Extracto
receptor del factor de crecimiento epidérmico inhibidores de tirosina cinasa gefitinib y erlotinib han sido ampliamente utilizados en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Desafortunadamente, la eficacia de la EGFR-TKI está limitada debido a la resistencia natural y adquirida. Como un mecanismo novedoso para citoprotector de las células tumorales para sobrevivir en condiciones desfavorables, se ha propuesto la autofagia para jugar un papel en la resistencia a fármacos de las células tumorales. Ya sea que la autofagia puede ser activado por gefitinib o erlotinib y en consecuencia una alteración de la sensibilidad de la terapia dirigida a las células de cáncer de pulmón sigue siendo desconocido. Aquí, informamos primero que erlotinib o gefitinib puede inducir un alto nivel de autofagia, que estuvo acompañada por la inhibición de la vía de señalización PI3K /Akt /mTOR. Por otra parte, la citotoxicidad inducida por erlotinib o gefitinib se ha mejorado en gran medida después de la inhibición de la autofagia por la cloroquina inhibidor farmacológico (CQ) y siRNAs dirigidos ATG5 y ATG7, los componentes más importantes para la formación de autofagosoma. Curiosamente, EGFR-TKI todavía puede inducir la autofagia celular, incluso después de la expresión de EGFR se redujo en siRNAs específicos de EGFR. En conclusión, se encontró que la autofagia puede ser activada por EGFR-TKIs en células de cáncer de pulmón y la inhibición de la autofagia aumentó el efecto inhibidor del crecimiento de EGFR-TKI. Así, la inhibición de la autofagia representa un enfoque prometedor para mejorar la eficacia de EGFR-TKI en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado
Visto:. Han W, Pan H, Chen Y, Sun J, Wang Y, Li J, et al. (2011) EGFR inhibidores de tirosina cinasa Activar autofagia como una respuesta Citoprotector en células de cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 6 (6): e18691. doi: 10.1371 /journal.pone.0018691
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de noviembre de 2010; Aceptado: March 15, 2011; Publicado: June 2, 2011
Derechos de Autor © 2011 Han et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de concesión 30.901.740, www.nsfc.gov.cn), China Ministerio Nacional de Educación de Grant (subvención número 20090101120124, www.moe.edu.cn), Zhejiang Ciencias Naturales Fundación Grant ( el número de concesión Y2090166, www.zjnsf.net:81), y Proyectos de investigación del Departamento de Educación de Zhejiang (número de concesión Y200805751, www.zjedu.gov.cn) a W. Han, y los Fondos de investigación Fundamental para las Universidades central a H. Jin. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La quimioterapia no es lo suficientemente eficaz para los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado (NSCLC) y la tasa de respuesta es sólo el 20% al 35%, con una supervivencia media de 10 a 12 meses [2], [3]. Al dirigirse a moléculas críticas para el desarrollo del cáncer, la terapia dirigida solo o en combinación con otros tratamientos fue reconocido recientemente como una estrategia prometedora para conquistar tipos de cáncer incluyendo NSCLC [4].
Como uno de los receptores tirosina quinasas (RTK) importante el crecimiento del cáncer de células, la proliferación, invasión y metástasis, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se frecuencia desregulados en NSCLC [5]. EGFR sobre-expresión se observó en aproximadamente 62% de células de adenocarcinoma y subtipos escamosas [6]. EGF puede inducir la activación de tres vías de señalización importantes para el inicio y la progresión de cánceres, Ras /MAPK, PI3K /Akt, y JAK /Stats [7]. Como resultado, EGFR se convirtió en una de las moléculas para el desarrollo de la terapia dirigida a NSCLC. Mediante la inhibición de la actividad de la tirosina quinasa de EGFR, dos inhibidores de tirosina quinasa (TKI) llamado gefitinib (Iressa, AstraZeneca) y erlotinib (Tarceva, Genentech) se han desarrollado para el tratamiento de NSCLC. Gefitinib y erlotinib pueden inhibir el crecimiento del tumor tanto in vitro como in vivo. Clínicamente, los receptores EGFR-TKI mostró buena actividad antitumoral y la tolerabilidad en pacientes con CPNM con la enfermedad progresa después de la quimioterapia basada en platino primera línea [5], [8], [9]. Sin embargo, la eficacia de la EGFR-TKI disminuye significativamente por la resistencia natural y adquirida. El mecanismo es aún en gran medida desconocida, aunque se han propuesto las mutaciones de EGFR a ser uno de los mecanismos para influir en la sensibilidad de EGFR a estos inhibidores [10], [11].
