Extracto
La chaperona molecular proteoma Hsp90 dependiente representa una red compleja de proteínas de relevancia biológica y médica crítica. Conocido asociar con proteínas con una amplia variedad de funciones denominadas clientes, Hsp90 mantiene vías de señalización esenciales y oncogénicos clave. En consecuencia, los inhibidores de Hsp90 se están probando como fármacos contra el cáncer. El uso de un enfoque sistemático integrado para analizar los efectos de la inhibición de Hsp90 en las células T, cuantificamos los cambios diferenciales en el proteoma Hsp90-dependiente, interactoma Hsp90, y una selección del transcriptoma. comportamientos cinéticos en el proteoma Hsp90 dependientes se evaluaron utilizando una nueva estrategia de pulso-caza (Fierro-Monti et al., el artículo acompañante), efectos sobre la estabilidad de proteínas y la síntesis de detección. impactos dinámicos globales y específicas, incluidas las respuestas proteostatic, se deben a la inhibición directa de la Hsp90, así como los efectos indirectos. Como resultado, se detectó una disminución en la mayoría de las proteínas que cambiaron sus niveles, incluidos los clientes Hsp90 conocidos. Lo más probable, consecuencias del papel de Hsp90 en la expresión de genes determinan una reducción global en
novo
síntesis neta de proteína. Esta disminución parece ser mayor en magnitud que un aumento global de forma concomitante observada en las tasas de descomposición de proteínas. Varios nuevos clientes Hsp90 putativos fueron validados, y curiosamente, las familias de proteínas con funciones críticas, particularmente la familia Hsp90 y cofactores mismos, así como las proteínas quinasas, muestran una mayor fuerza las tasas de descomposición debido al tratamiento inhibidor de la Hsp90. Sorprendentemente, un recrudecimiento de las vías de supervivencia, con la participación chaperones moleculares y varias oncoproteínas, y la disminución de los niveles de algunos supresores tumorales, tienen implicaciones para la terapia contra el cáncer con inhibidores de Hsp90. La diversidad de los efectos globales puede representar un paradigma de los mecanismos que operan para proteger las células del estrés proteotoxic, mediante la promoción de pro-supervivencia y funciones anti-proliferativos. Los datos están disponibles a través de ProteomeXchange con PXD000537 identificador
Visto:.-Fierro Monti I, P Echeverría, Racle J, Hernández C, D Picard, Quadroni M (2013) Impactos dinámicos de la inhibición de la chaperona molecular Hsp90 en el T-Cell Proteoma tener implicaciones para la terapia contra el cáncer. PLoS ONE 8 (11): e80425. doi: 10.1371 /journal.pone.0080425
Editor: Lennart Martens, UGent /VIB, Bélgica
Recibido: 30 de abril de 2013; Aceptado: 2 Octubre de 2013; Publicado: 27 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Fierro-Monti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la beca número 31003A_127256 de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (www.snf.ch), así como la financiación interna de la Universidad de Lausana. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las chaperonas moleculares son fundamentales para Proteostasis celular. Están estrechamente implicados en los procesos biológicos esenciales como la traducción, montaje de plegado, complejo y desmontaje, translocación a través de membranas y la degradación de proteínas [1], [2]. La importancia funcional de las chaperonas moleculares y sus implicaciones en los estados de enfermedad los ha identificado como objetivos principales de drogas en el cáncer [3], [4]. En eucariotas, la proteína de choque térmico 90 (Hsp90) desempeña un papel distintivo en medio de chaperones al facilitar el plegado de los factores de transcripción, la regulación de la activación de quinasas [5], [6] y receptores de hormonas esteroides [7], ayudar en la formación de complejos de proteínas [8], [9], y jugando un papel en el recambio de proteínas y la trata. Para lograr todas estas funciones, asociadas con los compañeros de Hsp90 chaperones, sustratos, Hsp90 y sus socios que interactúan [2], [6], [10]. clientes Hsp90 se definen como proteínas que dependen de Hsp90. Las abundancias netas de muchos, pero no todos los clientes Hsp90, disminuyen la inhibición Hsp90, muy probablemente debido a la degradación proteasomal. Los clientes con una amplia variedad de funciones requieren Hsp90 para adquirir la conformación apropiada, para la activación, y /o para la estabilidad. La sobreexpresión de Hsp90 como un complejo multi-chaperona activado es frecuente en las células malignas [11], [12], y muchos clientes Hsp90 participan en las vías de señalización pertinente oncogénico [13], [14]. La inhibición de la Hsp90 puede bloquear las vías principales para el cáncer, por lo que la Hsp90 ha atraído un gran interés como diana para el desarrollo de fármacos contra el cáncer [12], [14], [15]. inhibidores de Hsp90, tales como geldanamicina (GA) son inhibidores competitivos de la unión a ATP. Estos inhiben la función de la chaperona, y, como consecuencia, pueden ejercer la actividad anti-tumor por la disminución de los niveles de clientes oncogénicos [12] - [14]. En la actualidad, hay cerca de 20 inhibidores en los ensayos clínicos [13], [15].
