Extracto
La activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mutaciones son reconocidos biomarcadores para los pacientes con metástasis no cáncer de pulmón de células pequeñas (NSCLC) tratados con inhibidores de EGFR de tirosina quinasa (TKIs). ITC del EGFR también puede tener actividad contra el NSCLC y sin mutaciones de EGFR, lo que requiere la identificación de biomarcadores relevantes adicionales. Estudios anteriores sobre los niveles de proteína EGFR tumoral y el número de copias del gen EGFR revelaron resultados inconsistentes. El objetivo del estudio fue identificar nuevos biomarcadores de la respuesta a los ITC en NSCLC mediante la investigación de la expresión del genoma completo en el exón nivel. Utilizamos exón arrays y muestras clínicas de un ensayo anterior (SAKK19 /05) para investigar las variaciones de expresión en el exón nivel de 3 genes potencialmente jugar un papel clave en la modulación de la respuesta al tratamiento: EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rata viral homólogo de oncogén (KRAS) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFA). Se identificaron la expresión de EGFR exón 18 como un nuevo marcador predictivo para los pacientes con NSCLC metastásico no tratado tratado con bevacizumab y erlotinib en la primera configuración de la línea. La sobreexpresión de EGFR exón 18 en el tumor se asoció significativamente con la reducción del tumor, independientemente de la condición de mutación de EGFR. Una asociación significativa similar podría encontrarse en muestras de sangre. En conclusión, la expresión de EGFR exonic particularmente en el exón 18 se encontró que era un biomarcador predictivo relevante para la respuesta a bevacizumab y erlotinib. Sobre la base de estos resultados, proponemos un nuevo modelo de pruebas de EGFR en el tumor y la sangre
Visto:. Baty F, S Rothschild, Früh M, Betticher D, C Dröge, Cathomas R, et al. (2013) Exon-EGFR Nivel biomarcadores de la respuesta de bevacizumab /erlotinib en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (9): e72966. doi: 10.1371 /journal.pone.0072966
Editor: Giuseppe Viglietto, Universidad Magna Grecia, Italia |
Recibido: 6 Marzo, 2013; Aceptado: July 16, 2013; Publicado: 10 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Baty et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El exón el análisis conjunto fue financiado por el Grupo suizo para la Investigación clínica del cáncer (SAKK). Las actividades principales del ensayo fueron apoyadas por la Secretaría de Estado para la Educación y la Investigación (SER) y Roche Pharma (Schweiz) AG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. LB recibido honorarios de Roche y Astra Zeneca para conferencias y reuniones de la junta de la asistencia de asesoramiento. OG declara haber recibido honorarios por la junta asesora. Todos los demás autores declaran no tener ningún interés en competencia. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El pronóstico de los pacientes con estadio IV no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) continúa ser pobre. A pesar de la quimioterapia citotóxica estándar, casi el 50% no sobrevivirá más de 12-14 meses [1], [2]. En los últimos años, las mejoras en las tasas de supervivencia principalmente se han conseguido por el descubrimiento de marcadores moleculares de predicción que identifica subgrupos de pacientes que se derivan un beneficio sustancial de tratamiento específico. Varios ensayos aleatorizados en fase III han demostrado recientemente un beneficio significativo de los inhibidores de crecimiento epidérmico tirosina quinasa del receptor del factor (EGFR-TKI) en pacientes no tratados previamente quimioterapia que albergan una mutación de EGFR activación [3] - [6]. mutaciones de EGFR se encuentran en aproximadamente el 10-15% de los pacientes caucásicos [7]. En los pacientes de tipo salvaje EGFR como tratamiento de primera línea con EGFR-TKI incluso podría perjudicar a comparación con la quimioterapia convencional [8]. Sin embargo, en pacientes sin quimioterapia previa no seleccionados el papel de EGFR-TKI es menos claro y los estudios anteriores han demostrado resultados inferiores a los ITC con o sin bevacizumab en comparación con la quimioterapia [9] - [11]. Estos resultados indican, que hay un subgrupo de pacientes de tipo salvaje de EGFR que podrían beneficiarse de un tratamiento con un TKI o un TKI más un agente anti-angiogénico. Lo mismo es cierto para los pacientes no seleccionados y tratados previamente donde el papel del ITC se ha abordado en numerosos ensayos y las tasas de eficacia y supervivencia han demostrado ser comparable a la quimioterapia convencional [12] - [14]. Por otra parte, los recientes análisis de biomarcadores de tres grandes ensayos tratamiento de mantenimiento con erlotinib prueba claramente demostrado, que un subconjunto de pacientes de tipo salvaje EGFR también obtiene un beneficio significativo del tratamiento con EGFR-TKI [15] - [17].
