Extracto
KRAS
estado mutacional se considera un marcador predictivo negativo de la respuesta a terapias anti-EGFR en cáncer colorrectal (CCR). Sin embargo, existen datos contradictorios con respecto a la variable de respuesta a la terapia EGFR. Los efectos de oncogénico
KRAS
en las dianas moleculares se estudiaron en líneas celulares con diferentes
KRAS
mutaciones. Células que albergan una sola
KRAS
G13D
alelo mostró el perfil más tumorigénico, con la activación constitutiva de la vía aguas abajo, haciéndolos insensibles a EGF. Por el contrario,
KRAS
células A146T
mostraron una respuesta completa a EGF en términos de vías de transducción de señales, la proliferación celular, la migración o la adhesión. Por otra parte, el acetylome mundial de células CRC también dependía de
KRAS
estado mutacional. Varios miembros de la familia hnRNP fueron identificados dentro de las 36 proteínas acetilados. estado de acetilación es conocido por estar implicado en la modulación de la EGF-respuesta. De acuerdo con los resultados presentados en este documento, se indujo hnRNPA1 y L acetilación en respuesta a EGF en las células
KRAS
A146T
, mientras que acetil-L hnRNPA1 y los niveles se mantuvieron sin cambios después del tratamiento del factor de crecimiento en
KRAS
G13D
células que no responden. Nuestros resultados mostraron que hnRNPs inducida por acetilación depende de estado mutacional de KRAS. Sin embargo hnRNPs acetilación también podría ser el punto en el que convergen diferentes vías oncogénicas
Visto:. Roda D, J Castillo, Telechea-Fernández M, Gil A, López-G Rodas, Franco L, et al. Inducida por EGF (2015) La acetilación del heterogéneos Ribonucleoproteínas nuclear depende de un
KRAS
mutacional estado en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (6): e0130543. doi: 10.1371 /journal.pone.0130543
Editor: Matias A. Ávila, Universidad de la Escuela de Medicina de Navarra y el Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA), ESPAÑA
Recibido: 1 de abril de 2015; Aceptado: 22 de mayo de 2015; Publicado: 25 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Roda y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del gobierno español, subvenciones FEDER (FIS PI09 /02480 Ministerio de Economía y Competitividad y y PI12 /02767 a la CA; FIS PI12 /02394 a ERGT y el FIS PI12 /02110 al GLR) y la Generalitat Valenciana (PROMETEO 2013 a 005 AC). DR llevó a cabo una beca de Innovación (Programa Hortega Río) Ministerio de Ciencia e y de la Sociedad Española Oncología Médica (SEOM); MTM es una beca predoctoral de la Generalitat Valenciana (Prometeo) y AG es un recipiente de beca postdoctoral de la Asociación Española Contra el Cáncer (AECC, Junta Provincial de Baleares)
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no hay existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores más frecuentes en todo el mundo [1] ya pesar de muchos avances en el tratamiento, la supervivencia a largo plazo para los pacientes con enfermedad metastásica es siendo pobres [2]. Los anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se han utilizado con éxito en pacientes de CRC con enfermedad avanzada. Sin embargo, menos de la mitad de ellos son sensibles a este tipo de tratamiento [3].
KRAS
o
ANR
mutaciones son los principales marcadores predictivos negativos para EGFR-respuesta [4]. Por lo tanto, el tratamiento con anticuerpos anti-EGFR es sólo para ser considerado en pacientes con un total de
RAS
fenotipo de tipo salvaje [5, 6]. proteínas RAS garantizar la transducción de señales entre los receptores de membrana, tales como EGFR, y intra-citoplásmicos de serina /treonina-quinasas; contribuyendo así a la regulación de una serie de funciones celulares esenciales. Mutado RAS hace que la proteína en una forma constitutivamente activa, que a su vez desregula vías de señalización corriente abajo [7]. Sin embargo, varios datos clínicos y experimentales indican que no todos los
RAS
mutaciones son iguales en sus propiedades biológicas y, por tanto, podrían conferir efectos variables [8, 9]. Las mutaciones del gen KRAS más frecuentes en pacientes con CRC están en el codón 12 y 13. Sin embargo, la activación de
KRAS
mutaciones en los codones 61 y 146 Recientemente se han asociado con la supervivencia libre de progresión más corto en comparación con el tipo salvaje
KRAS Hoteles en los pacientes tratados con CRC [10]. Además, las células tumorales bajo la presión de la inhibición de sus vías oncogénicas desarrollan mutaciones espontáneas. De hecho, los pacientes con CCR metastásico continua experiencia de tratamiento anti-tumoral
KRAS
cambios genotípicos [11]. También se observó este efecto en las células cultivadas; supresión de una mutado
KRAS
G13D
alelo en las células HCT116 (
KRAS
G13D /WT
) indujo una espontánea
KRAS
A146T
mutación en el alelo de tipo salvaje restante. Para descubrir los mecanismos moleculares de la respuesta diferencial observada en las células tumorales con diferentes mutaciones en
KRAS
parece un tema importante para el desarrollo de nuevas terapias anti-tumorales y la medicina personalizada.