Los esfuerzos recientes se han dirigido a identificar y cuantificar la porción del proteoma que depende de la Hsp90, más comúnmente usando SILAC norma (isótopos estables de etiquetado de Aminoácidos en cultivo celular, stSILAC) basado en la proteómica cuantitativa [11], [16] - [19]. Los resultados de estos y los anteriores estudios que utilizan diferentes enfoques proteómicos han mejorado nuestra comprensión de la función de Hsp90 en el cáncer, así como una diana de fármacos anticancerígenos prometedores [20]. de perfiles de proteínas se utiliza junto con el cribado proteómico para identificar los componentes de los complejos Hsp90 inhibidor unido a [11]. Los análisis cuantitativos y quinasa específica de quimio-proteómicos [17], [19] del proteoma Hsp90 que dependen de relieve clientes Hsp90, que se ven afectados directamente por su inhibición, y proteínas que son influenciados indirectamente. Se encontró inhibición Hsp90 para afectar especialmente la abundancia en todo el proteoma (stSILAC) de las proteínas que participan en la maquinaria de plegamiento de proteínas, la respuesta al daño de ADN, así como la fosforilación de proteínas de señalización y por quinasas [18], [19]. Para expandir nuestro conocimiento del proteoma Hsp90-dependiente y el efecto de la inhibición de Hsp90 mediada por GA en las células T, se aplicó un novedoso enfoque sistemático integrado. En primer lugar, hemos analizado la dinámica (con el tiempo) los cambios en la abundancia de stSILAC durante corto (hasta 6h) ya largo plazo (hasta 20 h) GA-tratamiento, la detección de cambios en los grupos de proteínas con comportamientos distintos. Dado que se cree que la inhibición de Hsp90 para afectar a grandes porciones del proteoma (1-10%) a través de los cambios tanto en la descomposición y síntesis, se aplicó un SILAC novedosa estrategia de pulso-caza (pcSILAC) que proporciona una visión de cómo se generan los cambios en la abundancia de proteínas ( Fierro-Monti et al., artículo que acompaña). Diferenciales y dinámicos cambios en la
de novo síntesis y descomposición de las proteínas se identificaron en términos de constantes de velocidad de descomposición [k
d] y las tasas de síntesis [V
s]. Se detectó una mayor disminución global en la síntesis de proteínas que la estabilidad de la proteína, mientras que muchas familias de proteínas clave disminuyeron sus vidas medias debido a la inhibición de Hsp90. Modelización de nuestro conjunto de datos cuantitativos sobre una base de datos de interacción Hsp90 [21] ayudó a distinguir y evaluar los cambios dinámicos más específicas de validación potencialmente nuevos clientes dentro de la Hsp90 interactoma Hsp90. Como la abundancia de proteínas puede estar influenciada por cambios en el nivel de la transcripción, los niveles de ARNm se determinaron por lo tanto para una selección de proteínas con el aumento o disminución de la abundancia de stSILAC netas sobre GA-tratamiento. En total, nuestro análisis de la inhibición de Hsp90 permitió una evaluación integrada de la dinámica de la célula T proteoma Hsp90-dependiente, que da una mejor perspectiva sobre el mecanismo de acción de un inhibidor de la Hsp90.