Además de EGFR se han descrito otras mutaciones oncogénicas druggable en NSCLC avanzado [18], [19]. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes con NSCLC no albergan una diana molecular que corresponde por lo tanto, la quimioterapia continúa siendo su primer tratamiento de elección. Por lo tanto, la identificación de otros subgrupos de pacientes que podrían beneficiarse de la terapia dirigida mediante la exploración de marcadores moleculares adicionales es crucial.
El tratamiento con bevacizumab y erlotinib (BE) tiene potenciales ventajas sobre la quimioterapia, sobre todo en lo que se refiere a su mayor perfil de toxicidad favorable. Hay evidencia, que la adición del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de orientación bevacizumab anticuerpo monoclonal a las exposiciones de erlotinib EGFR-TKI aumento de la eficacia en comparación con erlotinib solo en pacientes no seleccionados que fueron tratados previamente con quimioterapia [20]. Esta observación probablemente el resultado de la actividad mejorada erlotinib, dada la falta de eficacia de la monoterapia con bevacizumab en cáncer de pulmón.
El Grupo Suizo para la Investigación Clínica del Cáncer (SAKK) informó recientemente de una mediana de tiempo hasta la progresión (TTP) de 4,1 meses en pacientes no tratados con CPNM no escamoso avanzado tratados con BE [21]. Este resultado parece ser inferior a lo que cabría esperar con combinaciones de quimioterapia modernas en poblaciones de pacientes similares [2], [22]. En el subestudio de corriente, que tuvo como objetivo identificar a un subgrupo potencial de los pacientes participantes en el ensayo SAKK 19/05, particularmente dentro del grupo de tipo salvaje EGFR, que pueden beneficiarse del tratamiento con EB. El objetivo principal de este estudio fue evaluar la correlación del nivel exón variaciones de expresión de los 3 genes específicos [EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rata homólogo de oncogén viral (KRAS) y factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA)] y el respuesta a la terapia de primera línea BE en pacientes que participaron en el ensayo SAKK 19/05.
resultados
características de los pacientes y los resultados clínicos
el ensayo incluyó 103 SAKK 19/05 pacientes, 101 fueron evaluables para el análisis estadístico primario. En general, mediana de edad fue de 65 (intervalo, 32-80) años. Todos los pacientes estaban en un buen estado funcional (OMS 0-1), 48 eran varones (48%), 53 eran mujeres (52%). La mayoría (86%) tenían enfermedad en estadio IV. mutaciones de EGFR se identificaron en 15 pacientes (15%). Un paciente tenía una mutación T790M resistencia primaria en el exón 20. mutación KRAS fueron identificadas en 13 pacientes (13%). Se observaron respuestas objetivas del tumor a las 12 semanas (PR o CR) en 15 pacientes (15%). Estos pacientes tenían la siguiente EGFR estado mutacional: del19 EGFR (n = 5), L858R (n = 2), el estado mutacional desconocido (n = 1), y EGFR de tipo salvaje (n = 8). Uno de los pacientes con EGFR de tipo salvaje y la respuesta a la terapia SER tenía una mutación G12D KRAS.
A partir de estos pacientes, el tejido tumoral para el análisis exón matriz se obtuvo de 42 pacientes y muestras de sangre de 75 pacientes (Tabla S1 en el Información de soporte). Una descripción detallada de las características del paciente se proporciona en la Tabla 1 (muestras de tejido tumoral) y en la Tabla 2 (muestras de sangre). Las muestras de tejido se correspondían con nuestra base de datos principal que se utiliza para la identificación de biomarcadores. Las muestras de sangre fueron utilizadas para fines de confirmación (conjunto de validación).