Recientemente, una novela mecanismo de desacetilasa dependiente ha sido propuesto para explicar la resistencia a las terapias anti-EGFR en el mutante
KRAS
células de adenocarcinoma de pulmón [12]. La acetilación es una modificación reversible después de la traducción regulada por dos tipos de enzimas: desacetilasas lisina (KDACs) y acetyltransferases lisina (Kats). De hecho, los inhibidores de la deacetilasa han surgido como potenciales agentes anti-tumorales mediante el aumento de la hiperacetilación de ambos histonas y proteínas no histónicas [13]. Por otra parte, algunos informes describen la interacción entre los inhibidores de KDAC y la cascada de señalización en las líneas celulares que exhiben diferentes estatus mutacional en
KRAS
,
BRAF o PI3KCA
[14-17] RAS-ERK.
los efectos aguas abajo de la menos frecuente, pero no menos importante
KRAS
A146T
mutación es claro en la actualidad. En este artículo se evalúa el impacto de
KRAS
A146T
mutación
frente KRAS
G13D
sobre la proliferación celular, la adhesión y la migración de las líneas celulares de CRC HCT116 derivados. Teniendo en cuenta la interacción entre descrito recientemente acetilaciones y cascadas de señalización RAS-ERK, también estudiamos el efecto del estado mutacional del gen KRAS en el patrón de acetilación de proteínas con el fin de profundizar en los posibles mecanismos moleculares detrás del efecto diferencial de
KRAS mutaciones
.
material y Métodos
2.1. Materiales
Los anticuerpos para hnRNPA1 (ab5832, ab50492), hnRNPA3 (ab50949), hnRNPA
2 /B
1 (ab64800), hnRNPL (ab6106, ab65049) y GAPDH (ab8245) o β- actina (ab8227) como controles de carga, eran de Abcam. Los anticuerpos contra la acetil-Lys (9441), pAKT (40665) y AKT (9272) eran de Señalización Celular Tecnología. Otros anticuerpos utilizados fueron: ERK (sc-93) y pERK (sc-7383) de Santa Cruz Biotechnology; KRAS (05-516) de Millipore y Talin (T3287) de Sigma-Aldrich.
factor de crecimiento epidérmico (EGF 20 ng /ml), tricostatina (TSA, 0.5μM) y butirato de sodio fueron de Sigma-Aldrich, UO126 (10μM) de Promega, LY294002 (10μM) de Calbiochem y fibronectina de BD Biosciences.
2.2. Cell Cultura y
El cáncer de colon líneas celulares HCT116 y sus derivados HAE6 y HAF1 fueron adquiridas en el mercado en el Centro de células GRCF biorepositorio y, en la Universidad Johns Hopkins. Todas las líneas celulares se cultivaron en McCoy 5A Modificado Medio (Gibco) suplementado con 10% FBS, penicilina /estreptomicina y L-glutamina y se mantuvieron en condiciones estándar.
2,3. La extracción de proteínas y análisis por inmunotransferencia
Las proteínas totales se extrajeron en tampón RIPA suplementado con inhibidores y butirato de sodio. Igual cantidad de proteínas se sometieron a electroforesis en geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se inmunotransfirieron como se ha descrito en otra parte [18]. Las transferencias se desarrollaron por un aumento de quimioluminiscencia (kit de detección ECL, GE Healthcare). Los niveles de proteína se cuantificaron por densitometría y normalizado por la expresión de β-actina o GAPDH.
