Extracto
Aplicaciones
Para proporcionar información funcional adicional para la caracterización del tumor, se investigó el uso de energía dual tomografía computarizada para obtener imágenes de los tumores de pulmón murino. el volumen de sangre del tumor y permeabilidad vascular se cuantificaron utilizando nanopartículas de oro y de yodo. Este enfoque se comparó con un método de agente de contraste CT individual /de una sola energía.
Ex vivo
estudios de validación se realizaron para demostrar la veracidad de los
in vivo
contraste agente de cuantificación mediante TC.
Métodos
tumores pulmonares primarios se generan en
LSL-Kras
G12D; p53
FL /FL
ratones. Se inyectaron nanopartículas de oro, seguido de nanopartículas de yodo dos días más tarde. El oro acumula en los tumores, mientras que el yodo proporcionado contraste intravascular. Tres tomografías computarizadas de doble energía se realizaron de dos para el método de agente de contraste individual y una para el método de doble agente de contraste. Las concentraciones de oro y de yodo en cada exploración se calcularon utilizando una descomposición de energía dual. Para cada método, el volumen de sangre fraccionada tumor se calculó basándose en la concentración de yodo, y se estimó la permeabilidad vascular del tumor basado en la concentración de oro acumulada. Para la validación, las mediciones obtenidas por TC se compararon con las mediciones de la histología y la espectroscopia de emisión óptica de plasma de acoplamiento inductivo de las concentraciones de oro en los tejidos.
Resultados
La TC de energía dual habilitado
in vivo
separación de agentes de contraste de oro y yodo y mostró captación de nanopartículas de oro en el bazo, el hígado y tumores. Las mediciones de volumen de sangre fraccionada tumorales determinados a partir de los dos métodos de imagen estaban de acuerdo, y una alta correlación (R
2 = 0,81) se encontró entre el volumen de sangre fraccionada se mide la densidad microvascular y la histología derivados. mediciones de la permeabilidad vascular obtenidos a partir de los dos métodos de imagen son concordantes con
ex vivo
mediciones.
Conclusiones
CT
energía dual usando dos tipos de nanopartículas es equivalente a la única nanopartícula método, pero permite la medición del volumen de sangre fraccionada y la permeabilidad con una sola exploración. Según lo confirmado por
ex vivo
métodos, las concentraciones de nanopartículas obtenidas por TC son muy precisas. Este método podría desempeñar un papel importante en la caracterización de tumores de pulmón mediante TC
Visto:. Ashton JR, Clark DP, Moding EJ, Ghaghada K, Kirsch DG, West JL, et al. (2014) Dual-Energy Micro-CT Imágenes funcionales del cáncer de pulmón primario en ratones con oro y yodo Agentes de nanopartículas de contraste: un estudio de validación. PLoS ONE 9 (2): e88129. doi: 10.1371 /journal.pone.0088129
Editor: Tania V. Kalin, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 5 Septiembre, 2013; Aceptado: 6 Enero 2014; Publicado: 10 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Ashton et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de un /Centro Nacional de Salud para la concesión del Centro de Recursos Recursos de Investigación Nacional de Tecnología Biomédica (P41 EB015897) (CTB), y de la National Cancer Institute (U54 CA151668 jlw). Otro tipo de apoyo fue proporcionada por el NIH /NCI R21 CA175839 y NIH /Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas K02 AI093866 (DGK). JRA es apoyado por un médico científico de Formación Programa de Formación Grant (T32 GM007171) y una Beca Institucional de Duke. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. KG tiene opciones sobre acciones en Marval Biosciences, una empresa de nueva creación que persiguen el desarrollo de un agente de contraste yodado CT liposomal. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer
pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y el número de muertes atribuidas de pulmón se espera que el cáncer de aumentar un 50% en 2020 [1]. La tomografía computarizada (TC) es la prueba de imagen estándar para la evaluación de pacientes con sospecha de cáncer de pulmón. Por desgracia, los nódulos pulmonares malignos y benignos a menudo muestran características radiográficas similares en la TC [2], por lo que la malignidad no siempre se puede identificar y tratar adecuadamente. En el Nacional de Cáncer de Pulmón Screening Trial (NLCST), la prueba CT en pacientes de alto riesgo reducido la mortalidad específica por cáncer de pulmón [3], y los Servicios Preventivos Task Force Estados Unidos ha recomendado recientemente la detección del cáncer de pulmón CT de rutina para pacientes de alto riesgo; sin embargo, esta prueba de detección conduce inevitablemente a la detección de nódulos pulmonares pequeños (& lt; 1 cm) que no están bien caracterizados por técnicas de imagen disponibles actualmente (PET, CT, o MRI) [4]. El NLCST demostró que la mayoría de estos nódulos no son clínicamente significativos. En consecuencia, existe la necesidad de ampliar la información proporcionada por la TC para la caracterización de nódulos, tanto para la caracterización de tumores conocidos y para diferenciar los tumores malignos detectados recientemente de nódulos benignos.