Meta análisis de la expresión génica en el exón nivel
factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR).
expresión del gen EGFR se midió a 451 loci, de los cuales 51 estaban situadas dentro de los exones, y 400 estaban situadas fuera de los exones,
es decir
intrónica, intergénica o no eran fiables (Figura 1, panel superior). De este modo, se midieron un total de 51 exones probesets expresión intensidades dentro del gen EGFR. Una medida de resumen de todos estos probesets nivel exón fue proporcionado por la PCA (puntuaciones en el primer eje PC). Se evaluó la asociación entre esta partitura y TS12 y TTP bajo BE, AT, y TTP en virtud de la quimioterapia.
Las garrapatas rojas muestran la probesets exonic, las garrapatas grises muestran los probesets no exonic (intrónicas, intergénicas y poco fiables ). En EGFR, KRAS y VEGFA, un total de 51 de 451, 13 y 25 de 262 de 26 probesets exonic se midieron respectivamente. Todas las demás probesets estaban situadas fuera de los exones,
es decir
intrónica, intergénica o no eran fiables.
Se encontró una correlación significativa entre las puntuaciones de EGFR PCA y TS12 después BE tratamiento (Spearman,) (Figura 2A, panel izquierdo). Un análisis detallado probeset-por-probeset reveló que el 86% de los probesets exonic mostró una correlación significativa con la reducción del tumor sin corrección de múltiples ensayos () (Figura 2B, panel izquierdo). Dos probesets mostró una particularmente fuerte correlación con TS12 (probesets exón ID 3002770 y 3002769), que siguió siendo significativa después de la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas. Estos 2 probesets están situados en el exón 18 (cromosoma 7, posiciones 55'238'440 y 55'238'092, respectivamente). No se encontraron otras asociaciones significativas. Seis pacientes tuvieron TTP de 15 meses o más. Tres de ellos tenían del19 EGFR, y 3 eran EGFR y KRAS de tipo salvaje.
Una fila representa la asociación entre la reducción del tumor en la semana 12 y la puntuación compuesta exón nivel (PCA eje 1) para EGFR, KRAS y VEGFA (izquierda, centro y derecha, respectivamente). Los puntajes de PCA se definen como las coordenadas de los pacientes en un nuevo espacio definido por la combinación lineal de los valores originales de intensidad probeset utilizando análisis de componentes principales. Los pacientes con mutaciones de EGFR están marcados en rojo, los que tienen el estado mutacional no disponibles se muestran como círculos vacíos. La fila B muestra la importancia de la correlación (-log (valor P)) entre cada probeset exón y la reducción del tumor en la semana 12. La posición de los exones se muestra en azul.
Figura 3 representa la asociación significativa de la intensidad de la expresión del exón 18-EGFR y TS12. El panel izquierdo muestra una fuerte asociación entre la intensidad de la expresión del exón 18-EGFR (probeset 3.002.770) y TS12 (Spearman,).
El panel de la izquierda representa la correlación entre la intensidad de la expresión del exón 18-EGFR ( probeset 3002770) y la reducción del tumor en la semana 12. la línea vertical muestra la intensidad mediana de expresión de EGFR probeSet 3002770. los pacientes con mutaciones de EGFR se muestran como puntos de fricción rojos y etiquetados accrodingly. Los pacientes con estado mutacional no disponibles se muestran como círculos vacíos. El panel central representa la curva de eficacia diagnóstica (ROC) que muestra la sensibilidad /especificidad de una prueba basada en el nivel de expresión del EGFR probeset 3.002.770 para clasificar respondedores (reducción del tumor en la semana 120/20/30%) en comparación con los no respondedores ( la reducción del tumor en la semana 120/20 /30%). Los puntos de fricción representan las verdaderas tasas positivas positivos y falsos obtenidos mediante la fijación del valor de corte para el nivel medio de expresión de EGFR 3002770. El diagrama de cascada (panel derecho) muestra el cambio en el tamaño del tumor en la semana 12 ordenados de izquierda a derecha. Los colores son definidos por la intensidad de la expresión de EGFR 3002770 dicotomizadas por la mediana de la expresión evel (azul: bajas intensidades de expresión; rojo: altas intensidades de expresión).
La fuerte correlación entre la expresión de EGFR exón 18 TS12 y permaneció altamente significativa (Spearman,) después de restringir el análisis a los pacientes EGFR de tipo salvaje (véase la figura S1 en la información de apoyo). Este sub-análisis indica que la asociación entre el exón 18 de EGFR expresión y TS12 era independiente del estado de mutación del EGFR.