2,4. 2D-electroforesis y análisis acetylome
Los extractos de proteína (100μg) se separaron por electroforesis en dos dimensiones (2D), tal como se describe anteriormente [18]. proteómicos imágenes fueron adquiridas con un trío Typhoon Imager. En paralelo, 2D-geles se sometieron a electrotransferencia en membranas de nitrocelulosa y se analizaron por transferencia Western con anticuerpo anti-lisina acetilada. proteínas acetilados se solapan con los geles teñidos con Rubí SYPRO fueron extirpados para el análisis de MS. muestras de gel se procesaron con una estación MassPrep (Waters). NanoLC-ESI-MS /MS y análisis de los datos se realizaron como se describe [19] por la Unidad de Proteómica y Bioinformática, (CIMA-Universidad de Navarra, España).
2.5. La inmunoprecipitación
500μg de las proteínas se inmunoprecipitaron durante la noche con anticuerpos específicos o IgG sérica normal (Dako) a 4 ° C en un dispositivo giratorio. complejos de proteínas de anticuerpo se retiraron hacia abajo con Dynabeads (Invitrogen, Life Technologies) 50% (v /w). Después de varios lavados en PBS, los inmunocomplejos se recuperaron por ebullición en LB y después se analizaron por Western blot como se describe. 1% de extractos de proteínas utilizados para la inmunoprecipitación fue cargado como entrada.
2,6. el aislamiento de ARN y análisis de la expresión por qPCR
extracción de RNA, la síntesis de ADN complementario y QRT-PCR se llevaron a cabo como describen precioso. [18]. primer secuencias de
hnRNPA1
,
hnRNPA3
,
hnRNPA2 /B1
,
hnRNPL
y
¿Cuáles son GAPDH se muestra en los datos suplementarios. Pre-desarrollado cebadores Taqman para
KRAS
,
ADAM19
,
catepsina C
,
catepsina L
y
18S
eran de Applied Biosystems. la expresión génica relativa se expresa como 2
-Δ (Ct) Los datos se normalizaron por
18S
cuantificación en la misma reacción de la muestra. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
2,7. microarrays de expresión génica. La hibridación y el análisis de datos
El ARN total (5μg) se utilizó para obtener biotina cRNA de acuerdo con el protocolo del fabricante (Affymetrix). Calidad de la cRNA marcado se confirma por hibridación a un chip de prueba Affymetrix (Test3-chip). Etiquetado cRNA se hibridó a un Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0ST. Microarray datos fueron obtenidos por el software de Affymetrix AGCC. Los datos en bruto de tres repeticiones para cada línea celular se analizaron por R /Bioconductor utilizando el paquete Limma [20]. F-estadísticas, t-estadísticas y log probabilidades de expresión diferencial se calcularon mediante la moderación de Bayes empírica de los errores estándar hacia un valor común. Genes expresados diferencialmente se identificaron mediante la comparación por pares, (p-valor de corte = 0,05). Sólo los genes con un cambio veces por encima y por debajo de 1,5 -1, se considera expresados diferencialmente para profundizar el análisis y clasificadas de acuerdo a la categoría biológica proceso siguiendo los criterios de la Ontología de Genes Consorcio [21].
2.8. La proliferación celular ensayo
La proliferación celular BrdU fue examinado por un kit de ensayo de incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) (Calbiochem). Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 5x103 células /pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos. Después de inanición las 24h, las células fueron tratadas con EGF (20 ng /ml) en medio libre de suero. El reactivo se añadió BrdU a los pocillos durante 4 horas en presencia o ausencia de EGF. En los puntos de tiempo indicados, se fijaron las células durante 30 minutos en una solución de fijación /desnaturalización. Las células se incubaron con anticuerpo anti-BrdU (1: 100) durante 1 hora y después de varios lavados, se incubaron con conjugado con HRP IgG de 30 min. A continuación se añadió sustrato de bencidina Tetra-metilo para 15 min y la reacción se detuvo mediante la adición de 1,25 M de solución de parada de ácido sulfúrico. Se midió la absorbancia en cada pocillo a dos longitudes de onda 450-540nm.
2,9. Cicatrización de heridas ensayo
Las tres líneas celulares se cultivaron en condiciones estándar. Las monocapas confluentes estaban rayados con una punta de pipeta 10μl para inducir una herida. Los bordes heridos fueron imágenes utilizando un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti (aumento de 10x). Las imágenes se recogieron a los 0, 24 y 48 h después de cero.
