Extracto
La proteína transmembrana y secretada como delta-1 homólogo (
Dlk1
) pertenece a la EGF-como de la familia. Es ampliamente aceptado que
Dlk1
juega un papel importante en la regulación de la diferenciación celular, tales como la adipogénesis y la osteogénesis. La expresión aberrante de
DLK1
se ha encontrado en varios tipos de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón. Un estudio previo en este laboratorio ha revelado que
DLK1
está asociada con la invasión tumoral, aunque el mecanismo sigue siendo desconocido. Para explorar los efectos potenciales que
Dlk1
podría tener sobre la invasión,
Dlk1
se sobreexpresa o hacerlo caer en las líneas celulares de cáncer de pulmón humano. Las influencias de la proteína en la invasión de células se evaluaron posteriormente. Un transwell ensayo mostró que
Dlk1
sobreexpresión promovió significativamente la invasión de las células cancerosas. Blot y zimografía de gelatina análisis de Western indicó que
Dlk1
podría afectar tanto a la matriz metaloproteinasa-9 (
MMP9
) expresión y su actividad extracelular. Un análisis de los
NOTCH1
y
HES1
la expresión génica y dominio intracelular Notch (NICD) translocación nuclear durante
Dlk1
estimulación o el agotamiento demostraron que
Dlk1
podía activar la señalización de Notch en células de cáncer de pulmón. Además, la elevada expresión de
MMP9
inducida por
Dlk1
estimulación podría reducirse significativamente mediante la inhibición de la señalización Notch usando inhibidor de la γ-secretasa (GSI). Los datos presentados en este estudio sugieren que
Dlk1
puede promover la invasión de células de cáncer de pulmón mediante la regulación positiva de
MMP9
expresión, que depende de la señalización de Notch
Visto:. Li L , Tan J, Zhang Y, Han N, Di X, Xiao T, et al. (2014)
Dlk1
promueve la invasión celular del cáncer de pulmón a través del incremento de
MMP9
Expresión Dependiendo de señalización Notch. PLoS ONE 9 (3): e91509. doi: 10.1371 /journal.pone.0091509
Editor: Yunli Zhou, Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Noviembre 2013; Aceptado: 11 Febrero 2014; Publicado: 12 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (30930042 y 81301852) y el Fondo de Investigación Especializada para el Programa de Doctorado de Educación Superior (20111106110017). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y la metástasis tumoral está fuertemente asociado con el pronóstico de los pacientes con cáncer [1], [2]. Nuestros estudios previos sobre los genes expresados diferencialmente en pulmón humano carcinoma de células escamosas (SCC) con o sin metástasis en los ganglios linfáticos usando el análisis de microarrays de ADN encontraron un conjunto de genes asociados a metástasis (FDR & lt; 0,05, datos no mostrados). Entre esos genes,
Dlk1
mostraron más de dos veces más alta expresión en los tumores primarios con metástasis en ganglios linfáticos, lo que sugiere que
Dlk1
puede jugar un papel en la metástasis del cáncer. Sin embargo, tanto la relación entre el gen
Dlk1
y la metástasis del tumor y su mecanismo no están bien caracterizados.
El delta-como 1 homólogo (
Dlk1
), con los alias
FA1
,
ZOG
y
PREF-1 |, codifica una proteína transmembrana y secretadas (Dlk1) que contiene seis factor de crecimiento epidérmico (EGF) dominios que es un miembro de la FEAG -como familia. Esta proteína es altamente homóloga a la DLL1 ligando Notch, pero carece del motivo Delta /Serrate /Lag (DSL) que es crítica para la interacción con los receptores Notch [3], [4]. Los estudios sobre
Dlk1
han puesto de manifiesto su papel en la diferenciación celular. Por ejemplo,
DLK1
puede funcionar en la modulación de la adipogénesis [5], [6], [7], la regulación de la diferenciación de osteoblastos [8], [9] y la inhibición de la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas [10]. El ligando no clásica
se encontró DLK1
que se expresa de forma aberrante en varios cánceres humanos, incluyendo neuroblastoma [11], carcinoma hepatocelular [12], [13], gliomas [14] y el cáncer de próstata humano [15]. Nuestro trabajo previo también encontró que los
Dlk1
es altamente expresado en el cáncer humano no microcítico de pulmón de células y funciona como un oncogén [16]. upregulated expresión de
Dlk1 Hoteles en cáncer de pulmón de células no pequeñas se asocia con metástasis en los ganglios linfáticos, pero el mecanismo sigue siendo desconocido.