Procedimientos Experimentales
Las células
Jurkat clon de linfocitos T J77.20 fuera una especie de regalo del Dr. Oreste Acuto, Universidad de Oxford y se han descrito anteriormente [22], [23]. Las células se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Cell Culture Technologies, Gravesano, Suiza) con 10% (v /v) se dializó suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen), mientras que la realización de stSILAC o pcSILAC experimentos.
stSILAC experimentos
aminoácidos marcados con isótopos (
13 C
6-L-lisina,
13 C
6
15 N
4-L- arginina, Cambridge Isótopo Laboratories (CIL), Andover, MA) se incluyeron en el "medio pesado-stSILAC 'a 100 mg /l, mientras que la prolina se suministró a 180 mg /l (un exceso de 9 veces más que su concentración estándar en RPMI medio) en todos los medios y stSILAC pcSILAC. etiquetado pesada o ligera-stSILAC (mismo medio que heavy-stSILAC, pero que contiene lisina y arginina estándar) se logró mediante el cultivo de las células durante 2 semanas para permitir que por lo menos 5 divisiones celulares. Antes de comienzo de los experimentos, las pruebas se llevaron a cabo para verificar que el etiquetado pesada era & gt; 98%, y a la conversión Arg Pro fue menor que 5%. células marcadas con stSILAC pesados fueron tratados con 1 mM Geldanamicina (GA) (Señalización Celular, Danvers, MA) en dimetilsulfóxido (DMSO) durante 6 o 20 h, y las células marcadas con luz stSILAC fueron tratados con el mismo volumen de DMSO y se utilizan como un control. Tres réplicas biológicas (independientes de la luz, de control), las células tratadas (-pesados marcado) o no tratados se llevaron a cabo en paralelo. Uno de los tres réplicas se invirtió utilizando luz-etiqueta para el tratado, y pesado-etiqueta para las células no tratadas.
Las células se lisaron en un 4% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 100 mM Tris /HCl pH 7,5, ditiotreitol 100 mM (DTT), seguido de calentamiento a 95 ° C. Después de las mediciones de centrifugación y la concentración de proteínas, se combinaron los extractos equimolares de las células de luz /pesada o pesados /marcado con medianas, alquilarse con yodoacetamida y se digirieron tal como se describe [24]. Las mezclas de péptidos obtenidos (200 g de material total) se desalaron en cartuchos SepPak C18 (Waters Corp., Milford, MA), se secó, se disolvió en urea 4 M con 0.1% anfolitos pH 3-10 (GE Healthcare) y se fraccionó por fuera de gel centrándose como se describe [25]. Las 24 fracciones obtenidas se desalaron en una placa de 96 pocillos microC18 (Waters Corp., Milford, MA), se secaron y se volvieron a suspender en ácido fórmico al 0,1%, 3% (v /v) de acetonitrilo para el análisis LC-MS. Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas híbrido trampa lineal LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher, Bremen, Alemania) interconectados a través de una fuente de nanopulverización a un sistema de nanoHPLC 3000 Dionex RSLC (Dionex, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Los péptidos se separaron en un nanocolumn Acclaim PepMap de fase inversa (75 micras ID × 15 cm, 2,0 m, 100 mu, Dionex) con un gradiente de 5-85% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1% (tiempo total: 120 min). Los exámenes completos de la encuesta MS se realizaron a 60'000 resolución. En la adquisición de datos dependiente controlada por Xcalibur 2.0.7 software (Thermo Fisher), se seleccionaron los veinte más intensos iones precursores se multiplican cargadas detectadas en el análisis completo encuesta MS para disociación inducida por colisión fragmentación (CID) en el colector LTQ lineal con una ventana de aislamiento de 3,0 m /z y luego excluido de forma dinámica a partir de una selección adicional durante 120 s. Los datos proteómicos de espectrometría de masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del diccionario socio PRIDE [26] con el identificador de conjunto de datos PXD000537
análisis de datos MS:. Identificación y cuantificación se analizaron los datos