2.10. El análisis estadístico
Los datos son la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. Las diferencias significativas se determinaron mediante la prueba t de una muestra de Student. Las diferencias se consideraron significativas a
p Hotel & lt; 0,05. Se muestran manchas representativas.
Resultados
3
.
1 |. Efecto diferencial de
KRAS
A146T
y KRAS
G13D en las células tratadas con EGF CRC
línea celular HCT116 CRC, la acogida una activación endógena de
KRAS
G13D /peso mutación, y dos HAF1 isogénica (
KRAS
p /-) y HAE6 (
KRAS
/G13D -) clones se utilizaron para este estudio. Todos esos genes recomendados para predecir un resultado clínico de la terapia del cáncer se secuenciaron en las tres líneas de células [22] (S1 tabla). Curiosamente, mientras que todas las mutaciones encontradas en HCT116 también se observaron en las células HAE6, se encontró que en las células HAF1 un
KRAS
A146T
mutación hotspot habían surgido espontáneamente en lo que hasta ahora estaba destinada ser un alelo de tipo salvaje. Dado este resultado, que caracteriza
KRAS
A146T
células y los comparó con HCT116 o líneas celulares HAE6 (S1 y Figura S1) del archivo. HAE6 células mostraron la más alta tasa de proliferación y los niveles más bajos de la adhesión celular. Una herida análisis de la migración celular de curación de manifiesto diferencias entre las tres líneas celulares (HCT116 que muestran, con una tasa más alta que HAF1 pero más baja que las células HAE6. En contraste con los resultados anteriores,
KRAS
estado mutacional no tuvo ningún efecto aparente sobre la fosforilación de ERK y AKT, en condiciones basales. Esto no es sorprendente, ya que las tres líneas celulares albergan una mutación PIK3CA activación.
KRAS
A146T
parecía siendo la mutación menos tumorigénicas. Sin embargo, el cultivo de células no sincronizadas en condiciones basales podría enmascarar el efecto de la mutación KRAS en respuesta a un estímulo específico. por lo tanto, para explorar aún más el efecto aguas abajo de
KRAS
A146T
frente al bien caracterizado
KRAS
G13D
mutación, las células HAF1 y HAE6 se cultivaron en el suero privados de los medios de comunicación y luego estimulados con EGF. Para descartar la posibilidad de que la mutación podría afectar
KRAS
expresión, qPCR se realizó y
KRAS
los niveles de ARNm que se encuentran en las dos líneas celulares fueron similares (datos no mostrados). Aunque EGF-tratamiento indujo la rápida fosforilación de ERK1 /2 y AKT en HAF1, esta respuesta era pobre en células HAE6 (Fig 1A). , los niveles de pERK notables ya eran altos en los controles no tratados HAE6. Además, como ya se ha descrito en otras líneas celulares con una vía ERK hyperactivated [23], disminución de los niveles de EGF pAKT en esta línea celular HAE6.
A. objetivos de abajo de la vía de señalización de KRAS se analizaron por Western blot para determinar pAKT y /2 niveles pErk1 después de EGF-tratamiento. B. La adhesión celular se determinó mediante análisis de transferencia Western de TALIN escisión en células HAF1 y HAE6. C. Migración relación se estudió después de tratamiento con EGF (20 ng ml /) mediante el ensayo de cicatrización de la herida. El gráfico muestra el porcentaje de células que migraron a la zona de la herida después de 24 horas. La proliferación celular D., medido por el ensayo de BrdU, para analizar la actividad proliferativa en las células tratadas con EGF (20 ng /ml). * P & lt; 0.05 tratados con EGF vs controles no tratados (n = 4)
experimentos de adhesión celular no se podrían realizar en medio libre de suero ya que las células HAF1 fueron sensibles a tripsinización después de la privación 24h-suero.. Un mayor talina de escisión se ha asociado con una menor adhesión de las células [24]. Por lo tanto, se analizaron escinde-Talin como un método indirecto para medir la adhesión celular. En las células no estimuladas, talina de escisión ya era mayor en HAE6 que en HAF1 células. Por otra parte, mientras que talina de escisión fue inducida en respuesta a EGF en las células HAF1, esta escisión proteolítica fue EGF-independiente en las células HAE6 (Fig 1B). A continuación analizaron la migración celular y encontramos que las células HAE6 también fueron insensibles a EGF, a diferencia de la migración celular inducida por EGF en la línea celular HAF1 (Fig 1C). Finalmente, la proliferación celular, aunque inducida por EGF en ambas líneas celulares, se incrementó en menor medida en HAE6 que en HAF1 células (Fig 1D). Pensamos que la hiperactivación de ERK1 /2 inducida por KRAS
G13D podría llegar a una meseta más allá del cual las células no pueden ser estimulados además por EGF.