La vía de Notch es una conocida ruta de transducción de señales durante el proceso de desarrollo y la determinación del destino celular. Aunque carece del motivo DSL, se ha demostrado
Dlk1
para actuar como un inhibidor de la señalización Notch in vitro [17], [18]. Tanto unido a la membrana y se secreta DLK1 puede interactuar con NOTCH1 [17], lo que lleva a la alteración de la distribución celular de NOTCH1 y la inhibición de la expresión de genes Notch-regulado [4], [5], [19]. Se ha informado de que
NOTCH1
puede regular la expresión de la metaloproteinasa de matriz 9 (
MMP9
) en células de cáncer de próstata, que desempeña un papel clave en la invasión del cáncer [20]. Tomando estos resultados en conjunto, la hipótesis de que la señalización Notch podría estar involucrado en
Dlk1
inducida por invasión de células cancerosas.
El estudio que presentamos a continuación proporciona evidencia que sugiere que
Dlk1
mejorado la capacidad de las células de cáncer de pulmón para invadir la matriz extracelular (ECM), que validó nuestra expresión génica anterior de perfiles de resultados derivados de análisis de microarrays. Por otra parte, nuestros datos demuestran que
Dlk1
promovieron la invasión de células de cáncer a través de la regulación positiva de
MMP9
expresión y la mejora de su actividad extracelular, que dependen de la vía de señalización Notch.
materiales y Métodos
los cultivos de células y el tratamiento
la línea celular de cáncer de pulmón humano H520, H1299 y A549 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 100 g /ml de penicilina-estreptomicina en una incubadora humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C . Se añadió el inhibidor de Notch L-685458 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) al medio de cultivo 12 horas después de la transfección transitoria con el
DLK1
plásmido de expresión o el vector null (pcDNA3.1), con una concentración final de 5 mM efectiva en RPMI 1640 que contenía FBS al 1%.
Dlk1
plásmido de expresión y de pequeños ARN de interferencia (siRNA)
El
Dlk1
plásmido de expresión eucariota se construyó y luego transfectadas de forma estable en células H520, como se describe anteriormente [16]. La
DLK1
plásmido de expresión fue también transfectaron transitoriamente en células H520 y H1299 utilizando reactivo de transfección Lipofectamine-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA); y un dúplex de Invitrogen sigilo siRNA (Carlsbad, CA) en contra de
Dlk1
se utilizó para el silenciamiento de genes utilizando Lipofectamine RNAiMAX reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
in vitro ECM invasión ensayo
Las células ya sea de forma estable (H520) o transitoria (H1299) transfectadas con
Dlk1
o vector nulo fueron por separado hasta 80% de confluencia cultivadas. Después, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se cultivaron en medio libre de suero durante la noche antes de ser sometida a un ensayo ECM invasión in vitro. El ensayo de quimioinvasión se llevó a cabo usando BioCoat Matrigel Invasión Cámaras con 8 micras poros (BD Biosciences, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, 2,5 × 10
4 células se resuspendieron en medio libre de suero fresco y se sembraron en la cámara superior de un pozo de 24 transwell placa, mientras que la cámara inferior contenía medio de cultivo fresco con FBS al 20% como quimioatrayente. Se dejó que las células para invadir durante 22 horas (37 ° C, 5% de CO
2 atmósfera), y después las cámaras se lavaron con PBS. Se eliminaron las células que no invaden a través de la membrana. Las células invasoras en la superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol frío, se tiñeron con 0,2% de cristal violeta y se examinaron. Las células de cada membrana se contaron en no menos de cinco campos bajo un microscopio de luz.