El análisis ROC (panel central) muestra la relación entre la sensibilidad y la especificidad en función de diferentes niveles de corte del exón 18-EGFR (probeset 3.002.770) la expresión de clasificar a los pacientes en "respondedores" frente a "no respondedores". A los efectos de este análisis ROC, la categorización "respondedores" frente a "no respondedores" derivan de TS12. Hemos propuesto 3 definiciones alternativas a los "respondedores" estableciendo el TS12 de corte como mayor o igual a 0, 20, o 30%, dependiendo de si es o no uno incluyó la totalidad o una fracción de los pacientes con enfermedad estable en los "respondedores" categoría . Uso de la mediana de expresión de EGFR probeset 3002770 como prueba de umbral proporciona una precisión de la clasificación de 75% (sensibilidad = 100%, especificidad = 67%). Como se muestra en la curva ROC, una mayor precisión de la clasificación se puede esperar de un ajuste más preciso de este umbral (área bajo la curva [AUC] = 0,93).
Los exón 2 probesets 18-EGFR que muestran la correlación más fuerte con TS12 también mostraron una asociación significativa para el mismo punto final cuando se mide utilizando la sangre ().
la estabilidad de nuestro hallazgo se evaluó mediante bootstrapping, y las estrategias de validación cruzada. El procedimiento confirmó la fuerte precisión de la clasificación del exón 18 de EGFR con una mediana ROC-AUC de 0,94 (IC del 95%: 0,70 a 1,00) y la asociación específica entre la región del exón 18 y la reducción del tumor en la semana 12 (véase la Figura S2 y S1 texto para el procedimiento detallado).
Kirsten sarcoma de rata homólogo de oncogén viral (KRAS) y de crecimiento endotelial vascular factor alfa (VEGFA).
En total, 13 y 25 del exón probesets expresión intensidades se midieron dentro KRAS y VEGFA respectivamente (Figura 1, central y paneles de la derecha). Las puntuaciones obtenidas PCA para ambos conjuntos de probeset (KRAS y VEGFA) no mostraron asociación significativa con ninguno de los criterios de valoración clínicos. Un análisis detallado probeset probeset-por-no reveló ninguna asociación significativa con cualquiera TS12 (Figura 2 A, B, paneles centrales y derecho) o los otros criterios de valoración investigados.
Discusión
Para nuestro conocimiento , este es el primer estudio explorar la correlación entre la expresión génica evaluado en un nivel exonic subgenic utilizando Affymetrix Human exón 1.0 arrays y la respuesta al tratamiento con un EGFR-TKI en combinación con un agente anti-angiogénico ST. Se investigaron las variaciones de intensidad exón dentro de los 3 genes clave (EGFR, KRAS y VEGFa) potencialmente asociados con la respuesta al tratamiento con EB. Hemos sido capaces de demostrar una fuerte asociación entre la mayoría, pero no todos, de los probesets exón 51 de EGFR y TS12 de primera línea ser una terapia en pacientes no tratados con NSCLC avanzado no escamoso. Exón niveles de 18-EGFR mostraron la mejor asociación con la respuesta a la SER. En base a los experimentos anteriores se supone que la señal se midió en EGFR exón 18 no dependía del contenido de las células tumorales [23]. Además, no había una relación cuantitativa - mayor nivel de ARNm de EGFR se correlaciona con la reducción del tumor más pronunciada, independientemente del estado mutacional EGFR. Análisis de la expresión de EGFR-exón nivel podría llegar a ser un biomarcador útil para la práctica clínica diaria, ya que ofrece varias ventajas en comparación con el análisis mutacional convencional mediante la secuenciación de genes. Típicamente, la expresión del gen EGFR se mide utilizando RT-PCR cuantitativa con cebadores que se unen a una sola región del gen a menudo cerca del extremo 3 'del gen. Sin embargo, como se muestra en nuestro estudio, la expresión de genes varió significativamente durante el transcurso del gen EGFR. Las razones de estas variaciones de expresión incluyen splicing alternativo. La variante de EGFR de tipo III (EGFRvIII) tiene una deleción en marco de los exones 2-7 que se ha encontrado para ser generada por reordenamiento del gen o ARNm aberrante de empalme [24], [25]. Esta forma alternativa de empalme se ha encontrado en NSCLC [26], [27]. En experimentos preclínicos, las células que expresan EGFRvIII fueron resistentes contra reversible de EGFR-TKI, pero seguían siendo sensibles a los inhibidores irreversibles de EGFR [28]. Encontramos la mejor correlación con TS12 y el exón 18. En los extremos del gen EGFR varios probesets exonic no mostraron una asociación significativa con el resultado. Dziadziuszko y sus colegas informaron de que la expresión del ARNm del EGFR alta analizada por RT-PCR cuantitativa se asoció con un aumento de la respuesta y la SSP prolonga en pacientes tratados con gefitinib [29]. En un estudio chino de 79 pacientes seleccionados tratados con erlotinib no se encontró correlación significativa entre la expresión de EGFR mRNA, las mutaciones de EGFR, mutaciones de KRAS y criterios de valoración clínicos [30].