MS y cuantificaron utilizando MaxQuant versión 1.0.13.13 [27], combinada con la mascota (Ciencia Matrix, Londres, Reino Unido) versión 2.3. Peaklists se generaron con MaxQuant con parámetros estándar. búsquedas de bases de datos se realizaron en la base de datos v3.68 humana IPI, se filtró para mantener sólo las entradas de asignación de un identificador UniProtKB /Swiss-Prot (34743 entradas realmente buscado) con el fin de maximizar la calidad de la secuencia y anotación en otros pasos de análisis. división especificidad fue tripsina (escisión después de K, R, ninguna escisión en KP, RP) con dos divisiones perdidas. tolerancias de masas fueron de 7 ppm para el precursor y 0,5 Da para CID espectros de masas en tándem. El derivado de yodoacetamida de la cisteína se especificó como una modificación fija, y la oxidación de la metionina y proteínas acetilación N-terminal se especificaron como modificaciones variables. la identificación de proteínas se filtraron a la tasa de falso descubrimiento 1% (FDR) establecido por MaxQuant contra una base de datos de secuencia inversa. Un mínimo de un péptido único fue necesario discriminar secuencias que comparten péptidos. Los conjuntos de secuencias de proteínas que no pudo ser discriminado basado en péptidos identificados se muestran juntos como grupos de proteínas y se presentan totalmente en las tablas. Los detalles de la cuantificación pico y la relación de proteína por cálculo MaxQuant se describen en otra parte [27]. Todas las proteínas con valores cuantificados (pruebas mínimas count = 1) se mantuvieron al principio, pero se filtró en los siguientes pasos (ver más abajo)
StSILAC análisis de datos:. Filtrado de la calidad del conjunto de datos
Todo el filtrado las etapas se llevaron a cabo con scripts de Perl medida (v5.10.1 Perl, scripts disponibles como datos complementarios). Tablas de grupos de proteínas de MaxQuant fueron procesados adicionalmente para eliminar contaminantes anotados en la base de datos y los partidos a las secuencias inversa. También se eliminaron otros 63 proteínas a partir de una lista interna de laboratorio de 65 contaminantes ambientales. Más adelante, las proporciones se eliminaron cuando se calcula sobre la base de evidencias individuales, así como, para cada punto de tiempo, las proteínas si se identificaron sólo en un replicado. grupos de proteínas de valores atípicos, que se definen como proteínas con una relación que difiere en más de un factor de 1,41 entre las dos repeticiones en cualquier punto de tiempo, se eliminaron las proteínas (28). definición de valores atípicos se llevó a cabo mediante el trazado de los datos y la selección de puntos con el software de Perseus. Esto resultó en el "conjunto de datos SILAC Calidad-filtrada" que contiene proteínas 4050 (Tabla S2), cada detectados y cuantificados en no menos de dos repeticiones, al menos en un punto del tiempo.
T-test y la agrupación
a partir de la "conjunto de datos SILAC Calidad-filtrada", se mantuvieron sólo los grupos de proteínas cuantificadas en las tres repeticiones (3333 proteínas) (Tabla S3). Para cada punto de tiempo, ingrese
2 de coeficientes cuantificados fueron sometidos a una prueba t de Welch de dos colas para una muestra (hipótesis nula H
0: μ = 0), seguido de la corrección de múltiples ensayos (Benjamini-Hochberg ). Todas las proteínas con P & lt; 0,05 (después de la corrección) se consideraron significativos. grupos de proteínas significativas al menos en un punto de tiempo se sometieron a modelo de clústeres de correlación para detectar patrones de comportamiento como una función del tiempo. T-pruebas y la agrupación se realizaron con la versión de software de R 2.12.1 (2010-12-16). Después de la adición de un punto de tiempo de referencia (0,0), los datos se ajustaron mediante el cálculo de coeficiente de correlación de Pearson para los modelos ad hoc definidos teniendo en cuenta en una forma cualitativa simplificada (0 = sin cambio, 1 = log
2 (H /L) & gt; 0, -1 = log
2 (H /L) & lt; 0) todos los posibles cambios en los dos puntos de tiempo. Para discriminar cambios como una función del tiempo cuatro más comportamientos fueron considerados cuando una proteína tenía dos valores con el mismo signo. Esto dio como resultado en los 13 patrones siguientes: [0,2,1] [0,1,2] [0,1,1] [0,1,0] [0,1, -1] [0,0,1 ] [0,0, -1] [0, -1,1] [0, -1,0] [0, -1, -1] [0, -1, -2] [0, -2, - 1] [0,0,0]. Se asignaron 0,05 en todos los puntos de tiempo a agruparse 13. proteínas detectadas solamente en un punto de tiempo fueron asignados al grupo 14.