extracción de RNA y inversa cuantitativa PCR con transcripción
ARN total fue aislado de las células con reactivo TRIzol (Invitrogen , Carlsbad, CA), y 1 g RNA total se utilizó para la transcripción inversa con un kit de transcripción inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. En tiempo real PCR análisis de
MMP9
y
HES1
expresión se llevó a cabo con los siguientes cebadores: MMP9-F-5 'TTTGACAGCGACAAGAAGTG-3', MMP9-R-5 'CAGGGCGAGGACCATAGAGG-3' , HES1-F 5'-TAGCTCGCGGCATTCCAAG-3 'y HES1-R 5'-AAGCGGGTCACCTCGTTCA-3'. El gen de mantenimiento
18S ARN ribosomal
fue recogido como un control interno en este estudio, con los cebadores como 18S-F-5 'GAAACGGCTACCACATCC-3' y 5 '18S-R-ACCAGACT2TGCCCTCCA-3'. Se utilizó un kit SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Shiga, Japón) para el análisis de PCR en tiempo real con un protocolo de amplificación estándar: 95 ° C durante 10 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s y una extensión final a 72 ° C durante 3 min. Después de la amplificación, un procedimiento de curva de fusión estándar se realizó para cada gen para examinar la especificidad de la amplificación.
análisis de transferencia de Western
proteína total fue extraído de aproximadamente 2 × 10
6 cultivaron las células con tampón RIPA, y la proteína nuclear se extrajo usando NE-PER reactivos de extracción nucleares y citoplasmáticas (Pierce, Rockford, IL) siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. En total, 40 a 80 g de las proteínas se separaron por electroforesis y después se transfirieron a una membrana de PVDF, como se describe anteriormente [21]. La membrana se bloqueó con leche desgrasada 5% y se incubó con un anticuerpo primario contra DLK1 (Grupo Proteintech, Chicago, IL), NOTCH1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), NOTCH1 escindido (Val1744, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) o MMP9 (Sistemas de Aviva Biología, San Diego, CA). El dominio intracelular (INET) anticuerpo anti-Notch utilizado en este estudio sólo puede reconocer troceados y NOTCH1 pero no de larga duración NOTCH1 activado. Después de lavar con PBS que contiene 0,1% de Tween-20 (PBST), la membrana se incubó con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Dako, Glostrup, Dinamarca), y se detectó la abundancia de las proteínas con reactivos de quimioluminiscencia. La membrana se volvió a sondear con un anticuerpo contra GAPDH (Kangchen Bio-Tech, Shanghai, China) o PDD (Abcam, Cambridge, MA) como controles internos para la carga de proteína equivalente.
Gelatina zymography
de forma estable
Dlk1 células que expresan
H520-Dlk1, junto con las células H520-H520 pcdb y los padres de control nulo, se cultivaron por separado en placas de 10 cm hasta 80% de confluencia. Se recogieron los medios condicionados y se concentraron utilizando un filtro Amicon (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En total, 20 g de proteínas concentrada se electroforesis en condiciones no reductoras, y luego la actividad gelatinolítica de MMP9 se analizó utilizando reactivos zimografía (Bio-Rad, Hercules, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El análisis estadístico
las diferencias entre los recuentos de células invasoras en cada grupo en el ensayo de invasión y las diferencias en la expresión relativa en el análisis en tiempo real PCR se evaluaron mediante la prueba t de Student. Todas las pruebas fueron de dos caras, y un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con el paquete estadístico SPSS, versión 13.0 (SPSS, Chicago, IL).
