Extracto
Introducción
En los estudios asignados al azar con EGFR TKI sólo una pequeña proporción de pacientes con NSCLC han perfilado genéticamente biopsias. Directrices proporcionan evidencia para llevar a cabo el análisis de la mutación KRAS y EGFR en CPNM no escamoso. Exploramos la calidad de la biopsia del tumor ofrecieron para las pruebas de mutación, la distribución de las mutaciones diferentes, y el resultado con EGFR TKI.
Pacientes y métodos
Se estudiaron los datos clínicos de los 8 hospitales regionales de las características del paciente y del tumor, el tratamiento y la supervivencia global. Las biopsias se envían al laboratorio central se evaluaron para determinar la calidad del ADN y posteriormente se analizaron en busca de mutaciones en los exones 18-21 del EGFR y el exón 2 del gen KRAS por análisis de secuencia bidireccional.
Resultados
Los tumores de 442 subsecuente se analizaron los pacientes. Para 74 pacientes (17%), los tumores no eran adecuados para el análisis de mutación. Treinta y ocho pacientes (10,9%) tenían mutaciones de EGFR con 79% de mutaciones activantes conocidos. Ciento ocho pacientes (30%) tenían mutaciones de KRAS funcionales. El espectro de mutación era comparable a la base de datos cósmica. Después del tratamiento en la primera o segunda línea con EGFR TKI mediana de supervivencia global de los pacientes con EGFR (n = 14), KRAS (n = 14) mutaciones y de tipo salvaje EGFR /KRAS (n = 31) no se alcanzó, 20 y 9 meses , respectivamente.
Conclusión
Uno de cada 6 muestras tumorales fue inadecuada para el análisis de mutación. Los pacientes con mutaciones activadoras del EGFR tratados con EGFR-TKI tienen la supervivencia más prolongada
Visto:. Kerner GSMA, Schuuring E, J Sietsma, Hiltermann TJN, Pieterman RM, de Leede GPJ, et al. (2013) Las mutaciones de EGFR comunes y raras y KRAS en un holandés no pequeñas de cáncer pulmonar de células de población y sus resultados clínicos. PLoS ONE 8 (7): e70346. doi: 10.1371 /journal.pone.0070346
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2013; Aceptado: 17 Junio 2013; Publicado: July 29, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kerner et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado en parte por el consorcio de la Fuerza Aérea Tshwane (http://www.ctmm.nl). Tshwane paga el salario de GSMAK y no tenía ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito. No hay otras fuentes externas de financiación para este estudio
Conflicto de intereses:. La Fuerza Aérea Consorcio Tshwane es un consorcio público /privado con la participación de instituciones académicas, empresas privadas y del gobierno. No es una fuente comercial de financiación. Gerald Kerner es financiado por el consorcio Tshwane para llevar a cabo el proyecto de investigación (investigación traslacional y de imagen en el cáncer de pulmón) que es una parte de su tesis. Los autores tienen derecho a publicar todo su trabajo y compartir todos sus datos públicamente. Sin consultoría, patentes o productos en desarrollo están involucrados. En conjunto, esto no tiene ningún impacto en la adherencia de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Todos los autores no declarado tener ningún intereses en competencia.
Introducción
El efecto de los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR (TKI) en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) depende de la mutación EGFR estado. Por lo tanto, la selección de la muestra de tumor adecuados para el análisis mutacional es un tema importante en la toma de decisiones de tratamiento en NSCLC. En estudios aleatorizados anteriores que comparan la terapia EGFR TKI a la quimioterapia regular, la proporción de pacientes con tejido tumoral adecuada para el análisis fue de 10 a 38% [1], [2], [3], [4], [5], [6 ]. La mayoría de los estudios aleatorios utilizan diferentes pruebas de mutación de EGFR que sólo examinaron un número muy limitado de mutaciones de punto de acceso como L858R y el exón 19 supresiones [2], [7], [8], [9], [10]. Lo que ocurrió con mutaciones menos frecuentes, no siempre es evidente. A medida que las mutaciones de EGFR sólo están presentes en el CPNM no escamoso [11], el fenotipo histológico exacto es obligatoria con el fin de tomar decisiones sobre el tipo de quimioterapia y para predecir la presencia de mutaciones a priori. La pauta IASLC /ATS /ERS recomienda las pruebas de mutaciones en el CPNM no escamoso [12].