Análisis de anotación; grupos de proteínas con t-test, p & gt: eliminación de subconjuntos y actualización de la proteína anotación
Para simplificar las comparaciones post-MaxQuant de conjuntos de datos, las proteínas de subconjuntos (identificados con un subconjunto de péptidos) se retiraron de los grupos de proteínas. Para asegurar que la UniProt, GO, KEGG y PFAM anotaciones eran completamente actualizada, un script en Perl RESTO automatizado (Representational State Transfer) solicita a la UniProt (http://www.uniprot.org/uniprot/) y EBI sitios web (http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GAnnotation) y simple Object Access Protocol (SOAP) solicita a la KEGG (Kyoto Enciclopedia de genes y genomas) sitio web (http://soap.genome.jp/KEGG.wsdl), así como re-importación de estos datos en la tabla de resultados sobre la base de los grupos de proteínas simplificados. La asignación de cada término anotación para cada identificador de un grupo de proteínas fue asignada, y se informa en la Tabla S4. Análisis término enriquecimiento de ontología de genes (GO) se llevó a cabo con la herramienta en línea del gorila (http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/) [28], utilizando los genes de las proteínas en cada grupo como la consulta, para ser se compara con el conjunto de las proteínas identificadas
organización de datos basada en la red y el descubrimiento
la integración de los datos experimentales de la interacción proteína-proteína (PPI) redes para construir mapas explorables utilizando Cytoscape (http.: //www.cytoscape.org) se ha descrito anteriormente [29], [30]. Asumimos que la significación estadística es menos importante en un análisis de la red, que privilegia las conexiones y los patrones y por lo tanto se utilizó un conjunto de datos con menos rigor filtrada como entrada. Usando la base de datos PPI centrado en el hombre [21], fue posible extraer una red con las 1263 proteínas que pasaron la prueba t (p & lt; 0,05) antes de múltiples pruebas de corrección al menos en uno de los dos puntos de tiempo (6h o 20 h). Un "nodo" en esta red corresponde a una proteína y la conexión entre ellos se denomina "borde" y se refiere a la PPI entre estos dos nodos. Las proporciones de H /L normalizados para los stSILAC 6h y 20h conjuntos de datos se cargan en esta red. Los nodos se colorean con un rojo a azul degradado (mapa de calor termograma) de acuerdo a su registro
2 ratios /cambio de tapa, de tal manera que los valores de color rojo y azul representan el enriquecimiento y agotamiento, respectivamente. Información para los diferentes miembros de la red también se carga desde diferentes bases de datos (UniProt, ontología de genes, MIM) para tenerlo disponible en el gráfico como metadatos. Sobre la base de la organización en red, integración de datos stSILAC e información acerca de la función de proteínas, la Cytoscape plugin de Mcode [31] permitió la detección de grupos altamente interconectadas de nodos (subgrafos) que pueden ser considerados como complejos de proteínas y módulos funcionales para diferentes procesos de interés. Una vez que se ha detectado un módulo funcional de interés (con funciones similares y comportamiento similar en los datos stSILAC), este sub-red se exploró más lejos para encontrar otros módulos conectados (presentes en la red principal) que participan en los procesos biológicos relacionados con la salud o la enfermedad. Estos esfuerzos se complementan con la literatura minera para mejorar nuestra comprensión de la importancia biológica de estos módulos conectados.
La alineación de los conjuntos de datos
grupos de proteínas en conjuntos de datos analizados desde pcSILAC y stSILAC fueron igualadas por los identificadores de IPI . Sólo cuando todos los identificadores de IPI en un grupo de proteínas eran idénticos en dos conjuntos de datos, los grupos de proteínas y valores cuantitativos fueron agrupados y alineados en una mesa conjunta.
Los anticuerpos
El antisuero policlonal anti-OGT se un regalo de Winship Herr, CIG, Universidad de Lausana. Policlonal anti-BRAT1, anti-ITK, anti-eIF2α y anti-fosfo-eIF2α antisueros se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE.UU.).
inmunoprecipitación
Las células se lisaron durante 15 min en hielo en tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl 0,2 mM
2, ditiotreitol 1 mM, 2% de Triton X-100). Los extractos se sometieron a ultrasonidos y borrar por centrifugación a 12'000 rpm durante 30 min a 4 ° C. 1 mg de proteínas del sobrenadante (en 1 ml) se incubó con cada anticuerpo durante la noche a 4 ° C. Después de lavar los inmunoprecipitados con solución salina tamponada con Tris, las proteínas se eluyeron en tampón de muestra de SDS-PAGE sin TDT hirviendo. DTT 50 mM se añadió a los sobrenadantes y las proteínas separadas por SDS-PAGE y procesados para inmunotransferencia. Para volver a sondear las manchas con un anticuerpo diferente, que fueron despojados durante 2 horas a 65 ° C con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,2% de Tween-20.