Un método potencial para la caracterización adicional del tumor es estudiar la vasculatura del tumor de pulmón. La angiogénesis es un factor clave en el crecimiento del cáncer y la metástasis. En particular, la angiogénesis promueve el crecimiento tumoral mediante el suministro de los tumores con nutrientes requeridos y proporciona un conducto para la diseminación metastásica. vasculatura del tumor formado por la rápida angiogénesis tiende a ser menos bien organizado y más permeable que la vasculatura normal [5]. La densidad de la vasculatura del tumor, que a menudo se correlaciona con la extensión de la angiogénesis, se relaciona con la agresividad del tumor y se puede correlacionar con la supervivencia [6]. También hay pruebas de que la extensión de la vascularización y la permeabilidad vascular difiere entre nódulos pulmonares benignas y malignas [7]; Sin embargo, se necesitan estudios más amplios, los cuales se realizan mejor a nivel preclínico para dilucidar la importancia de estos biomarcadores vasculares en el cáncer de pulmón.
A partir de estudios preclínicos en ratones, hemos demostrado previamente que los pulmones indolente y agresivo tumores pueden diferenciarse utilizando solo energía micro-CT y un liposomal que contiene yodo (Lip-I) agente de contraste [8]. Aumento de la acumulación de las nanopartículas (debido a aumento de la permeabilidad vascular) se demostró en los tumores más agresivos en comparación con los indolentes, mientras que la densidad vascular fue similar en los dos tipos de tumores. Los experimentos de agente de contraste solo requieren dos tomografías computarizadas separadas por varios días para permitir la depuración de la sangre completa del agente de contraste con el fin de cuantificar y diferenciar la señal vascular de la señal de la acumulación del tumor. El retraso entre principios y técnicas en fase tardía puede no ser necesario si se adopta una solución más elegante que implica dos tipos distintos de nanopartículas y los métodos de imagen de TC como espectral o de energía dual (DE) CT.
DE proyección de imagen es una técnica avanzada que recientemente se ha elevado a la vanguardia de la tecnología de la TC [9]. La absorción de los rayos X por los agentes de contraste depende en gran medida tanto el peso atómico del agente de contraste y la energía del rayo X incidente. Por lo tanto, dos materiales de diferente peso atómico se pueden diferenciar una de otra en base a sus coeficientes de atenuación únicos en dos energías de rayos x diferentes. DE-CT permite la visualización selectiva y cuantificación de varios agentes de contraste en una sola exploración. DE-TC ha hecho progresos significativos en la imagen clínica del cáncer. Para los tumores de pulmón, se ha demostrado que el aumento de yodo en las exploraciones clínicas DE-CT puede correlacionarse con el SUV
máximo de
18FDG- PET [10], [11], que muestra que el DE-CT tiene el potencial para extender más allá de la TC de imágenes puramente anatómica de la imagen funcional y molecular. Si bien el documento DE-TC muestra promesa de alta en la clínica por imagen del cáncer, no ha sido adoptado en gran medida en el dominio preclínico debido a los desafíos asociados con una resolución más alta resolución espacial, temporal, y los niveles de ruido en la micro-CT. Sin embargo, nosotros hemos sido Dirección capaces algunos de estos retos y hemos demostrado que el DE micro-CT uso de nanopartículas como agentes de contraste pueden desempeñar un papel importante en la formación de imágenes preclínico para cardíaco [12], de pulmón [13], y las aplicaciones de cáncer [14] , [15].