Varios ensayos demostraron que el beneficio clínico con EGFR-TKI era no se limita a los pacientes con mutaciones activadoras de EGFR [13], [16], [31]. Por otro lado, el juicio IPASS demostrado que los pacientes con EGFR de tipo salvaje tratados con gefitinib presentaron una SSA significativamente más cortos en comparación con los pacientes en el brazo de quimioterapia (razón de riesgo (HR): 2,85; IC del 95%: 2,05 a 3,98;) [ ,,,0],8]. En el presente estudio, hemos sido capaces de identificar los 3 pacientes con EGFR de tipo salvaje y alta exón 18 de EGFR niveles de expresión (2 medidos en las biopsias y la sangre, y la sangre se mide en 1 solamente) que tenía TS12 significativa después del tratamiento con EB. Creemos que estos resultados son de interés, debido a que la incidencia de mutaciones activadoras del EGFR en pacientes de raza blanca es de 10-15% y nuestra prueba puede identificar a los pacientes adicionales que podrían ir mejor con la primera línea de EGFR-TKI en comparación con la quimioterapia. Esta hipótesis necesita una validación prospectiva
.
Curiosamente, los pacientes con raras mutaciones de EGFR (
por ejemplo, sobre Del L747-S751 y S752 del r748-) para el cual la respuesta a EGFR-TKI aún no se ha explorado también se encontró que tenían más altos a nivel exón niveles de expresión del EGFR, que se correlacionó con TS12. Dos probesets situados en el exón 18 mostró la asociación más fuerte con la reducción del tumor. En un estudio de una sola institución italiana, no se encontraron mutaciones raras EGFR (exones 18 y 20 y mutaciones poco comunes en los exones 19 y 21 y /o mutaciones complejas) en el 2,6% de los pacientes. Se informó de PR a erlotinib en un paciente con un E709A + G719C doble mutación y una respuesta a erlotinib en un paciente con una mutación G719S [32]. Otros grupos informaron de sensibilidad a EGFR-TKI para el E709A + G719C doble mutación y para la mutación G719S en el exón 18 [33] - [35]
Curiosamente, se observó una reducción del tumor en un paciente con una mutación KRAS. . Este paciente tenía una expresión de alto exón EGFR. Los pacientes con mutaciones de KRAS representan aproximadamente el 25% de los pacientes con CPNM y se han descrito como altamente resistentes al tratamiento con EGFR-TKI con RR cercano al 0% y peor resultado para los pacientes mutados tratados con EGFR-TKI en algunos ensayos [36], [37] . El análisis de biomarcadores del ensayo SATURN no mostró ningún efecto perjudicial sobre la SSP con erlotinib en pacientes con KRAS tumores mutantes [17]. Por lo tanto, alta exón niveles de expresión de EGFR pueden ser capaces de identificar a los pacientes con mutaciones de KRAS que obtienen beneficios de primera línea SER.