análisis del ciclo celular
Las células ( 2 × 10
6) se fijaron con paraformaldehído al 2% durante 10 min a RT, y se hicieron permeable después del tratamiento con salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,5% de saponina (Sigma), 2% de FCS, y 2 mM de EDTA, durante 5 min a RT. Después se incubaron con Hoechst 33342 (20 mg /ml; Invitrogen) durante 5 min a TA. Los datos fueron adquiridos en un LSR II (Becton Dickinson) y se analizaron con el software FlowJo (TreeStar)
ARN:. NanoString nCounter análisis cuantitativo
A partir de cada biológica replicar (3 para stSILAC y 2 para pcSILAC) y punto de tiempo, se tomaron dos muestras de células independientes y se procesan por separado. El ARN se purificó a partir de extractos celulares usando columnas de centrifugación mini (RNeasyPlus Mini Kit de Qiagen, Hilden, Alemania). 200 ng de ARN total se hibridación con sondas Nanostring multiplexados y se procesaron muestras de acuerdo con el procedimiento publicado [32]. Los códigos de barras se contaron para 1150 campos de visión por muestra. Corrección de fondo hecho por la sustracción de la media más dos desviaciones estándar de los controles negativos para cada muestra. Los valores & lt; 1 se fija a 1. Los controles positivos fueron utilizadas como evaluación de la calidad. Esto se hizo mediante la comprobación de que la relación entre la mayor y los controles positivos promedio más bajo entre las muestras estuvo por debajo de 3. A continuación, cuenta para los genes diana se normalizaron con la media geométrica de los genes de referencia 12 (lista de genes) seleccionados como el más estable usando el algoritmo geNorm [33]. Los factores de cambio se calculan como proporciones de la media geométrica de los recuentos en condiciones experimentales (GA) sobre el de condición de control (DMSO) y se expresaron como log valores
2.
Resultados
sistema Experimental
la línea celular Jurkat de linfocitos T previamente ha sido utilizado como un modelo para la definición de los mecanismos de susceptibilidad de cáncer de drogas [34] y para analizar el impacto de los inhibidores de Hsp90 en las proteínas individuales o funciones celulares [35] - [39]. miembros de la familia Hsp90 en células eucariotas están representados por Hsp90β citosólica (constitutiva, codificada por HSP90AB1) y Hsp90α (inducible, codificada por HSP90AA1), retículo endoplásmico (ER) Grp94 (endoplasmina) y la isoforma mitocondrial Trap1. El tratamiento de células con GA se ha demostrado que inhibe Hsp90β, Hsp90α, y Grp94, mientras Trap1 es posiblemente menos o no afectada por GA en células intactas [40].
En primer lugar, se realizó un SILAC estándar (stSILAC) análisis global de los efectos de la inhibición Hsp90 durante el curso del tratamiento, expresado como cambios en la abundancia relativa en GA-tratada frente a las células control de DMSO. Se utilizó una concentración subletal de drogas [1 M] en el medio (por debajo de la prevista concentración de proteína intracelular de la Hsp90). La concentración de GA utilizado fue encontrado para reducir el número de células en t = 20 h después del tratamiento. Esto ocurrió más probable mediante la inducción de una detención del ciclo celular, que fue detectado por un flujo de análisis de citometría de como un enriquecimiento de las células bloqueadas, ya sea en G1 o en fase G2 /M (Fig. S1A-B), y se acompaña de una disminución de células en la fase S. Se evaluó la inducción de apoptosis por inmunotransferencia, la detección de la escisión de la poli sustrato de caspasa (ADP-ribosa) polimerasa (PARP1), pero no observamos fuerte inducción de la apoptosis en las condiciones de ensayo (Fig. S1c). La dinámica de los efectos del inhibidor de Hsp90 en abundancias de proteínas se controló tomando muestras de alícuotas de las células y la extracción de proteínas en puntos de tiempo t = 6 h y t = 20 h después de la adición del fármaco. Las muestras también se recogieron a t = 5h y t = 19h para la purificación de ARNm total para determinar los niveles de transcripción (Figura 1A). Los datos de stSILAC se integraron con las interacciones proteína-proteína para construir una red y con las tasas de síntesis y descomposición de los datos pcSILAC y ARNm para un análisis de múltiples parámetros del sistema (Figura 1B).