agentes de contraste de nanopartículas son esenciales para los estudios preclínicos TC porque los agentes de contraste convencionales se eliminan de la sangre demasiado rápido para imágenes eficaz. La mayoría de los modelos preclínicos con animales, especialmente los ratones, son capaces de vía renal claras peso molecular agentes de contraste clínicos bajos de la sangre en cuestión de segundos (normal, la semivida en sangre en los seres humanos es de 2-3 horas [16]), debido a su extremadamente alto gasto cardíaco. Las nanopartículas utilizadas como agentes de contraste CT típicamente tienen una larga (& gt; 2 horas) vida media y también tienden a acumularse en los tumores debido a la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto [17]. La utilidad de estos agentes en la TC preclínica ha sido bien establecida [14], [18] - [24]
Recientemente hemos desarrollado un método DE micro-CT para separar las nanopartículas de oro y base de yodo para. imágenes vasculares en los sarcomas de tejidos blandos [14]. En este método, las nanopartículas de oro se inyectan y permite que se acumulen en el tejido tumoral durante dos días. a continuación, se inyecta yodo liposomal y seguido inmediatamente por una exploración de CT DE-mientras que el yodo se mantiene intravascular. La permeabilidad vascular (tasa de captación de nanopartículas tumor) se calcula usando la concentración de oro medido en los tejidos, mientras que el volumen de sangre se calcula a partir de concentraciones de yodo de tejido. El presente trabajo tiene como objetivo aplicar el método de micro-CT DE a la difícil tarea de los tumores de pulmón de imagen para la cuantificación del volumen sanguíneo del tumor y la permeabilidad vascular. En este estudio, mostramos que el método de dos agente de contraste (de dos materiales), lo que requiere una sola tomografía computarizada, se compara favorablemente con nuestro método de agente de contraste sola previamente publicado (monomaterial), que requiere dos tomografías computarizadas espaciados varios días aparte [8]. Es importante destacar que, también apuntamos para validar nuestros
in vivo
resultados de doble energía con
ex vivo
medidas estándar de oro. A lo mejor de nuestro conocimiento, no se han realizado estudios DE-CT clínico o preclínico publicado con la validación rigurosa de los calculados
in vivo
concentraciones de material. DE mediciones suelen ser calibrados usando
in vitro
fantasmas, que aproximadas, pero no representan plenamente,
in vivo
condiciones. Por lo tanto, existe el potencial de error significativo en las mediciones DE cuando sólo se utiliza en las calibraciones de trazos en vitro. En este manuscrito, que realizamos
in vivo
validación, lo cual es crítico para desarrollar aún más el documento DE-CT para los modelos preclínicos.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las buenas prácticas animal definidos por los organismos nacionales y /o locales pertinentes de bienestar animal, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el Comité de Cuidado y uso de animales Institucional (IACUC protocolo A283-11-11) de Duke University Medical Center. El programa de manejo de los animales Duke University Medical Center está acreditado por la Asociación Americana para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) y cumple con los Institutos Nacionales de las normas de salud como se establece en la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (DHHS publicación No. (NIH) 85-23, Revisión de 1985). La institución también acepta como obligatoria la "Política de Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por las instituciones del Adjudicatario" PHS y "Principios del NIH para la Utilización y Cuidado de Animales Vertebrados Utilizados en Experimentación, Investigación y Formación.".