macroautofagia (en lo sucesivo, la autofagia) es una proceso de auto-proteolisis en células eucariotas que resulta en el desgaste del material intracelular dentro macroautophagosome o lisosomas [12], [13]. Bajo condiciones de estrés celular como el medio ambiente deficiente en nutrientes, la autofagia se activa rápidamente para proporcionar una fuente alternativa de energía y por lo tanto permiten a las células sobrevivir [14]. La autofagia se upregulated durante la etapa posterior de crecimiento del tumor, porque la inducción de la autofagia permite que las células tumorales sobrevivan en microambientes falta de nutrientes y oxígeno [15]. A través de la promoción de la supervivencia de las células tumorales en condiciones desfavorables, la autofagia fue propuesto como un mecanismo alternativo de resistencia a los medicamentos. Por ejemplo, la autofagia contribuye a la resistencia de las células de cáncer de mama para el tratamiento con bortezomib [16]. La inhibición de la autofagia podría sensibilizar a las células tumorales a muchos fármacos citotóxicos o revertir la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, lo que representa una estrategia prometedora para mejorar la eficacia del tratamiento del cáncer [17].
Vías de señalización corriente abajo de EGFR y otros RTK tales como PI3K /Akt están involucrados en la regulación de la autofagia, lo que indica una posible relación entre la inhibición RTK y la autofagia. Otra TKI nombrado como imatinib hecho puede activar la autofagia en las respectivas de tipos de células [18], [19]. Además, el bloqueo de la formación de macroautophagosome mejora la eficacia de los anti-HER2 anticuerpo monoclonal trastuzumab (TZB) [20]. Sin embargo, si la autofagia se asocia con gefitinib y erlotinib en células de cáncer de pulmón sigue siendo desconocido. En el estudio actual, lo primero que demuestra que el gefitinib o erlotinib autofagia activado en células de cáncer de pulmón y el bloqueo de la autofagia aumentó el efecto de gefitinib o erlotinib.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
Los productos químicos utilizados fueron gefitinib (J & amp; K química Ltd., G304000), erlotinib (J & amp; K química Ltd., E625000) y la cloroquina (CQ) (J & amp; K química Ltd., 147236). Los anticuerpos primarios fueron anticuerpos contra la proteína 1 de la cadena ligera asociada a los microtúbulos 3 (LC3) (Cell Signaling Technology,#2775), ATG5 (Cell Signaling Technology,#2630), ATG7 (Cell Signaling Technology,#2631), fosfo-mTOR ( S2448) (Cell Signaling Technology,#2971), mTOR totales (Cell Signaling Technology,#2983), fosfo-p70s6k (T389) (Cell Signaling Technology,#9234), fosfo-AKT (S473) (Cell Signaling Technology,#4051 ), AKT total de (Tecnología de Señalización celular,#9272), GAPDH (Tecnología de Señalización celular,#3683). Los anticuerpos secundarios fueron HRP conjugado anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology, sc-2357) y anti-IgG de ratón (Santa Cruz Biotechnology, sc-2371).
Los cultivos de células
El cáncer de pulmón líneas celulares (A549, NCI-H1299, NCI-H292, NCI-H1650 y SK-MES-1) fueron comprados de banco de células (Academia de Ciencias de china). cultivo en monocapa de células de cáncer se mantuvo en RPMI 1640 suplementado con 10% (v /v) de FBS y antibióticos. solución madre de gefitinib o erlotinib se preparó en dimetil-sulfóxido (DMSO) (Sigma, D4540), y se diluyó con medio antes de su uso. La concentración final de DMSO era & lt;. 0,1%
Ensayo de citotoxicidad
La citotoxicidad de los productos químicos contra líneas celulares de cáncer de pulmón se determinó mediante el ensayo de MTT. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (cultivó durante la noche para las células adherentes) y se tratan con productos químicos con diferentes concentraciones. Después de 48 h de incubación, se añadió 20 l de MTT (5 mg /ml) en cada pocillo de 4 h de incubación. Después de eso, se retiró el sobrenadante y se añadió 150 l DMSO en cada pocillo con el fin de solubilizar los cristales de color azul-púrpura de formazán. La absorbancia se midió usando un modelo ELx800 Micro Plate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc.) a 570 nm.