3.2. los niveles de mRNA diferencial en KRAS
G13D vs KRAS
A146T líneas celulares de CRC
Se examinaron los posibles efectos de la transcripción del gen KRAS-dependiente en ambas líneas celulares utilizando Affymetrix microarrays de DNA (S2 y S3 Archivos). En virtud de la presencia de
KRAS
G13D
mutación, los genes expresados diferencialmente más fueron regulados hacia abajo (figura 2A y 2B; S2 figura) en comparación con
KRAS
A146T
mutación (HAF1). Sin embargo, la expresión de la mayoría de los genes no cambió sustancialmente, y sólo unos pocos de ellos fueron reguladas. Con el fin de validar estos datos, la expresión de una selección de genes regulados se analizó por qPCR. Se seleccionaron estos genes por su papel destacado en la metástasis tumoral, factor de crecimiento derramamiento o CRC resistencia a las drogas [25, 26]. La expresión de estos genes fue dramáticamente hasta reguladas en las células con una mutación
KRAS
G13D
alelo, lo que confirma los datos de microarrays (Figura 2C y S2 FIG). Entre los genes regulados en HAE6 vs células HAF1, la vía más representativa afectados era de señalización EGFR1; 43 genes se redujeron reguladas fuera de la 156 se describe para la vía canónica EGFR1. Sin embargo, otras vías activadas por citoquinas y factores de crecimiento, tales como VEGF, PDGF, el HGF, IGF1, TGF, TNF y varias interleuquinas, también fueron regulados hacia abajo. Esto no es sorprendente ya que la mayoría de ellos comparten varios pasos dentro de la vía de señalización RAS.
El ARN total a partir de células cultivadas de CRC en condiciones basales con 10% de SFB se analizó mediante microarrays. A.-Venn diagrama que muestra el porcentaje de genes arriba y hacia abajo regulados, que figura en la línea celular que alberga un
KRAS
G13D
mutación (HAE6), en comparación con los niveles de mRNA que se encuentra en las células HAF1 (
KRAS
A146T
)
. diagrama de barras que representa B. genes expresados diferencialmente (p-valor ≤ 0,001) entre las dos líneas celulares HAE6
frente
células HAF1, considerando solamente-log 2 veces el cambio & gt; 1,5 y & lt; -1.5. símbolo de genes para cada gen se indica a la izquierda. C. Tres genes,
catepsina L
,
catepsina C
y
ADAM19
elegidos en base a su potencial papel en la invasión celular y la migración, para la validación de microarrays mediante qPCR. * P & lt; 0,05 frente a células HAF1.
3.3. Efecto de mutaciones de KRAS en el acetylome global del CRC
Una de las vías posibles afectados por KRAS estado mutacional que pueden regular varios procesos biológicos es la acetilación de proteínas. Hemos tratado de estudiar si el perfil de la acetilación global en CRC se vio afectada diferencialmente por KRAS
G13D activada y KRAS
A146T. proteínas aisladas de ambas líneas celulares cultivadas en 10% de FBS, se inmunoprecipitaron y se analizaron por transferencia de Western con anticuerpos anti-acetil-Lys (Fig 3A). Un enfoque proteómico de transferencia Western 2D se utilizó para analizar profundamente proteínas acetilados de las dos líneas celulares. global de proteína Lys-acetilación se incrementó en comparación con HAE6 HAF1 células, de acuerdo con el aumento de número de manchas detectadas (Figura 3B).