En los pacientes caucásicos con carcinoma de pulmón de células no escamosas, la mutación KRAS es más común (20-30% de los casos) [13], [14], seguido en frecuencia por mutaciones en el gen EGFR (10-20% de los casos) [13], [15]. Dentro de fenotipos histológicos, ciertas características parecen estar asociados con mutaciones específicas, por ejemplo el aspecto micropapilar de adenocarcinoma con mutaciones BRAF V600 [16]. Aunque es ventajoso para los pacientes con mutaciones activadoras de EGFR para recibir EGFR TKI [2], [3], [8], [17], [18], [19], en pacientes con otros tipos de aberraciones genéticas que este tratamiento no es eficaz. Por ejemplo, en un estudio en pacientes con EML4-ALK translocaciones una falta de respuesta del tumor a EGFR TKI fue informado [20]. Sin embargo, para los pacientes con CPNM con mutaciones KRAS la evidencia no es concluyente. Varios estudios han demostrado una total falta de respuesta al tratamiento con un TKI del EGFR [17], [21], [22], un estudio demostró que los pacientes con CPNM con tumores que tienen mutaciones de KRAS tuvieron un resultado similar a cualquiera de TKI del EGFR o la quimioterapia [3] . Los tumores con mutaciones de KRAS se han demostrado tener peores resultados en comparación con los pacientes con KRAS de tipo salvaje (WT), tanto cuando son tratados con cirugía [23] o con quimioterapia [24].
El objetivo es estudiar la distribución de EGFR común y rara y mutaciones de KRAS enviado desde 8 hospitales regionales para el departamento de patología de la universidad. La calidad de las biopsias de tumores enviados para su análisis mutacional y se evaluó el estado de mutación se relaciona con el tratamiento con el resultado TKI del EGFR.
Métodos
Los pacientes
Este estudio se refiere a todo el CPNM muestras tumorales de ocho hospitales holandeses regionales durante el período de noviembre de 2008 hasta abril de 2011 que se probaron para el estado mutacional por un departamento de patología central. Se recogieron datos sobre los (diferentes) líneas de tratamiento recibido el sexo, el tabaquismo, la edad al momento del diagnóstico, estadio al momento del diagnóstico, la localización de las metástasis, fecha de inicio y. Las muestras tumorales fueron obtenidas por broncoscopia, biopsia pulmonar transtorácica y /o de la resección pulmonar y se enviaron al departamento de patología respectiva para el examen histológico. La histología fue de acuerdo a criterios de la OMS de 2004 [25]. La respuesta al tratamiento se realizó de acuerdo con los criterios RECIST [26].