Otros marcadores moleculares potenciales más allá de EGFR mutaciones han sido investigados por su papel predictivo para el tratamiento con inhibidores de TK o ITC en combinación con inhibidores de VEGFR. expresión de la proteína EGFR detectado por inmunohistoquímica (IHC) está presente en el 60-90% de los pacientes con CPNM [13], [38] y por lo tanto poco probable que sea de utilidad para la selección clínica para la terapia de TKI. Aunque los análisis de subgrupos de los controlados con placebo, los estudios de fase III en pacientes previamente tratados con mostraba algún valor predictivo de la expresión de la proteína EGFR [13], [39], estos resultados no fueron confirmados ya sea en la primera línea o punto de estabilidad [17], [40] . Del mismo modo, de alta EGFR número de copias, que se produce en el 30-50% de los pacientes con NSCLC, y la amplificación de genes, que se produce en aproximadamente el 10% [41], se han demostrado recientemente en € revocada € Al mutaciones de EGFR con respecto a su predictivo valor para la respuesta a EGFR-TKI [40]. Determinación de la expresión de EGFR mRNA por PCR cuantitativa fue correlacionada con EGFR FISH y IHC y ha demostrado ser un biomarcador predictivo de gefitinib [29]. Ni la expresión de proteína EGFR ni pruebas de FISH EGFR se utilizan actualmente en la práctica clínica y, por lo tanto mejor se necesitan con urgencia marcadores moleculares.
El gen EGFR da lugar a múltiples transcriptos de ARN a través de corte y empalme alternativo y el uso de señales de poliadenilación alternativos [42 ]. El gen EGFR se extiende por cerca de 200 kb y el de larga duración de 170 kDa EGFR está codificada por 28 exones. Varias variantes de splicing alternativo se han descrito [43]. El método más comúnmente utilizado para detectar mutaciones de EGFR-es la secuenciación directa de las secuencias de exón amplificadas por PCR. El número de copias del alelo mutante, la amplificación PCR desequilibrada y la cantidad relativa de contaminación de alelo de tipo salvaje de células no tumorales pueden influir en la sensibilidad de la detección mutante por secuenciación directa [44]. Debido a la preocupación con respecto a la sensibilidad del método de secuenciación directa, una variedad de otros métodos han sido investigados para aumentar la sensibilidad del ensayo de mutación. Aquí se investigó por primera vez el análisis de expresión exón. La matriz utilizada permite el análisis de expresión de genes, así como la detección de diferentes isoformas de un gen. En este estudio se identificaron retrospectivamente una correlación entre los niveles de intensidad exón dentro de EGFR y la evolución del paciente. El mecanismo a través del cual el exón 18 de EGFR expresión determina un aumento de la sensibilidad a erlotinib bevacizumab es desconocida, aunque se pueden proponer diferentes hipótesis. exón matriz es todavía muy reciente con alta tecnología potencial. la frena con la idea común de que la expresión del gen es estable en el lapso de un gen entero. Por lo tanto, no es sorprendente que se obtuvo una expresión de EGFR correlación estadística más fuerte cerca de la región que codifica la parte de transmembrana funcional de EGFR. Si el valor predictivo de este ensayo se pudo confirmar en un ensayo prospectivo, la expresión génica a nivel de exón podría identificar a los pacientes que se derivan beneficios de EGFR y terapias más allá de los pacientes seleccionados mediante secuenciación del gen convencional VEGFR-dirigida.
Hay ciertas limitaciones en el estudio actual. Es un único diseño del brazo y tiene un número relativamente bajo de pacientes de los que se dispone para el análisis de biopsias de tumores. En la primera mitad del juicio 19/05 SAKK no se requiere una biopsia sin tratamiento previo para la inclusión en el estudio. En este período, prácticamente no se recogieron biopsias. Después de una enmienda (octubre de 2006) la biopsia se hizo obligatorio para inclusión en el estudio como una biopsia sin tratamiento previo se puede tomar en casi todos los pacientes incluidos pacientes con CPNM en etapa avanzada [23]. análisis exón serie se realizaron con biopsias de tumores de células mixtas sin ninguna técnica de enriquecimiento de células tumorales como el láser de microdisección de captura. Esto es probable que conduzca a una cierta dilución de la verdadera señal del tumor. técnicas de enriquecimiento de células tumorales pueden optimizar aún más la eficacia de los biomarcadores derivados de los análisis exón matriz. La validez del análisis de la expresión de EGFR exón como un biomarcador de respuesta a BE tendrán que ser confirmadas a la vez utilizando el análisis de RT-PCR dirigidos a EGFR exón 18. La plena realización de la validación del nuevo marcador biológico con el tiempo requiere una mayor investigación usando un ensayo aleatorizado prospectivo independiente .
en conclusión, con la ayuda de un nuevo gen de la tecnología de matriz de expresión con la cobertura exonic, hemos sido capaces de identificar la expresión del exón 18-EGFR como un biomarcador predictivo potencial de erlotinib y bevacizumab en pacientes con NSCLC avanzado, sin tratar .