El yodo liposomal fabricación
yodo liposomal fue producida como se ha descrito anteriormente [25]. Una mezcla de lípidos (200 mmol /L) que consiste en 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol, y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi ( polietilenglicol) -2.000] (DSPE-MPEG 2000) en un 55:40: relación molar 5 se disolvió en etanol y se hidrataron con una solución iodixanol concentrado (550 mg de I /ml). La solución de lípidos resultante se extruyó de forma secuencial en un extrusor de Lipex Thermoline (Northern Lipids, Vancouver, Columbia Británica, Canadá) para el tamaño de los liposomas a ~ 100 nm. La solución de liposomas se diafiltró utilizando un módulo MicroKros® (Spectrum Laboratories, Milpitas, CA) para eliminar iodixanol un-encapsulado.
liposomal yodo Caracterización
La distribución del tamaño de los liposomas en la formulación final fue determinado por dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando un Malvern Zetasizer nanoSERIES (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) a 25 ° C. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) se realizó para el análisis de tamaño adicional y caracterización agente de contraste. Los liposomas estaban en un lugar seco sobre una rejilla de película de carbono y la imagen utilizando un FEI Tecnai G
2 cama TEM (FEI, Hillsboro, Oregón) a una tensión de 120 mV. diámetro de partícula se midió durante 200 liposomas usando ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH). La concentración de yodo en la solución liposomal final se cuantificó midiendo la absorbancia UV a 245 nm utilizando un espectrofotómetro Cary 50 (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA).
In vitro
estabilidad de los liposomas se verificó midiendo la liberación de iodixanol de los liposomas después de la incubación en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C durante 72 horas. La concentración de iodixanol en libertad después de la incubación se determinó mediante diálisis de los liposomas en presencia de 500 ml de PBS y midiendo la absorbancia UV del dializado en una cubeta de cuarzo.
Oro de nanopartículas de fabricación
Las nanopartículas de oro (AuNPs) fueron producidos usando el método de Frens [26]. 500 ml de una solución 1 mM de HAuCl
4 en agua ultrapura se lleva a ebullición. Una solución pre-calentado de 540 mg de citrato de sodio disuelto en 3 ml de agua se inyecta rápidamente en la solución de oro y la mezcla resultante se agitó vigorosamente. El color cambió de amarillo a incoloro a rojo oscuro en el transcurso de 30 segundos. La reacción se continuó a ebullición durante 15 minutos, después de lo cual el recipiente de reacción se retiró de la fuente de calor y se deja enfriar con agitación continua durante 1 hora. Después de enfriar, las nanopartículas se filtraron usando un filtro de polietersulfona 0,45-micras. Para pasivar las nanopartículas producidas, un gran exceso de 5 kDa polietilenglicol terminado en tiol (PEG; Laysan Bio, árabe, AL) se añadió a las nanopartículas filtradas, que luego fueron sacudieron a temperatura ambiente durante 4 horas. moléculas de PEG no unidos se retiraron y las partículas se concentraron usando un filtro centrífugo 100 kDa.
nanopartículas Caracterización oro
La distribución de tamaño y carga superficial de las nanopartículas de oro se caracterizaron por DLS y el potencial zeta usando un Malvern Zetasizer nanoSERIES a 25 ° C. distribución del tamaño de DLS fue confirmada por TEM utilizando un FEI Tecnai G
2 cama TEM que opera a 200 mV. diámetro de partícula y relación de aspecto se midieron por 200 AuNPs utilizando ImageJ. Los espectros de absorbancia de AuNPs en suspensión en el agua ultrapura se obtuvieron de 400 a 650 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. La estabilidad de las nanopartículas pegiladas frente a la agregación se confirmó mediante el control del espectro de UV-Vis durante 6 horas después de la adición de soluciones salinas fisiológicas de NaCl al 0,9% o medio Eagle modificado (DMEM) medio de cultivo de Dulbecco con 10% de suero bovino fetal (FBS) a las soluciones de desnudo o pegilado AuNPs. La concentración final de oro en la solución AuNP concentrado se determinó por UV-Vis absorbancia utilizando el coeficiente de extinción publicado del 12 AuNPs nm a 450 nm [27] y se correlacionó posteriormente con las mediciones de espectroscopia de emisión óptica de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-OES ), como se describe a continuación.