procedimiento de recogida de muestras y extracción de ADN
A partir de cada fijado en formol y el bloque de tejido tumoral incluido en parafina (FFPE) que fue enviado a la Departamento de Anatomía Patológica se cortaron secciones de 4 micras. Después de hematoxilina y eosina, los portaobjetos fueron evaluadas por un patólogo pulmonar experimentado por la presencia de tejido tumoral suficiente y estimando el porcentaje de células tumorales. Las muestras con claridad menos de 50 células tumorales% se definieron como inadecuada para las pruebas de mutación del EGFR /KRAS. Las áreas con & gt; 50% las células tumorales marcadas por el patólogo en la diapositiva. Esta zona se raspa de la diapositiva utilizando un bisturí y se disolvió en TE-4 y 20 mg /ml de proteinasa K (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.). Se extrajo el ADN mediante incubación durante la noche a 55 ° C, seguido de calentamiento a 100 ° C durante 5 minutos para inactivar la proteinasa K y se centrifugó a temperatura ambiente a 13000 rpm. La solución acuosa se usó directamente para el análisis de PCR o se almacenaron a -20 ° C. concentración de ADN se midió en un espectrofotómetro ND1000 (Nanodrop, Wilmington, DE, EE.UU.). Todos los aislados de ADN se fijan a 10 ng /l en TE-4 antes de su uso. Para el control de calidad, el ADN genómico se amplificó en una PCR multiplex que contiene un conjunto de cebadores de genes de control que resulta en productos de 100, 200, 300, 400 y 600 pb de acuerdo con el protocolo BIOMED-2 [27]. Sólo las muestras de ADN con productos de PCR de 300 pb y más grande se utilizaron para el análisis de mutación. Todas las muestras se ensayaron en ADN extraído de dos diapositivas independientes (duplicados). Se tomaron todas las precauciones habituales para evitar la contaminación de los productos de amplificación utilizando laboratorios independientes para el manejo pre y post-PCR. Para evitar la contaminación cruzada, se utilizó una cuchilla nueva microtomo cada vez que se seccionó una nueva muestra.
Cualquiera de secuenciación directa o alto (HRM) fundir la resolución con la secuenciación directa de confirmación se realizó de acuerdo con el protocolo. Las mutaciones idénticas en avance y retroceso se requiere la secuenciación antes de informar un resultado positivo. El protocolo se detalla en el Apéndice S1. Los cebadores utilizados para la secuenciación directa o gestión de recursos humanos se describen en la tabla complementaria 1.
Consentimiento Informado y Ética
Cuando los pacientes visitaron por primera vez el departamento de pacientes externos, el consentimiento informado por escrito para la sangre y el tejido tumoral se obtuvo por análisis mutacional. pruebas de EGFR y KRAS se llevaron a cabo como parte del enfoque de diagnóstico de rutina y el resultado de estas pruebas se documentan en el archivo del paciente y se comunican con los pacientes. Debido a que este es un estudio retrospectivo para recopilar y analizar los datos clínicos del paciente, en virtud de la Ley holandesa para la investigación médica humana (OMM), sin el consentimiento era necesario desde el comité de ética médica. Los datos fueron codificados y no detectable al paciente individual.
Estadísticas
La estadística descriptiva se realizaron las características del paciente y del tumor. Se tabularon las frecuencias de mutaciones comunes y raras. La frecuencia de mutaciones de EGFR y KRAS se compararon con los datos disponibles en el tejido pulmonar, del Catálogo de mutaciones somáticas en la base de datos del Cáncer, (DB cósmico; http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). La relación entre la presencia o ausencia de mutaciones y la aparición de la mayoría de las metástasis tumorales comunes se determinó utilizando el dos caras prueba exacta de Fisher. Para este análisis particular de los pacientes, ya sea con un EGFR o una mutación KRAS se compararon con los pacientes que se anotó como EGFR y KRAS WT. La supervivencia global (OS) se calculó a partir de la fecha de diagnóstico de la enfermedad en estadio IV hasta la censura o la muerte. Sólo los pacientes con datos clínicos disponibles que habían progresado a la enfermedad en estadio IV y posteriormente fueron tratadas fueron incluidos para el análisis de supervivencia. Todos los pacientes tratados con un TKI del EGFR, independientemente de su estado mutacional se evaluaron para la supervivencia general.
univariante de Cox análisis de regresión se realizó con la edad covariables, el sexo, la histología (presencia de adenocarcinoma, células escamosas y carcinoma de células grandes) también se analizaron KRAS y EGFR mutación, sitio de metástasis (cerebro, médula, pulmón). Las variables con
p-valor
inferior a 0,20 se utilizaron para el análisis multivariante.