Materiales y Métodos
SAKK 19/05
El juicio SAKK 19/05 (ClinicalTrials.gov: NCT00354549) incluyeron 103 pacientes con NSCLC avanzado no escamoso, 101 pacientes fueron evaluables para el análisis adicional [21]. Los criterios de elegibilidad incluyeron años de edad, la función de la médula ósea adecuada, la función renal y hepática normal y la enfermedad medible. Se excluyeron los pacientes con necesidad inmediata de quimioterapia, con grandes tumores de localización central, cavitaciones de tumores preexistentes y las metástasis cerebrales. broncoscopia biopsias previas al tratamiento adicionales para estudios de traducción se tomaron en 49 pacientes, de los cuales 42 fueron de calidad suficiente para su posterior análisis exón matriz. Para el presente subestudio, muestras de sangre antes del tratamiento estaban disponibles en 95 pacientes, y las muestras procedentes de 75 pacientes tenían una calidad suficiente para arrays de exones. En general, 76 pacientes con tumor, ya sea o muestras de sangre o de ambos, se incluyeron en el subestudio actual. consentimiento informado por escrito para la investigación traslacional se obtuvo de todos los pacientes. El ensayo clínico, así como el subestudio actual fueron aprobados por el IRB de St. Gallen (EKSG 06/012).
diseño de prueba gratis
SAKK 19/05 fue un estudio multicéntrico, prospectivo, abierto -label, de un solo brazo, II de ensayos en pacientes no tratados previamente fase. Entre enero de 2006 abril de 2009, 103 pacientes procedentes de 14 instituciones suizas se inscribieron y recibieron BE hasta la progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable. En el momento de la progresión, los pacientes recibieron quimioterapia con 4-6 ciclos de cisplatino y gemcitabina. El criterio principal de valoración fue la tasa de la enfermedad de estabilización (DSR) se define como la proporción de pacientes con respuesta completa (CR), remisión parcial (PR) o enfermedad estable (SD) después de 12 semanas de tratamiento BE. Los objetivos secundarios incluyeron TTP bajo BE, así como en la TC, la supervivencia global (SG), la reducción del tumor a las 12 semanas y 6 meses. Los resultados clínicos de este ensayo se ha informado anteriormente [21].
Análisis de Patología
El fijados en formalina y embebidos en parafina especímenes fueron revisados y clasificados de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) criterios. análisis de mutaciones de EGFR (exones 18-21) y KRAS (exón 12) se llevaron a cabo a partir de secciones de tejido sin teñir (3 m) o muestras citológicas teñidas con Papanicolaou mediante secuenciación directa como se describe anteriormente [45], [46]. el enriquecimiento de las células tumorales se logra ya sea por macrodissection o láser microdisección de captura y análisis de secuencias de ADN.
El exón gen a nivel de análisis de la expresión
El ARN total de bronchoscopic conjunto se extrajeron muestras de biopsia y proporcionan una calidad suficiente para hibridación de microarrays en 42 de 49 muestras. ARN circulante a partir de muestras de sangre periférica se extrajo y se proporciona una calidad suficiente para la hibridación de microarrays en todas las 75 muestras. ARNm se hibridó en vectores Affymetrix Human exón 1.0ST (Affymetrix, SantaClara, CA, EE.UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante estándar (procedimiento detallado disponible en el texto S1). Los datos en bruto se han depositado en NCBIs de la Expresión Génica Omnibus (GEO), y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE37138. Los probesets exón y el nivel de gen fueron pre-procesado, calidad controlada y se normalizaron utilizando el procedimiento RMA [47]. Los tejidos y sangre conjuntos de datos se analizaron de forma independiente sin agrupar los datos. El conjunto de datos tejido se utiliza para el descubrimiento de biomarcadores, mientras que el conjunto de datos en la sangre se utilizó para la validación interna.