En Vivo
imágenes de tumores
Los tumores de pulmón se generaron mediante inyección intranasal de adenovirus que expresan la recombinasa Cre (transferencia de genes del vector Core, Universidad de Iowa) en
LSL-Kras
G12D; p53
FL /FL
compuesto de ratones mutantes como se describe anteriormente [28] - [30]. Los ratones con tumores primarios de pulmón se usaron para el estudio de formación de imágenes a las 12 semanas después de la infección Adeno-Cre, momento en el que varios adenocarcinomas de pulmón agresivos (~0.5-1.5 mm de diámetro) estaban presentes dentro de cada ratón. Todos los animales fueron imágenes en 24-30 semanas de edad. Un total de cinco animales se utilizó para el estudio de imágenes. Debido a la naturaleza longitudinal de este estudio, cada ratón sirvió como su propio control.
Longitudinal DE proyección de imagen micro-CT se realizó en todos los animales como se muestra en la Figura 1. Tres exploraciones DE micro-CT se realizaron para cada ratón con el fin de comparar el método de una sola materia (TC 1 y 2) con nuestro nuevo método de dos materiales (TC 3). Observamos que, al contrario que en nuestro estudio anterior [14], el documento DE-micro-CT se llevó a cabo incluso cuando se utiliza un agente de contraste único, lo que nos permitió medir la concentración de oro sin la necesidad de un análisis previo a la diferencia de comparación. En el día 1, el agente de contraste AuNP se inyectó intravenosamente por la vena de la cola a una dosis de volumen de 0,32 ml /25 g de peso corporal y las exploraciones después de la inyección (TC 1) fueron adquiridos inmediatamente. entonces esperamos 48 horas para dar tiempo suficiente para la acumulación de oro que se produzca en los tumores. Después de este retraso (día 3) una segunda tomografía computarizada de energía dual (TC 2) se obtuvo. Inmediatamente después de la segunda exploración, el agente de contraste de yodo liposomal se inyectó por vena de la cola a una dosis de volumen de 0,3 ml 25 g de peso corporal /y tercera TC de energía dual (TC 3) se realizó. Después de la tercera exploración, los ratones fueron sacrificados y los tejidos se recogieron para estudios de validación, como se describe a continuación.
AuNPs fueron inyectados en el día 1, seguido inmediatamente por tomografía computarizada 1. Dos días más tarde, TC 2 se llevó a cabo , seguida inmediatamente por la inyección de labios-I y CT scan 3. Todas las exploraciones fueron de doble energía adquisiciones micro-CT.
dual-Energy micro CT-Sistema
Un hecha a la medida sistema de imagen micro-CT de doble fuente se utilizó para el estudio [31]. Los animales fueron escaneados mientras que la respiración libre bajo anestesia usando 2-3% isoflurano entregado por la nariz de cono. La temperatura corporal se mantuvo con lámparas de calor, una sonda rectal, y un controlador de realimentación (Digi-Sense®, Cole Parmer, Chicago, IL). control del movimiento respiratorio prospectivo se utiliza para minimizar los efectos del movimiento respiratorio de los animales durante los análisis [32]. Una almohada neumática colocado sobre el tórax de los animales conectado a un transductor de presión se utiliza para supervisar la respiración. Una aplicación de LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) se utilizó para monitorizar la señal respiratoria y desencadenar los tubos de rayos X en el final de la espiración mediante el cálculo de un intervalo de tiempo fijo desde el pico de la señal respiratoria. Las adquisiciones se realizaron para ambas cadenas de formación de imágenes en cada ángulo de rotación con un retraso de 10 ms entre las dos exposiciones tubo de rayos X para minimizar transversal de dispersión. Dado que este es un retraso muy corto respecto a la longitud de la fase final de la espiración plana, que no afecta el rendimiento de gating respiratorio. Un total de 360 puntos de vista fueron adquiridos por cada cadena de imagen sobre la rotación de 360 °. Cada escaneo cerrada de forma prospectiva-tomó aproximadamente 7 minutos para completar. Los parámetros de análisis para las exploraciones de doble energía fueron: 80 kVp, 160 mA, 10 ms /exposición de la primera cadena de imágenes y 40 kVp, 250 mA, 16 ms /exposición para la segunda cadena de imagen. La dosis total de radiación asociada con los tres TC fue de 0,39 Gy.