A. homogeneizados celulares se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-acetil-lisina y los precipitados fueron entonces a inmunotransferencia contra residuos acetil-lisina, incluyendo una cantidad igual de homogeneizado de partida (llamado de entrada). IgG: Los homogeneizados inmunoprecipitaron con IgG de suero normal. marcadores de masa molecular (kDa) están a la izquierda del gel. B. perfiles de expresión de proteínas de las dos líneas celulares separadas por IEF PÁGINA dos dimensiones, teñidas con SYPRO Ruby (panel izquierdo) o inmunotransferencia contra el anticuerpo acetil-lisina para identificar proteínas acetilados (panel derecho). El pH aumenta de izquierda a derecha en la abscisa y la masa molecular disminuye de arriba hacia abajo en la ordenada. C. Distribución de las funciones biológicas GO asignados a las proteínas identificadas en el acetilados acetylome de células HAE6.
puntos positivos de la acetylome HAE6 se escindieron y se identificaron mediante espectrometría de masas. Se detectaron 67 puntos, pero sólo se seleccionaron aquellos con una puntuación de confianza de iones de la mascota y un juego de alta péptido (Tabla S2). El (GO) análisis de la función biológica de nuestros 36 proteínas acetilados revelado que las proteínas diana se enriquecen en cuatro categorías principales relacionados con el crecimiento celular, el metabolismo energético, el proceso metabólico de ARN y metabolismo de las proteínas (figura 3C). Muchas de estas proteínas ya se describieron siendo blanco de acetiltransferasas putativos o histonas y llegar a ser acetilado en diferentes condiciones experimentales (revisado en S2 Tabla). Nuestros resultados de microarrays confirmaron que las diferencias en el patrón de acetilación no se debieron a un aumento de la expresión de ARNm. De hecho, esos genes cuyos productos fueron identificados en nuestro análisis acetylome se mantuvo sin cambios en HAE6 en comparación con las células HAF1 (S2 y S3) Archivos.
3.4. La acetilación de miembros de la familia hnRNP
Entre los objetivos-acetilados hubo un interesante grupo de proteínas de unión a ARN, todos ellos miembros de la familia de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs), que participan en una variedad de funciones moleculares que van de el procesamiento del ARNm, el transporte, la estabilidad o incluso la traducción [27]. Se analizaron en las dos líneas celulares si la acetilación basal de hnRNPs dependía de
KRAS
estado mutacional. La acetilación se midió mediante experimentos de inmunoprecipitación con anticuerpos de acetilo (Lys), seguido de transferencia Western con anticuerpos que reconocen el miembro de hnRNP específico. Como se muestra en la figura 4A, hnRNPA1 y A2 /B1 se comprobó que estaban hyperacetylated en condiciones de crecimiento (10% de FBS) en HAE6 en comparación con HAF1; Sin embargo, este patrón no era tan claro en otros miembros de la familia probado como hnRNPA3 o L. El mRNA y los niveles de proteína de hnRNPs fueron analizados por qPCR y Western Blot, respectivamente (Figura 4B y 4C); la expresión de ninguna de las hnRNPs mostró un cambio significativo cuando se compara entre las diferentes líneas celulares. Por lo tanto, los diferentes niveles de acetilación observadas no son el resultado de una mayor tasa de expresión génica o la estabilización de proteínas.
A. Total de extractos de las dos líneas celulares de CRC en condiciones basales (10% de FBS) se aislaron y se inmunoprecipitaron con anticuerpos α-acetil-lisina. La muestra inmunoprecipitado se analizó por transferencia Western con anticuerpos que reconocen el miembro hnRNP específica (panel izquierdo). Las entradas de cada hnRNP específico en las diferentes líneas celulares se muestran (panel derecho). B. niveles de mRNA de hnRNPs fueron analizados por qPCR (n = 3). No se encontró significación estadística. C. El análisis de transferencia Western que muestra los niveles de proteína de las diferentes células en hnRNPs HAF1 y HAE6. ß-actina se utilizó como control de carga.