Resultados
La sobreexpresión de
Dlk1
mejorado invasión ECM por las células de cáncer de pulmón
Para resolver si
Dlk1
ha papeles potenciales en la metástasis del cáncer de pulmón, las líneas cancercell pulmón H520 y H1299 se emplea como modelo in vitro en los que la expresión endógena de
Dlk1
WAS carente. células H520 con expresión estable de exógena
DLK1
(H520-Dlk1) se generaron anteriormente, junto con las células H520-pcdb, transfectadas establemente con el vector (pcDNA3.1) como el control null [16]. células H520-Dlk1 se sometieron al ensayo de invasión, con H520-pcdb y células H520 parentales como controles. Como se muestra en la figura 1 panel A y B, después de un período de 22 horas de la invasión, había significativamente más células H520-Dlk1 invadido través de la membrana cámara recubierta con Matrigel, en comparación con H520 y células H520-pcdb (p-value & lt; 0,05). Se observó un fenómeno similar en células H1299. Más
DLK1
transfectaron transitoriamente células H1299 (H1299-Dlk1) se encontraron invadido través de la membrana en comparación con las células H1299 transfectadas con el vector nulo (H1299-pcdb), como se muestra en la Figura 1C y D. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de
Dlk1
notablemente podría mejorar la capacidad de las células para invadir el ECM.
a, fotomicrografías representativas de las células invasoras que migraron a través de la membrana recubierta con Matrigel del transwell, tomados de tres grupos: H520, las células de los padres, H520-pcdb, las células de control de vectores nulos y H520-Dlk1, las células que expresan establemente Dlk1. B, un histograma para los recuentos de células migratorias del grupos H520-H520 Dlk1, H520-pcdb y. C, fotomicrografías representativas que muestra las células H1299, que fueron transfectadas transitoriamente con
Dlk1 gratis (H1299-Dlk1) o vector nulo (H1299-pcdb), que invadió a través de la membrana recubierta con Matrigel del transwell. D, un histograma para los recuentos de células migratorias de los grupos H1299-H1299-Dlk1 y pcdb. Los experimentos se realizaron por triplicado (* t-test, p-valor & lt; 0,05).
La sobreexpresión de
Dlk1
expresión de MMP9 upregulated y la actividad
Based en la hipótesis de que
Dlk1
inducida por invasión de células cancerosas mediado por la regulación positiva de
MMP9
, la expresión de
MMP9
a
se analizó Dlk1
estimulación por tanto en tiempo real PCR y Western Blot. Los resultados mostraron que
MMP9
expresión fue mayor en las células H520-H520 Dlk1 comparación con las células y H520-pcdb tanto en el mRNA y los niveles de proteína (Figura 2 A y B). Una misma tendencia también se observó cuando
Dlk1
se sobreexpresa en otra línea celular de cáncer de pulmón H1299. Después transfectadas transitoriamente con
DLK1
, altamente expresado
MMP9
se detectó tanto en ARNm y los niveles de proteína (Figura 2D y E). Como proteína MMP9 cumple su función en una forma activada en el espacio extracelular, se recogieron los medios condicionados y se empleó zimografía de gelatina para probar la actividad de MMP9. En la Figura 2C, se muestra que
Dlk1
también podría mejorar la actividad de MMP9 en el espacio extracelular, mientras que la actividad de la MMP-2 se mantuvo sin cambios. Para confirmar aún más la relación entre el
Dlk1
y
MMP9
, se empleó la interferencia de ARN para agotar
Dlk1
expresión en células A549, y
MMP9 expresión era
examinado secuencialmente. Los resultados mostraron que la expresión DLK1 fue suprimido eficazmente por RNAi a nivel de proteínas (Figura 2G), y la expresión de MMP9 se inhibieron significativamente tanto en el mRNA y los niveles de proteína (Figura 2F y G). Estos resultados sugieren que
Dlk1
podría promover la invasión celular a través de la regulación de la expresión y actividad de MMP9.