post-procesamiento y de doble energía de descomposición
procesamiento de datos DE micro-CT siguieron el diagrama de flujo en la Figura 2. Raw 40 kVp y 80 kVp conjuntos de datos se reconstruyeron utilizando el algoritmo Feldkamp [33] en una matriz de 512 × 512 × 512 en tamaño de vóxel isotrópico 88-m. afín de registro se llevó a cabo para mejorar el registro correspondiente entre el 40 y el 80 kVp reconstruido utilizando volúmenes de hormigas, un código abierto, kit de herramientas de registro basado en ITK (Herramientas avanzadas de normalización, http://picsl.upenn.edu/ANTS/; SVN 1409; [ ,,,0],34], [35]). Para mejorar la descomposición, cada conjunto de datos fue sin ruido utilizando filtración mixta bilateral (BF). BF conjunta es una extensión espectral del filtro de suavizado de bordes preservar bien caracterizado que tiene en cuenta la distribución de los voxels vecinos tanto en el espacio como en intensidad. BF conjunta fue implementado utilizando MATLAB (The MathWorks, Natick MA), y completa generalmente dentro de 15 a 20 minutos por juego de energías. Los detalles de la aplicación de BF conjunta a murino de datos micro-CT [36] y una evaluación cuantitativa de la aplicación de BF con el documento DE micro-CT [13] se han descrito anteriormente
.
Raw 40 kVp y 80 kVP conjuntos de datos fueron adquiridos, y luego se sometieron a registro afín y filtración bilateral conjunta para producir conjuntos de datos filtrados. la descomposición de energía dual se realizó en estas imágenes filtradas, lo que resultó en dos imágenes independientes (mapas) que representan la concentración de yodo y oro en cada voxel. Una vez obtenidos los dos mapas, las imágenes se superpusieron y los huesos fueron segmentados a cabo (a color blanco) para formar la capa final de los mapas de concentración. Estas imágenes fueron tomadas de tomografía computarizada 3, en el que tanto el yodo y el oro estaban presentes en el torrente sanguíneo. La barra de escala representa 1 cm de todas las imágenes. Las 40 imágenes y 80 kVp se Windowed -300 a 1200 HU, los mapas de yodo son de ventana a partir 0,25 a 15 mg /ml, y mapas de oro son de ventana a partir 0,25 a 6 mg /ml.
dE descomposición de oro y el yodo se realizó después de registrarse y filtración, con el correspondiente 80 y 40 datos filtrados-kVp, como se describe anteriormente [14], [37]. Para cada voxel, la descomposición involucrado resolver un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, C
I y C
Au, que representan las concentraciones de yodo y oro, respectivamente, dentro del voxel dado. El valor medido la atenuación CT en cada voxel representa una combinación lineal de las concentraciones de oro y yodo desconocidos en mg /ml multiplicado por los coeficientes de la matriz de sensibilidad CT como se muestra en las siguientes ecuaciones:
Aquí, C
I y C
Au son las concentraciones desconocidas de yodo y oro, respectivamente, en un voxel, CT
40 y CT
80 son las atenuaciones medidas en el voxel en 40 y 80 kVp, y CT dado
I, 40, CT
I, 80, CT
Au, 40 y CT
Au, 80 son coeficientes de la matriz de sensibilidad constante para el yodo y el oro-determinada empíricamente a los 40 y 80 kVp en atenuación medida (unidades HU) por la concentración de agente de contraste (mg /ml). Las concentraciones desconocidas de yodo y de oro en cada voxel se determinaron mediante la inversión de esta matriz sensibilidad y la búsqueda de la solución de mínimos cuadrados de la siguiente sistema de ecuaciones en MATLAB:
energías de exploración para el oro y la descomposición óptima de yodo fueron escogidos tras la resultados de nuestras simulaciones anteriores y
in vitro
estudios [37]. Estos estudios mostraron que la diferencia espectral máxima entre el oro y el yodo para fuentes de rayos X policromáticos se produjo en los voltajes de funcionamiento de 40 y 80 kVp. Los valores para los coeficientes de la matriz de sensibilidad en cada energía (CT
I, 40, CT
I, 80, CT
Au, 40, y CT
Au, 80) se determinaron empíricamente utilizando una cuerpo de calibración tal como se describe anteriormente [14]. Para la calibración fantasma, la atenuación CT de viales de conocida concentración de oro y el yodo se midieron a 40 y 80 kVp, y los coeficientes para la matriz de sensibilidad se determinó ajustando el oro conocido y concentraciones de yodo a la atenuación CT medida usando un lineal menos cuadrados de regresión en cada nivel de energía. Los valores derivados de la TC
I, 40, CT
I, 80, CT
Au, 40 y CT
Au, 80 usado en este estudio fueron 28.7, 42.6, 88.5, y 58.8 HU /mg /mL, respectivamente. Después de la descomposición, voxels con concentraciones negativos de ambos materiales se ponen a cero. Voxels con una concentración negativo de un material y una concentración positiva del otro material se proyectaron en el subespacio de concentración positivo.
