mismo enfoque se puede aplicar a otros tipos de cáncer genitourinario, tales como tumores superiores del tracto urinario [4], así como otras condiciones en las que el análisis de células urinarias tiene valor diagnóstico, pronóstico o terapéutica.
En experimentos de adición, hemos demostrado que el dispositivo de filtración era capaz de capturar las células tumorales, mientras que la eliminación de un gran exceso de células de menor tamaño. Además, el análisis de muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga mostró que la filtración se incrementó la proporción de células de tumor-a normal en comparación con la sedimentación de las células por centrifugación, en particular para muestras en las que esta relación era bajo. Cabe señalar, sin embargo, que la recuperación y el enriquecimiento de las células por filtración depende de una serie de variables, incluyendo características de las células (por ejemplo, tamaño y deformabilidad), las características del filtro (por ejemplo, tamaño de poro, el número de poros, el espacio entre los poros y filtro materiales) [25] y de filtración de parámetros (por ejemplo, el caudal y presión a través del filtro de flujo) [26].
Entre los pacientes que tenían un tumor de vejiga confirmado en el examen histopatológico, el ADN de orina fue positivo para al menos uno de los biomarcadores ensayados (
FGFR3 mutaciones
y eventos hipermetilación del promotor) en el 94% de los casos. Esta figura fue alentador considerando que la mayoría de los pacientes en esta cohorte presentado con pequeños tumores no invasivos, que son generalmente difíciles de detectar en la orina porque arrojan relativamente pocas células [27]. Sin embargo, se requieren estudios prospectivos grandes para evaluar aún más el potencial de este enfoque para la detección de cáncer de vejiga en un entorno de diagnóstico. La alta sensibilidad para la detección de tumores de vejiga obtenidos en este estudio puede al menos en parte atribuirse a los grandes volúmenes completos (huecos) de orina procesados. Zuiverloon et al. [14] mostró que la sensibilidad de la detección basada en el ADN de los tumores de vejiga aumentó proporcionalmente al aumentar el volumen de orina y que se logró la prueba más fiable sobre la base de una colección de 24 horas de las células urinarias, similar a los procedimientos estándar para la recogida de orina en bruto para el diagnóstico de otras enfermedades como la porfiria y la insuficiencia renal. A este respecto, el dispositivo descrito aquí puede facilitar el muestreo frecuente y repetida.
Casi la mitad de los pacientes sometidos a Turb debido a la evidencia de tumor mediante la cistoscopia flexible rutina se encontraron para no abrigar tumor de células de transición en las muestras de biopsia . Curiosamente, muestras de orina de la mitad de estos pacientes fueron positivos para uno o más marcadores de ADN de metilación, a pesar de estos marcadores siendo negativo en la orina de individuos sanos. Estudios previos han demostrado que la hipermetilación en el urotelio de aspecto normal de pacientes con cáncer de vejiga [28], lo que indica un "defecto del campo 'epigenética. Otros estudios han demostrado que los biomarcadores de ADN de metilación se pueden detectar en la orina año después de la resección de un tumor de vejiga pesar de la falta de recurrencia [29,30]. Epigenetically cambiado parches de urotelio fenotípicamente indistinguibles de urotelio normal puede representar lesiones precursoras de cáncer de vejiga y puede explicar la alta tasa de recurrencia. Por lo tanto, es posible que los pacientes con marcadores de metilación del ADN detectables en la orina pueden estar en mayor riesgo de desarrollar cáncer de vejiga más tarde en la vida. En contraste con la alta prevalencia de
FGFR3
mutaciones en la orina de los pacientes con tumor de vejiga confirmado (67%), sólo uno de los pacientes con histopatología benigna tenían un
FGFR3
mutación detectable en la orina. Curiosamente, este paciente fue diagnosticado con un tumor de vejiga medio año más tarde, lo que sugiere que las pruebas de ADN orina puede detectar algunos tumores de vejiga en una etapa anterior que el procedimiento RTU.
El dispositivo de filtración capta eficazmente las células a partir de grandes volúmenes de la orina y los concentrados y los almacena para su envío conveniente y pruebas de aguas abajo.