A, un histograma para la expresión de mRNA relativa de
MMP9 Hoteles en células H520 transfectadas con
Dlk1 gratis (H520-Dlk1) o vector nulo (H520-pcdb) detectada por análisis de PCR en tiempo real. El nivel de expresión de
MMP9
en las células H520 en blanco fue utilizado como control y el valor 1. B, la expresión de proteínas de MMP9 en H520-Dlk1, H520-H520 pcdb y células evaluadas por análisis de transferencia de Western. C, zimografía de gelatina que muestra la actividad de MMP9 secretada y la MMP-2 en H520-Dlk1, H520-H520 pcdb y células. D, el análisis de PCR en tiempo real de la expresión de mRNA relativa de
MMP9
en células H1299 transfectadas con
DLK1
(H1299-Dlk1) o vector null (H1299-pcdb) se muestra en un histograma. E, transferencia de Western que muestra la expresión de la proteína de MMP9 en células H1299-H1299 y Dlk1-pcdb. F, un histograma que muestra la expresión de ARNm relativa de
MMP9 Hoteles en
Dlk1
siRNA (A549-si-Dlk1) o control nulo siRNA (A549-NC) células A549 transfectadas evaluados por tiempo real análisis de PCR. G, la expresión de la proteína de MMP9 en A549-si-Dlk1, A549-NC y células A549 en blanco detectados por Western Blot. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
18S ribosomal RNA
se utilizó como control interno en el análisis en tiempo real PCR, mientras que GAPDH se utilizó como control interno en el análisis de transferencia de Western (* t-test, p-valor & lt; 0,05).
la sobreexpresión de
Dlk1
vía de señalización Notch activado
Para confirmar la asociación entre el
Dlk1
y
NOTCH1
, nos probó por primera vez la expresión NOTCH1 en lisados de células enteras por Western Blot. Se encontró que la sobreexpresión de
DLK1
podrían regular al alza la expresión NOTCH1 tanto en H520 y H1299 células (Figura 3A y D). Debido a la activación NOTCH1 es seguido por su escisión en el NICD y translocación de la NICD en el núcleo para una mayor regulación transcripcional, la cantidad de NICD en los núcleos podría reflejar actividad de la vía Notch. Se extrajeron las proteínas nucleares de H520 células transfectadas transitoriamente con
Dlk1
o nula en vectores y se examinó la cantidad de INET mediante Western Blot. Los resultados mostraron que NICD transloca en núcleos más intensamente después de la sobreexpresión de
DLK1
comparación con el control null (Figura 3B). Por otra parte, la expresión de
HES1
, un gen diana vía Notch explícita, también fue examinado por PCR en tiempo real en H520 y H1299 células. Había una regulación positiva significativa de
HES1
después de la estimulación de
DLK1
expresión en comparación con el control nulo tanto en las células (p-value & lt; 0,05, Figura 3C y E). Por el contrario, la disminución de la expresión de NOTCH1 y HES1 se detectó mediante transferencia Western y PCR en tiempo real, respectivamente, cuando la expresión DLK1 se agotó por RNAi en células A549 (Figura 3F y G).
A, que muestra la transferencia Western NOTCH1 expresión en células H520 después de transfección con
Dlk1 gratis (H520-Dlk1) o vector nulo (H520-pcdb) examinó en lisados de células enteras. GAPDH se utilizó como control interno. B, inmunotransferencia de tipo Western evaluar la expresión NICD nuclear en las células H520-Dlk1 andH520-pcdb. TBP se utilizó como control interno. C, un histograma para la expresión de mRNA relativa de gen diana Notch
HES1
en las células H520-H520 y Dlk1-pcdb detectados por el análisis de PCR en tiempo real. Se utilizaron células H520-pcdb como control, y su nivel de expresión de
HES1
fue establecido en 1.