in vitro
validación de este método de descomposición utilizando fantasmas tanto digitales como físicos se ha demostrado en nuestro trabajo previo [14]. Estos estudios demostraron la capacidad de validación de este método de descomposición para medir con precisión las concentraciones de oro y de yodo, tanto cuando son independientes el uno del otro y cuando están presentes en el mismo voxel.
Image Analysis
CT las imágenes fueron analizados utilizando Avizo (FEI Visualización Sciences Group, Burlington, MA). Regiones que corresponden a la sangre (luz ventricular y grandes vasos) y el bazo fueron segmentados de forma automática utilizando el conjunto de datos de 80 kVp, mientras que las regiones correspondientes al hígado y los riñones fueron segmentados de forma semiautomática utilizando el mismo conjunto de datos. Cada región segmentada incluye todo el órgano, pero excluidos los grandes vasos sanguíneos dentro del órgano. Los tumores se dividen en segmentos semi-automáticamente usando el mapa de oro de la descomposición de energía dual. regiones en bruto se extrajeron manualmente fuera de las fronteras del tumor, y esas regiones se thresholded seleccionar sólo a los voxels que contenían una concentración de oro entre 0,25 mg /ml y 3 mg /ml. Estos valores umbral se eligieron con el fin de excluir el parénquima normal de pulmón, vasos sanguíneos grandes, y hueso de los tumores segmentados. Se identificaron un total de 27 tumores de pulmón en los 5 ratones y segmentado en cada una de las exploraciones de micro-CT 3 DE.
Tras la segmentación, las concentraciones de yodo de oro y se midieron en cada región segmentada de interés mediante el cálculo de la media valor del oro y mapas de yodo en toda la región de interés. Debido a que tanto las nanopartículas son agentes de contraste de vida media larga, permanecen casi en su totalidad dentro de la vasculatura inmediatamente después de la inyección. El volumen de sangre fraccionada (FBV) de cada órgano puede, por lo tanto, estimarse midiendo el oro o la concentración de yodo dentro del órgano inmediatamente después de la inyección de nanopartículas. Se calculó FBV el día 1 utilizando las AuNPs y de nuevo el día 3 utilizando el Lip-I. FBV se calculó por las ecuaciones siguientes: donde C
Au, día 1 es la concentración promedio de oro en un tejido inmediatamente después de la inyección de oro en días 1, C
Au, sangre, day1 es la concentración promedio de oro en la sangre segmentado en el día 1, C
I, day3 es el promedio de concentración de yodo en un tejido inmediatamente después de la inyección del labio-I, y C
I, sangre, day3 es la concentración de yodo promedio medido en la sangre segmentado en el día 3. FBV se calculó para cada tumor segmentado, el bazo, el hígado y los riñones en ambos puntos temporales. Esta calculado FBV es una estimación de la densidad vascular en el tejido, y se correlacionó con la densidad microvascular calculado por el análisis de imágenes de secciones de tejidos histológicos, como se describe a continuación
.