Todo el análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 18.0. Nominal
P
-valores inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
EGFR y KRAS mutaciones
desde noviembre de 2008 hasta abril de 2011 muestras de 474 442 los pacientes fueron enviados al departamento de patología central para el análisis de mutación. La clasificación histológica más frecuente fue el adenocarcinoma (80%), el 8% de las muestras de vino de subtipos histológicos no asociados con mutaciones de EGFR (Tabla 1).
Doscientos veinte y un pacientes (60,1% del total de pacientes analizados , el 50% de todos los pacientes) fueron EGFR y KRAS WT. Treinta y ocho pacientes (10,9% de todos los pacientes analizados, el 8,6% de todos los pacientes) tenían una mutación de EGFR (Tabla 2). En 5 pacientes, 2 mutaciones de EGFR diferentes coincidieron en el mismo tejido tumoral que resulta en un total de 43 mutaciones. Treinta de los 38 pacientes con mutaciones de EGFR (79%) eran mutaciones activadoras del EGFR. Sólo un paciente tenía una mutación T790M en el tumor primario. TTF-1 adenocarcinomas positivos mostraron una mutación de EGFR con más frecuencia que los que estaban TTF-1 negativo (26/150 vs 1/50, prueba exacta de 2 caras de Fisher,
p
= 0,01).
un total de 110 de los pacientes (30% de todos los pacientes ensayados, 24% de todos los pacientes) tenía una mutación KRAS con G12C (41%) y G12V (18%) siendo las mutaciones más frecuentes y que muestra un similares la distribución como en la base de datos cósmica (Tabla 3). También encontramos 1 (1%) rara mutación KRAS en el codón 13, (p.G13Y). Además, 2 pacientes tenían mutaciones de KRAS fuera del punto de acceso (p.V14L y p.L19F), éstos no son funcionales. Esto significa que en un total de 108 pacientes se detectó una mutación KRAS funcional en nuestra cohorte. La comparación de los resultados de mutaciones en los diferentes subtipos de NSCLC en nuestra población se muestra en la tabla 4.
Calidad de las muestras tumorales para el análisis de la mutación
Setenta y cinco muestras de tumores ( (16%) no eran adecuadas para el análisis de mutación. en el tejido 59 muestras contenían células tumorales de menos de 50% (sobre todo debido a la extensa inflamación entremezcla) y en 16 la calidad del ADN apareció inadecuado para las pruebas de mutación. en 4 de estos pacientes una adecuados muestra de tejido fue cedido por la re-biopsia. En 3 tumores no se realizó un análisis más detallado de mutación (SCC /carcinoides). Esto significa que a partir de 74 (75 + 3-4) (17%) pacientes no hay resultados fueron obtenidos a partir del análisis mutacional. En un total de 345 pacientes las muestras tumorales eran adecuadas tanto para EGFR y el análisis del gen KRAS. un único gen KRAS o mutación de EGFR análisis se realizó en las muestras tumorales de 18 pacientes y 5, respectivamente (Figura 1).
* 2 mutaciones de KRAS están fuera de la zona activa, estos son probablemente no funcional.
EGFR y KRAS mutaciones y metástasis distribución
el uso de los datos clínicos de 303 pacientes, hemos sido capaces de analizar la preferencia por las regiones metastáticos comunes conocidos para los pacientes con CPNM con KRAS y EGFR estado mutacional. nódulos pulmonares
(p = 0,01
), vertebrales (
p
= 0,03) y otra metástasis ósea (
p = 0,04
) fueron identificados que se asociaron significativamente con mutaciones de EGFR . No se encontró asociación entre las mutaciones de EGFR y pleural (
p = 0,15
), cerebral (
p
= 1.0), hepáticas (
p = 0,46
) o suprarrenal (
p = 0,37)
localizaciones metastásicas. Ninguno de estos sitios se asocia con mutaciones de KRAS.