Consideraciones estadísticas
El cálculo inicial del tamaño de la muestra se basó en el criterio de valoración principal del estudio clínico (DSR en la semana 12 (DSR12) bajo BE tratamiento). Los 101 pacientes evaluables acumulados garantizan una alta precisión en la estimación de DSR12. En un enfoque génica dirigida, 3 genes se investigaron en concreto: EGFR (ENSG00000146648), KRAS (ENSG00000133703) y VEGFA (ENSG00000112715). EGFR incluyó 51, 13 KRAS, y VEGFA 25 probesets exonic (Figura 1). Los criterios de valoración considerados en este estudio de biomarcadores incluyen la reducción del tumor después de 12 semanas (TS12) de tratamiento BE, BE y TTP bajo OS. OS se midió desde el registro hasta la muerte por cualquier causa. El resultado de la secuenciación anterior EGFR tumor se utilizó para el análisis subestudio. La asociación univariable entre las intensidades de nivel y puntos finales exón-tiempo hasta el evento fue evaluada por Cox regresión de riesgos proporcionales. La correlación entre la intensidad de nivel exón y la reducción del tumor se midió utilizando el coeficiente de correlación de Spearman y la prueba de diferencias significativas entre 0. correcciones de Bonferroni se utilizaron para dar cuenta de las múltiples pruebas. Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) para resumir la información incluida en varias probesets a nivel de exón en las puntuaciones compuestas (puntuaciones en los primeros componentes principales). Característica (ROC) curvas de funcionamiento del receptor fueron utilizados para estimar la sensibilidad, especificidad y exactitud de predicción basados expresión exón. Con el fin de evaluar la estabilidad de nuestros hallazgos, se utilizó una estrategia de validación cruzada. La precisión del modelo de clasificación se evaluó usando bootstrapping. Todos los análisis se realizaron utilizando el software estadístico R (versión 2.13.0; xmapcore paquetes, ade4, ROCR, Daim y supervivencia) [48]
Apoyo a la Información
Figura S1.. Asociación entre
EGFR exón 18 expresión y la reducción del tumor en la semana 12 - subanálisis. Sólo los pacientes EGFR de tipo salvaje se incluyeron en este análisis. El diagrama de dispersión representa la correlación entre la expresión de EGFR exón 18 (probeset 3.002.770) y la reducción del tumor en la semana 12. La línea vertical muestra la intensidad mediana de expresión de EGFR exón 18. doi: 10.1371
/journal.pone.0072966 .s001 gratis (TIF)
figura S2.
Estabilidad de la capacidad de predicción de los biomarcadores de EGFR usando estrategias de validación cruzada. El panel de la izquierda representa la capacidad del biomarcador EGFR más importante asociado a TS12 (≤ /& gt; 20%) utilizando el conjunto de datos original (probeset 3.002.770) para clasificar los respondedores. El mejor valor de corte, junto con la tasa de falsos positivos asociados (FPR), verdadera tasa positiva (TPR) y el área bajo la curva ROC (AUC) se les da. El panel derecho muestra la curva ROC promedio obtenido después del procedimiento de arranque .632 validación cruzada. Los diagramas de caja muestran la distribución del FPR lo largo de los re-muestreo de datos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072966.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
Resumen de todos los pacientes incluidos en el ensayo SAKK 19/05. DST W12:. Estabilización de la enfermedad la semana 12, 0 = fracaso, 1 = éxito
doi: 10.1371 /journal.pone.0072966.s003 gratis (PDF)
Texto S1.
materiales y métodos de información adicional. El primer párrafo proporciona una descripción ampliada del análisis de expresión génica a nivel de exón. El segundo párrafo da detalles acerca de la evaluación de la estabilidad de los resultados obtenidos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072966.s004 gratis (PDF)
Reconocimientos
Muestra recogida, el transporte y el procesamiento se realizó dentro de la estructura de los suizos de la biopsia pulmonar Biobanco por lo cual estamos muy agradecidos. Estamos muy agradecidos a Philippe Demougin que llevó a cabo el aislamiento de ARN y el exón matriz de hibridación. El estudio no se podría haber hecho sin la voluntad de los pacientes a participar en este estudio, especialmente para someterse a una broncoscopia adicional en ciertos casos.
Colaboradores
Los miembros del equipo SAKK 19/05 Estudio