18S ribosomal RNA
se utilizó como control interno. D, transferencia de Western que muestra la expresión de NOTCH1 en células H1299 transfectadas con
DLK1
(H1299-Dlk1) o vector null (H1299-pcdb). GAPDH se utilizó como control interno. E, un histograma que presenta la expresión de mRNA relativa de
HES1
en las células H1299-H1299 y Dlk1-pcdb detectados por el análisis de PCR en tiempo real. F, la expresión de NOTCH1 en el citoplasma se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western en células A549 transfectadas transitoriamente con
DLK1
siRNA (A549-si-Dlk1) o control nulo siRNA (A549-NC). GAPDH se utilizó como control interno. G, en tiempo real, análisis de PCR de la expresión de mRNA relativa de
Hoteles en HES1 A549-si-Dlk1 y las células A549-NC, y presentado en un histograma. Los experimentos se realizaron por triplicado (* t-test, p-valor & lt; 0,05).
Dlk1
regulada
MMP9
expresión parcialmente a través de vía de señalización Notch
Para determinar si
DLK1
upregulated
MMP9
expresión de una manera dependiente de la señalización de Notch, se aplicó L-685458, que es un inhibidor de la γ-secretasa (GSI) que NOTCH1 suprime la escisión de dominio intercelular por γ-secretasa, lo que inhibe la actividad de señalización Notch. La expresión relativa de
MMP9
durante la estimulación de
DLK
1 de expresión, con o sin el tratamiento GSI se analizó por PCR en tiempo real. Los resultados mostraron que cuando la señalización de Notch fue bloqueada por el tratamiento con L-685458,
Dlk1
estimulada por
MMP9
regulación al alza se redujo significativamente (Figura 4A), lo que indica la implicación de la señalización de Notch en este reglamento proceso. Por otra parte, también se observó que si bien la actividad de señalización Notch fue suprimida a un nivel comparable con la falta de
Dlk1
sobreexpresión (denotado por
HES1
expresión en la figura 4B, Dlk1 + /+ GSI en comparación con Dlk1 - /+ GSI, prueba t p-valor = 0,078), la expresión de
MMP9
no siguieron la misma tendencia, lo que sugiere que
Dlk1
también podría regular
MMP9
expresión a través de la transducción de las vías de señalización que no sea Notch. La expresión de
HES1
, que es un gen diana de la vía de señalización de Notch, se evaluó en paralelo como un indicador de la actividad de señalización Notch (Figura 4B).
A, un gráfico de barras de la expresión de ARNm de
MMP9
detectado por PCR en tiempo real en las células H520 con o sin
Dlk1
sobreexpresión y con o sin tratamiento GSI. El grupo con ninguno de
Dlk1
estimulación ni tratamiento GSI (dlk- /GSI-) se utilizó como control, y el nivel de expresión de
MMP9
se establece en 1.
18S
ARN ribosomal se utilizó como control interno. B, la expresión de
HES1
evaluadas por PCR en tiempo real en paralelo a
MMP9
expresión se muestra en un gráfico de barras, lo que indica las actividades de señalización Notch en
Dlk1
sobreexpresión o GSI tratamiento. Los experimentos se realizaron por triplicado (* t-test, p-valor & lt; 0,05).
Discusión
Los estudios sobre
Dlk1
han revelado sus funciones de la diferenciación y la proliferación celular [5], [6], [10]. También se ha informado de que
DLK1
se expresa de forma aberrante en diversos tipos de cánceres humanos, incluyendo el cáncer no microcítico de pulmón de células [14], [16], [22], [23]. Estos estudios en los cánceres humanos se centraron principalmente en la expresión anormal de
Dlk1
pero no explorar su asociación con la metástasis del cáncer. Nuestro trabajo previo sobre los genes asociados a metástasis en pulmón humano SCC sugirió que
Dlk1
podría funcionar en la metástasis tumoral (datos no mostrados). En el presente estudio, hemos validado que la sobreexpresión de
DLK1
podrían aumentar la capacidad invasiva de las células de cáncer de pulmón (como en la Figura 1 se muestra), que es consistente con nuestros hallazgos anteriores derivados de perfiles de expresión génica y se extiende nuestro conocimiento de función de Dlk1 en el cáncer humano
.