Análisis de supervivencia
En el análisis de los datos clínicos, la histología de células grandes (HR 1,8, IC del 95%., 01/02 a 02/08,
p
. & lt; 0,01) y la metástasis ósea de la columna (HR 1,5, IC 95%, 1,0-2,2,
p
= 0,05) se asociaron con una peor supervivencia, mientras que la mutación de EGFR (HR 0,4, 95 .% IC, 0,2-0,7,
p Hotel & lt; 0,01) se asoció con una mejor supervivencia. En un modelo multivariado, la histología (carcinoma de células grandes, HR 2.2, 95% IC, 1.4 a 3.4,
p
. & Lt; 0,01)., Metástasis ósea en la columna (HR 1,7, IC 95%, 1,2-2,6 ,
p
. & lt; 0,01), y el estado mutacional (mutación de EGFR, HR 0,3, IC 95%, 0,1-0,6
p Hotel & lt; 0,01) se asociaron significativamente con la supervivencia. (Tabla 5).
Cuando la selección de pacientes que recibieron tratamiento TKI del EGFR en la primera o segunda línea, la mediana de supervivencia global no se alcanzó después de inicio de este tratamiento en pacientes con mutación de EGFR (n = 14 ), 20 meses (95% IC., 0-46, n = 14) para los pacientes con la mutación KRAS y 9 meses (95% IC., 0-28, n = 31) para los pacientes con EGFR /KRAS WT. (Figura 2A y 2B).
EGFR y KRAS mutaciones raras y la respuesta al tratamiento
Las mutaciones que no se han descrito previamente en COSMIC DB se describen en la Tabla 6. El tratamiento con un EGFR TKI en pacientes con estas mutaciones de EGFR raras no se tradujo en un beneficio clínico, excepto en un paciente que también tenía una mutación adicional de activación de EGFR.
Discusión
EGFR es una proteína de la superficie celular que conduce a la activación de la proliferación y la invasión a través de diferentes vías de transducción de señales [28]. KRAS es un objetivo abajo del EGFR. Activar o sensibilizantes mutaciones causan una activación constitutiva del dominio de tirosina quinasa de la proteína EGFR, mediante la desestabilización de la conformación autoinhibiting [29]. TKI del EGFR como gefitinib han aumentado capacidades de unión de estas proteínas mutantes. Las proporciones de esta mayor capacidad de unión es de hasta 100 veces en comparación con la proteína EGFR de tipo salvaje [29].
Las dos mutaciones más comunes de EGFR sensibilizante a EGFR TKI, en deleciones marco del exón 19 y la mutación L858R , [19], [30], [31], [32], [33] representa más de la mitad de todos los pacientes con mutaciones de EGFR. Otros aberraciones sensibilizantes fueron encontrados en tres pacientes que tienen una mutación G719X y en otro paciente una mutación L861R [33], [34], [35]. Observamos 5 mutaciones raras o no descritas previamente (Tabla 2) y se han caracterizado su respuesta al tratamiento con ITC (Tabla 6). Es de destacar que la mutación específica es p.D770GY, que fue encontrado en dos pacientes, con diferentes respuestas. El primero de estos pacientes tenían una combinación de p.D770GY y una mutación p.G719C mientras que el segundo sólo tenía una mutación p.D770GY. El primer paciente respondió a EGFR TKI y permanece libre de enfermedad a los 15 meses, mientras que el paciente sin la mutación secundaria había diagnosticado enfermedad progresiva a las 4 semanas. Anteriormente se describieron 2 casos de esta mutación sin información sobre la respuesta del tumor [36], [37]. Nuestros datos sugieren que la mutación p.G770GY no proporciona beneficio para el tratamiento EGFR TKI. Por otra parte, hemos demostrado que también los pacientes con una de las otras 4 raras mutaciones de EGFR (p.K708N, p.G709_T710 & gt; H, p.L833F y p.A840T) tenían ningún beneficio de EGFR-TKI
Pequeño. muestras de tumores, principalmente de broncoscópica o biopsias de núcleo transtorácico pueden ser un problema para las pruebas de mutación adecuada. Se identificaron las causas por qué el análisis mutacional en nuestro laboratorio no fue posible en el 17% de los pacientes. Esto fue ya sea por número insuficiente de células tumorales (12%) o debido a la insuficiente calidad del ADN (4%) destacando la necesidad de una selección adecuada de tejido tumoral para el análisis mutacional. Los estudios retrospectivos en los que se utilizó a largo plazo tejido incluido en parafina archivado para determinar el estado de EGFR mostraron una baja proporción de tejido tumoral disponible adecuada [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Una manera de obtener más células tumorales es por las repetidas biopsias o cryobiopsies [38]. Los nuevos desarrollos tecnológicos son mucho más sensibles que antes, lo que permite un menor número de células tumorales tanto cualitativa (%) y cuantitativamente (número absoluto) que se requieren para la detección de mutaciones. Sin embargo, con respecto a la heterogeneidad del tumor, este aumento de la sensibilidad alberga un aumento del riesgo de errores de muestreo y la detección de clones de menor importancia que pueden ser menos relevante para la terapia. Un estudio mostró que aproximadamente dos tercios de todas las mutaciones somáticas parecían no ser detectable en todas las regiones del tumor [39].