A) El etiquetado y la muestra esquema de preparación. Geldanamicina o DMSO se añadieron a T = 0. Los extractos de proteínas totales fueron recogidos en t = 6h y 20h, mientras que el ARNm total se toma en t = 5h y t = 19h. B) Análisis de datos e interpretación de los datos combinados de los cambios de abundancia de proteínas (stSILAC) con interacciones proteína-proteína (PPI) se analizaron como una red, la síntesis y los valores de desintegración de las proteínas en las dos condiciones y los niveles de transcripción. El enriquecimiento de anotación términos de ontología de genes se utilizó para extraer información funcional sobre las categorías de proteínas con comportamientos comunes.
características globales de los conjuntos de datos stSILAC
El análisis de los datos de MS con MaxQuant con parámetros estándar 5707 grupos de proteínas identificadas (Tabla S1) antes de la filtración. Conjuntos de proteínas identificadas fueron muy similares entre los distintos recipientes, con un 73% de los grupos de proteínas totales identificados en las tres repeticiones en cada momento. correlación de relaciones /control tratados entre las réplicas en las 20h de Pearson fue mayor que 0,85 (fig. S2A-B), lo que indica una buena reproducibilidad. Las diferencias entre las células de Ga-tratado y de control aumentaron con el tiempo, como se muestra por el ensanchamiento de la distribución de las razones para pasar de 6h a 20h (Fig. 2A). La correlación entre las relaciones de la mediana en 6h y 20h fue sólo parcial (r = 0,59, Fig. S2C), lo que sugiere que, aunque en la mayoría de los casos los niveles de proteína cambió en la misma dirección, se pudieron observar patrones más complejos de los cambios en el tiempo.
A) Histogramas de los ratios /control tratados normalizados para la 6h stSILAC (amarillo) y 20h (verde) conjuntos de datos (4050 proteínas). B) Doce posibles patrones de cambio en el tratamiento GA se definieron (pequeñas parcelas) como modelos para la agrupación de correlación. Los clústeres adicionales (no mostrados) incluyen proteínas con cambios significativos en racimo (13) y proteínas con datos sólo en un punto de tiempo (grupo 14). El número de genes (que codifican proteínas) identificadas en cada grupo se indican en el cuadro.
Análisis de los datos y la agrupación stSILAC
Para el análisis de los datos proteoma enteros, el stSILAC conjunto de datos se filtró para retener sólo las proteínas detectadas en las tres repeticiones (Tabla S3) y después se sometió a una prueba t para identificar las proteínas que variaron de manera significativa entre el control y las muestras tratadas inhibidor. 565 proteínas (17%) pasaron la prueba t (p & lt; 0,05 con corrección de Benjamini-Hochberg) al menos en uno de los dos puntos de tiempo y de este modo mostraron cambios estadísticamente significativos en el tratamiento GA. Este conjunto de datos se ajustó a
ad hoc
patrones definidos que resulta en 12 grupos, cada uno representando cualitativamente distintos patrones de variación de las abundancias o los comportamientos a las 6 y 20 horas (Fig. 2B) (Fig. S3, el cuadro S3). Las proteínas no afectadas significativamente por GA fueron omitidos del análisis de conglomerados. La ventaja de este enfoque en comparación con métodos de agrupamiento no supervisado es que un comportamiento común de las proteínas en cada grupo podría ser fácilmente deducida. Curiosamente, los cuatro mayores grupos (clusters 2, 6, 7 y 11) contenían cada uno más de 80 proteínas y juntos representaron el 94,3% de todas las proteínas en clúster. Estos 4 grupos corresponden, respectivamente, a las proteínas aumentando o disminuyendo continuamente desde 6 a 20 horas (respectivamente, los grupos 2 [0: 1: 2] y 11 [0: -1: -2]), o a las proteínas que varían significativamente sólo a las 20h (cluster 6 [0: 0: 1] y 7 [0: 0: -1]) (Fig. 2B). Todos los demás grupos contenían números más pequeños de proteínas, con un máximo de 10 para el grupo 5.