Aunque la proteína DLK1 carece del motivo DSL, que se cree que juega un papel clave en las interacciones ligandos 'con receptores Notch, una interacción entre DLK1 y el receptor de NOTCH1 se ha demostrado en una levadura sistema de dos híbridos [19]. Sin embargo, el efecto de Dlk1 en la vía de señalización Notch es todavía controvertida [4], [5], [19]. Baladron et al. sugiere que el efecto de
Dlk1
de señalización Notch es diferente entre los
Dlk1
variantes. Considerando secretada DLK1 puede funcionar como un antagonista de Notch, membrana DLK1 puede activar Notch. Nuestros resultados demuestran que una mezcla de membrana y secretada DLK1 pueden activar la señalización de Notch en células de cáncer de pulmón humano. El uso de una mezcla de
DLK1
variantes aquí se llevó a cabo en un esfuerzo por imitar las situaciones in vivo. Además de la activación de Notch de señalización, también se observó una regulación al alza de la expresión NOTCH1 durante la estimulación de
Dlk1
sobreexpresión. En particular, la activación de la señalización de Notch por
DLK1
puede ser un efecto combinado de la regulación al alza de la expresión y la escisión NOTCH1 NOTCH1 estimulada por la unión DLK1. Además, la expresión aberrante de NOTCH1 se encuentra en varios tipos de cánceres humanos [24], [25], incluyendo el cáncer no microcítico de pulmón de células [26], [27]. Debido a que nuestro estudio sugiere una relación entre el regulador
Dlk1
y
NOTCH1
, es natural que la hipótesis de que la expresión anormal de NOTCH1 en los cánceres es en parte la consecuencia de la expresión aberrante de Dlk1.
se encontró que el
Dlk1
-promoted invasión de células de cáncer de pulmón se asoció con la regulación positiva de la expresión de MMP9 y su actividad extracelular (Figura 2), que están implicadas en la degradación de ECM y altamente asociados con la invasión tumoral [ ,,,0],20]. Además, examinó si la señalización de Notch participó en
Dlk1 expresión de MMP9
-regulated utilizando un GSI para bloquear la señalización de Notch y luego evaluar la respuesta de MMP9 durante la estimulación de
Dlk1
expresión. Se observó una disminución significativa en la expresión de MMP9 elevado cuando la señalización de Notch fue bloqueada (Figura 4). Curiosamente, también se observó que
Dlk1
aún podría moderadamente regular positivamente la expresión de MMP9 cuando la vía de señalización Notch fue bloqueado, lo que implica que
Dlk1
puede funcionar en la invasión del cáncer, tanto en la señalización de Notch-dependiente y -independiente modales. A pesar de la interacción de DLK1 y NOTCH1, también se ha informado de que DLK1 podría funcionar en otras vías de señalización. Por ejemplo, puede interactuar con DLK1 IGFBP1 /IGF-1 complejos y activar receptor IGF señalización [6], y también puede aumentar la fosforilación de MEK /ERK y activar MEK /ERK señalización [28], [29]. Nuestro trabajo también sugirió que podría Dlk1 activa la señalización NF-kB (datos no mostrados). Teniendo en cuenta que las vías de señalización en una celda tienen significativa la diafonía y la transcripción de genes que están regulados por una combinación de diferentes vías, que creemos que sea lógico y dependiente de la dosis, no es sorprendente que
Dlk1
podría mejorar la invasión de células a través de múltiples vías.
en conclusión, los datos presentados en este estudio demostró el papel de
Dlk1
en el cáncer de invasión y exploró el mecanismo molecular detrás de esta función, por lo que
Dlk1
un nuevo gen candidato en los estudios de la metástasis del cáncer.