mutaciones de EGFR se produjo con mayor frecuencia en TTF-1 adenocarcinoma positivo. Dos estudios recientes mostraron esta asociación linaje de células [40], [41]. Funcionalmente, TTF-1 inducida por ROR-1 es necesaria para mantener la vía en las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón [42] señalización del EGFR.
Hemos identificado la preferencia de EGFR mutante tumores a extenderse a intrapulmonar y tanto a la vértebra y otras localizaciones óseas. Esto contrasta con un estudio realizado por Doebele et al, que sólo se observa una preferencia por la diseminación metastásica hepática en EGFR mutante tumores [43] .En contraste, se observó el patrón miliar típico de los tumores con EGFR exón 19 de su eliminación como se describe anteriormente [44]. Nuestros resultados para KRAS tumores mutantes (71 pacientes) fueron como se ha descrito anteriormente por Doebele et al (49 pacientes) [43].
En nuestra población el resultado de los pacientes con una mutación KRAS respondió de manera similar a KRAS WT ambos con respecto a la quimioterapia y a EGFR TKI. Previamente se demostró que los pacientes con KRAS no mutado tienen un mejor resultado que los pacientes con mutaciones de KRAS cuando son tratados con un TKI del EGFR [22]. Otros estudios demostraron la presencia de mutaciones de KRAS en el cáncer de pulmón que es indicativo de un peor resultado independientemente del tratamiento que recibieron [45], [46]. En el estudio TITAN, no había evidencia de un mayor riesgo de muerte en pacientes con tumores KRAS mutantes tratados con erlotinib en comparación con la quimioterapia, pero no había ningún riesgo elevado de progresión del tumor [4]. En nuestro estudio, no se combinaron los pacientes mutación positiva del EGFR con el EGFR /KRAS WT al comparar estos pacientes con KRAS mutantes pacientes. Como los pacientes con mutaciones de EGFR tienden a tener mejores resultados a continuación pacientes EGFR WT, esto podría explicar nuestros resultados.
En conclusión, se encontró en el 10,9% y el 30% de todos los pacientes la prueba de una mutación de EGFR o KRAS, respectivamente . También se identificaron 5 nuevos o EGFR mutaciones raras y 2 nuevas mutaciones KRAS en nuestra población. El diecisiete por ciento de los pacientes tenían tejido tumoral inadecuada para llevar a cabo el análisis de mutación, principalmente debido al volumen de tumor insuficiente y /o porcentaje. No hubo diferencias en la supervivencia global después de comenzar EGFR-TKI en pacientes con mutación KRAS y EGFR /KRAS WT.
Apoyo a la Información
Apéndice S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0070346.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos a Klaas Kooistra, Erik Nijhuis, Anke van de Berg por su contribución para el análisis de mutaciones de EGFR y Roel Soesbeek para ayudar con la recolección de datos.