3.5. La acetilación de hnRNPA1 y L en respuesta a EGF
Aunque acetilación de hnRNPs ha sido ya descrito en otros sistemas celulares, en la actualidad no se sabe si este acetilación es parte de la respuesta de EGF en las células de CRC. Si fuera el caso, será importante establecer si los
KRAS
estado mutacional podría condicionar un diferencial inducida por la acetilación de hnRNPs a estímulos EGF. Ambas líneas celulares se cultivaron en medio libre de suero y después se estimularon con EGF por un corto (20 min.) Y un período largo (2h) de tiempo (Fig 5A). Las muestras de cada condición se inmunoprecipitaron con anticuerpos ya sea anti-hnRNPA1 o anti-hnRNPL. Se seleccionaron estas hnRNPs ya que representan esos isoforma que muestran la más alta y las diferencias de acetilación más bajas cuando se comparan las células HAF1 y HAE6. Para establecer la relación de acetilación (acetil-hnRNP /hnRNP total), las proteínas de pull-down se analizaron adicionalmente por Western blot con anticuerpos específicos frente a acetil-Lys o el hnRNP correspondiente.
Ambas líneas celulares de CRC se cultivaron en suero medio exento y luego estimuladas con EGF (20 ng /ml) durante 20 y 120 minutos. A. Los extractos de proteína a partir de células tratadas con EGF de control o se aislaron y se inmunoprecipitaron con α-hnRNPA1 (panel superior) o hnRNPL (panel inferior) anticuerpos. Las muestras inmunoprecipitadas se analizaron entonces mediante transferencia Western con anticuerpos que reconocen residuos de acetil-lisina y, ya sea hnRNPA1 o hnRNPL. Se muestran entradas de cada hnRNP específico en las diferentes líneas celulares. B. niveles de mRNA de hnRNPA1 y hnRNPL fueron analizados por qPCR en el control y 2h células tratadas con EGF. No se encontró significación estadística (n = 3). C. El análisis de transferencia Western que muestra los niveles de proteína de ambos hnRNPs en células HAF1 y HAE6 en condiciones de tratamiento de EGF de control y 2h. La intensidad de las bandas hnRNPs se midió y normalizó por β-actina; gráficos en el panel inferior muestran la cuantificación tanto para hnRNPL y A1 en HAF1 (barras blancas) y HAE6 (barras grises) líneas celulares.
En la privación de suero, los niveles de acetilación basales de ambos hnRNPs fueron mayores en HAE6 que en las células HAF1 (Fig 5A, carril 0). Sin embargo, la acetilación de ambos, hnRNPA1 y hnRNPL en el punto final de EGF-tratamiento fue la misma en las dos líneas celulares. Curiosamente, cuando la acetilación de las muestras tratadas con EGF se comparó con los controles no tratados, los niveles de hnRNP-acetilados no cambiaron significativamente a lo largo del curso del tiempo de EGF-tratamiento en las células HAE6 (Fig 5A). A la inversa, EGF indujo una acetilación dramático de ambos hnRNPs en HAF1 células. Curiosamente se observó la misma respuesta después del tratamiento EGF en HCT116 línea celular parental (figura S3). Por último, los niveles de ARNm y de proteínas de hnRNPA1 o-L no fueron inducidos en cualquier línea celular tratados con EGF en los puntos de tiempo ensayados (figura 5B y 5C; S3 Fig). Por consiguiente, la acetilación de EGF inducida observada en HAF1 no se puede atribuir a la modulación de la transcripción o de la traducción de hnRNPs.
3,6. Papel de
KRAS
mutación A146T en hnRNP acetilación
Para estudiar si
KRAS
A146T
mutación puede explicar inducida por EGF acetilación de hnRNPs, que inhibe específicamente la vía de señalización en la línea celular HAF1 KRAS. Independientemente de
KRAS
mutación A146T, células HAF1 también engloban un
PI3KCA
mutación. Por lo tanto analizamos la acetilación de hnRNPs inducidos por EGF en las células tratadas previamente con inhibidores de ambos, MEK1 /2 (U0126) y PI3K (LY294002). La inhibición de una sola vía, ya sea MEK1 /2 o PI3K, utilizando el inhibidor específico solo, no tuvo efecto sobre la acetilación de la proteína (Fig 6A). La capacidad de RAS para influir en la actividad de PI3K y viceversa ha sido bien documentado [28, 29]. De hecho, el bloqueo /2 la actividad de MEK1 se ha demostrado que induce la fosforilación de AKT en las líneas celulares de CRC [30]. Por otra parte, el bloqueo de la actividad de PI3K se ha demostrado que aumenta /2 niveles pERK1 en respuesta a una variedad de estímulos [28]. De acuerdo con esto, cuando se utilizaron ambos inhibidores simultáneamente, la inhibición de la señalización /PI3K vías RAS bloqueó completamente la acetilación inducida por EGF de ambos hnRNPA1 y hnRNPL (Fig 6B). Curiosamente, los niveles basales de hnRNPs acetilados en los controles de suero, no se vieron afectados por los inhibidores de quinasas.