Después de determinar la FBV en cada tejido, la concentración de oro acumulado dentro de cada tejido se calculó. Debido a su larga vida media en sangre, más de la mitad del agente de contraste inyectado permanecido en el flujo de sangre en el día 3. Por lo tanto, la concentración de oro tejido medido en el mapa de oro CT incluye tanto oro que extravasada en el tejido y el oro que se mantiene intravascular dentro del tejido. El FBV calculado anteriormente se puede utilizar para restar la concentración de oro intravascular de acuerdo con las siguientes ecuaciones: donde C
Au, acum es el (extravascular) concentración acumulada de oro en un tejido, C
Au, tot es el total de oro concentración en un tejido calculado a partir del mapa de oro CT en el día 3, C
Au, iv es la concentración de oro dentro de un tejido que permanece intravascular, y C
Au, la sangre es la concentración de oro en la sangre mayor calculado a partir del mapa de oro CT en el día 3. Estas ecuaciones se utilizaron para calcular el oro acumulado dentro de cada tumor y el órgano. Para el método de agente de contraste única, el FBV del TC 1 y las concentraciones de oro de TC 2 se utilizaron en estos cálculos. Para el método de agente de contraste de dos, las concentraciones FBV y oro eran ambos de TC 3. Para la validación, estas concentraciones acumuladas de oro se compararon con concentraciones de oro en cada órgano medido por ICP-OES.
Los estudios de validación
procesamiento de tejidos.
las muestras de sangre, tumores de pulmón y otros órganos (riñones, hígado, bazo) se extrajeron de todos los ratones para el análisis. Se extrajo sangre de los ratones después de la primera exploración CT de la vena facial. Una extracción de sangre y la extracción de órganos terminales se llevaron a cabo después de la tercera tomografía computarizada. Cada ratón se puso bajo anestesia profunda por una inyección intraperitoneal de pentobarbital. La anestesia fue verificada mediante pizca dedo del pie. La cavidad abdominal se abrió y se extrajo sangre lentamente de la vena cava inferior, mientras que el corazón seguía latiendo. 0.5-1.0 ml de sangre se recogió de cada ratón, después de lo cual se cortaron la vena cava inferior y la aorta y se dejó que la sangre que queda para drenar en la cavidad abdominal. a continuación, La tráquea se canuló con una aguja de calibre 20, a través del cual se inyecta una mezcla 01:01 de cryoembedding medio (OCT) y 30% de sacarosa en los pulmones para llenar los espacios aéreos para seccionar los tejidos más tarde. Después de la inflación con medio de inclusión, se extrajeron los pulmones desde el ratón y, o bien inmediatamente disecados para los tumores de pulmón o incrustados en OCT y se congelaron en hielo seco. Los tumores de pulmón extraídos de los pulmones disecados se empaparon en PBS durante 5 minutos para enjuagar la sangre residual y después se congelaron a -80 ° C para el análisis de ICP-OES. Después de la extracción de pulmón, el hígado, el bazo y los riñones de cada ratón se recogieron y se cortan por la mitad. La primera mitad de cada órgano se ha incrustado en OCT inmediatamente en hielo seco durante el corte. La segunda mitad fue empapado en PBS durante 5 minutos y se congeló a -80 ° C para el análisis ICP-OES. Todos los tejidos se mantuvieron congeladas a -80 ° C hasta que esté listo para su posterior procesamiento.
Histología.
8 micras secciones congeladas de tumores se immunostained para el marcador CD31 endotelial celular. Antes de la tinción, las secciones fueron fijadas con 4% de paraformaldehído, se aclararon con PBS, y se bloquearon con 10% FBS en PBS durante una hora. Las secciones fueron incubadas con el anticuerpo primario (rata anti-ratón CD31, BD Pharmingen) diluido 1:250 en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos se enjuagaron tres veces con PBS durante 10 minutos para eliminar el anticuerpo primario no unido, después de lo cual el anticuerpo secundario (Alexa Fluor488 conjugado con IgG de burro anti-rata, Invitrogen) diluido 1:500 en el bloqueo se añadió tampón y se incubó durante 1 hora en la oscuridad. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Unos secciones 8-micras también se utilizaron para la hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción. Para H & amp; E tinción, las muestras fueron teñidas con hematoxilina, se enjuagan con agua y etanol, teñidas con eosina Y, a continuación, enjuagar con etanol y xileno y se montaron para microscopía
Immunostained secciones fueron imágenes utilizando un Zeiss invertido Axiovert 135.