Efectos de la inhibición de Hsp90 en base a los términos de GO enriquecido en los grupos y en experimentos adicionales
Para determinar si funcionalmente o proteínas relacionadas estructuralmente eran fluctuantes de la misma manera en el tratamiento de drogas, se realizó un análisis de la anotación de enriquecimiento en cada uno de los 12 grupos (Tabla S4, una selección de racimos y algunos de sus asociados GO términos se muestra en la Tabla 1). A nivel mundial leve (max. Aumento de 4 veces a max. 5 veces disminución) se detectaron efectos sobre las proteínas y complejos de proteínas que participan en una amplia variedad de procesos y vías de señalización.
Clusters con el aumento de los niveles en Hsp90 inhibición
en las primeras etapas de la inhibición de Hsp90 por GA (grupo 2), hemos identificado un aumento de las proteínas implicadas en la respuesta al estrés plegable en el citosol, sino también en la sala de emergencia, de acuerdo con los resultados anteriores en el mieloma células tratadas con inhibidores de Hsp90 [41], [42]. también se incrementaron Muchas proteínas localizadas en compartimentos vesiculares. El mismo o relacionados con los términos de GO también fueron enriquecidos en proteínas tarde vez mayor en el grupo 6, junto con los componentes del citoesqueleto, pequeñas GTPasas unidas a la membrana (proteínas Rab), proteínas de Golgi y el proteasoma. En general, una sobre regulación del aparato de plegado en el citosol y ER, junto con un estrés general y la respuesta pro-supervivencia emergen del conjunto de aumento de las proteínas. Teniendo en cuenta la respuesta de estrés ER observado, se evaluó la fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2α), ya sea por proteína quinasas que se localizan al citoplasma (PKR), o en la membrana ER (PERK), ya que tiene ha establecido como un mecanismo de respuesta al estrés para inhibir la síntesis de proteínas [43]. Se confirmó un leve aumento de la fosforilación de la eIF2α poco después de GA-tratamiento (Fig. S4), de acuerdo con estudios previos realizados en células HeLa [44].
Las agrupaciones con la disminución de los niveles de Hsp90 en la inhibición
Se ha observado una disminución aguda (hasta 6 horas) de las proteínas de unión a ATP y proteínas quinasas (grupo 11). Entre estas proteínas quinasas, notamos una disminución continua y progresiva de los miembros de la vía de señalización del receptor de células T. Se observó un número considerable de proteínas vinculadas al cinetocoro y las funciones de los cromosomas condensados. La mayoría de estas proteínas eran proteínas de poro nuclear implicados en el transporte núcleo-citoplasma. Los efectos tardíos (grupo 7) reflejan el enriquecimiento de varios GO términos vinculados a la biogénesis de ribosomas (rRNA procesamiento, nucleolar proteínas). Algunos de los factores esenciales para la replicación del ADN (etapa de elongación) fueron también disminuyeron en los últimos momentos. la biogénesis de ribosomas, uno de los procesos celulares más caros en términos de energía, se sabe que está correlacionado con la progresión del ciclo celular a través de la vía de MDM2-p53 [45]. En general, una regulación a la baja de la maquinaria de síntesis de proteínas, junto con los cambios relacionados con la detención del ciclo celular parecen surgir del conjunto de proteínas decrecientes.
El análisis de redes
El tratamiento con medicamentos condujo a una gran cantidad reducida de ambos conocidos y muchos potencialmente nuevos clientes Hsp90. Estamos motivado que el agotamiento no se puede tomar por sí mismo en el sentido de que una proteína es un cliente de Hsp90, y exploramos otras estrategias para diseccionar los acontecimientos. por tanto, modelamos los conjuntos de datos stSILAC cuantificados en la red previamente construido Hsp90 interacción proteína-proteína (PPI) Hsp90Int [21]. Varios subgraphs altamente interconectadas y módulos funcionales fueron extraídos de la base de datos Hsp90Int para mostrar los cambios dinámicos en base al conjunto de datos stSILAC.
Componentes de la Hsp90 chaperón molecular máquina
Se detectaron los chaperones moleculares Hsp70 y Hsp40 SEGUNDO).