A. células HAF1 se trataron con EGF en presencia o ausencia de inhibidores de MAPK (MEK, UO0126 o PI3KA, LY294002). extractos de proteínas de las células HAF1 se inmunoprecipitaron con α-hnRNPA1 o anticuerpos hnRNPL. Las muestras inmunoprecipitadas se analizaron entonces mediante transferencia Western con anticuerpos que reconocen residuos de acetil-lisina y, ya sea hnRNPA1 o hnRNPL (panel izquierdo). La fosforilación de ERK1 /2 y AKT en las células HAF1 también se evaluó para confirmar la eficacia de los inhibidores individuales a las dosis utilizadas (panel derecho). inhibidores de MAPK B. Ambos se utilizan simultáneamente para estudiar su efecto sobre la acetilación inducida por EGF de hnRNPs. C. Papel de las desacetilasas sobre los niveles de acetilación basales de hnRNPs se estudiaron adicionalmente en HAF1 células tratadas con tricostatina A. La inmunoprecipitación con anticuerpos hnRNPs y Western blot contra acetil-lisina, hnRNPA1 o L en las células tratadas con EGF HAF1, TSA o una combinación de ambos se muestran.
basal niveles de acetil-hnRNPs podrían depender de la vida media de acetilaciones. En realidad, la acetilación de proteínas no es sólo el resultado de la actividad acetiltransferasa inducida, pero también de desacetilasas. Para examinar el papel de las histonas en la acetilación basal, se investigó si el inhibidor de deacetilasa tricostatina A (TSA) podría imitar el efecto de EGF en células HAF1. De hecho, la TSA aumentó la acetilación de ambos hnRNPs a los mismos niveles que los alcanzados por el EGF-tratamiento, aunque no se observó efecto sinérgico (figura 6C).
Discusión
En esto nos permite descubrir varios aspectos de los eventos moleculares que subyacen a la carcinogénesis de colon que se tratará más adelante. Proporcionamos el primer informe que indica que la acetilación de 36 proteínas específicas depende de
KRAS
estado mutacional; entre ellos, varios miembros de la familia hnRNP. Además, nuestros datos indican que hnRNP acetilación es parte de la respuesta EGF-inducible. En segundo lugar, nos muestran las consecuencias moleculares de desequilibrio alelo por la supresión de cualquiera, una de tipo salvaje o un alelo mutante en
KRAS
G13D /WT células
CRC. La deleción del alelo de tipo salvaje (HAE6) lleva, no sólo para hnRNP acetilación, sino también para el perfil más tumorigénico y EGF-no responde de estas células. Por el contrario, la supresión del alelo mutante (HAF1) induce una espontánea
KRAS
A146T
mutación en el alelo de tipo salvaje.
En conjunto nuestras observaciones parecen paralelas los hallazgos clínicos que indican que la interrupción de la
KRAS
alelo de tipo salvaje es un factor pronóstico adverso para el CCR [31]. Sorprendentemente, en HAF1 células, una espontánea
KRAS
fue encontrado el punto A146T
mutación. De acuerdo con esto, los informes más recientes indican
KRAS
genotípica cambios dinámicos a lo largo de la progresión del CCR metastásico [11]. Esta mutación puntual también hace una activación constitutiva de KRAS [32], En un futuro próximo, sería importante analizar las posibles mutaciones espontáneas en cualquier otra línea celular CRC utilizados como modelo experimental para estudiar los mecanismos moleculares de la terapia de la resistencia o la nueva droga desarrollo.
pruebas de detección de mutaciones basadas en el punto de acceso
KRAS
los codones 12 y 13 han dado lugar a la clasificación errónea de hasta un tercio de los pacientes que fueron consideradas erróneamente como
KRAS
de tipo salvaje y eran resistentes a los tratamientos anti-EGFR [33, 34].
KRAS
mutaciones en los codones 61 y 146 están asociados significativamente con la supervivencia libre de progresión más corto en comparación con el tipo salvaje
KRAS Hoteles en pacientes con CCR tratados con una combinación de cetuximab y quimioterapia [10].