Inmunofluorescencia microscopía confocal de láser Para LC3 y lisosoma co-ubicación
Lysosome era en primer lugar marcado por incubación con Lyso Tracker (Invitrogen, L7528), un colorante indicador lisosoma, durante 90 min a 37 ° C. Las células se recogieron, se fijaron y permeabilizaron con tampón 1% CHAPS (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, 1,0% CHAPS) a temperatura ambiente durante 10 min, se incubaron con anti-LC3 de 2 h a temperatura ambiente, y se lavaron con PBS, se incubaron durante otros 45 minutos con anticuerpo de cabra conjugado con FITC anti-IgG de conejo (Beyotime, A0562). A continuación, los núcleos celulares se tiñeron por DAPI (Sigma, D9564). Las muestras fueron examinadas bajo un sistema 710 microscopio confocal Zeiss LSM (Carl Zeiss, Alemania). La imagen fue procesada con el software ZEN LE.
microscopía electrónica
Las células tratadas se lavaron y se fijaron durante 30 min en 2,5% de glutaraldehído. Las muestras se trataron con 1,5% de tetróxido de osmio, se deshidrataron con acetona y se incluyeron en resina Durcupan. Las secciones finas se poststained con citrato de plomo y se examinaron en el microscopio electrónico Tecnai 10 (Philips, Holanda) a 60 kV.
análisis de transferencia de Western
Western Blot se llevó a cabo como se informó anteriormente [21] . La proteína se aplicó a una concentración apropiada de gel de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a una membrana de PVDF, y luego detectada por los anticuerpos primarios y secundarios adecuados antes de la visualización con un kit de quimioluminiscencia. La visualización se realiza con Image Quant LAS-4000 (Fujifilm, Tokio, Japón) software usando una imagen multi-Gauge (Fujifilm, Tokio, Japón).
ARN de interferencia
Las células fueron transfectadas con cualquiera inespecífica siRNA (Qiagen, 1027280), ATG5 siRNA (Qiagen, SI02655310), ATG7 siRNA (Qiagen, SI02655373) o EGFR siRNA (Cell Signaling Technology,#6481) (siRNA concentración final, 100 nmol /L) a través de LipofectAMINE RNAi max (Invitrogen, 13778150) según las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron a continuación durante 48 h antes de la transferencia Western o ensayo de MTT.
PCR en tiempo real
ARN total fue aislado utilizando el método de Trizol y se sintetizó ADNc a partir de ARNm con el PrimeScipt MMLV RT Kit de reactivos (Takara,#6110). En tiempo real de reacción de PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando SYBR verde como el indicador fluorescente (Bio-Rad, 170-8882). qPCR experimentos se realizaron en un ABI-7500 y GAPDH se servía como control endógeno. Cada muestra se normalizó sobre la base de su contenido de GAPDH. Un total de 40 ciclos (5-s de desnaturalización a 95 ° C, 34-s annealingt /extensión a 55 ° C) se realizaron para cada cebador. Primer secuencias fueron los siguientes: para ATG5, TTC AAT CAG GTT TGG TGG AGG C (sentido) y ATG GTG GCA GAG GAA AGC AGA G (antisentido); para ATG7, ATG CCT GGG CAT CCA GTG AAC TTC (sentido) y CAT CAT TGC AGA AGT AGC AGC CA (antisentido); para GAPDH, GGA GTC AAC GGA TTT GGT (sentido) y GTG ATG GGA TTT CCA TTG AT (antisentido).
Estadística
análisis
A menos que se indique lo contrario, los datos se expresaron como la media ± SD , y se analizaron mediante la prueba t de Student.
resultados
EGFR-TKI inducir la autofagia en las células de cáncer de pulmón
Para evaluar la activación de la autofagia por EGFR-TKI, la conversión de LC3-I en LC3-II antes y después del tratamiento TKIs se determinó mediante análisis Western Blot. En A549 y las células NCI-H1299, tanto gefitinib y erlotinib pueden inducir el interruptor de LC3-I a LC3-II de la dosis y de forma dependiente del tiempo, lo que indica que la autofagia podría ser activado por tanto TKIs (Figura 1A y B). Para confirmar aún más que, la compartimentación de LC3 en las células antes y después del tratamiento TKIs se monitorizó mediante tinción de inmunofluorescencia indirecta. De hecho, TKIs indujo la colocalización de LC3-II con lisosoma, lo que demuestra la formación de autolysosome (Figura 1C y Figura S1). El análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica confirmó además que numerosos grandes vacuolas autofágicas con típico membrana de doble capa que contiene restos de orgánulos que se presentan en las células A549 tratadas con gefitinib en lugar de las células no tratadas (Figura 2A, B y C). Se obtuvieron resultados similares con erlotinib (Figura 2D y E).
A y B, las células de cáncer de pulmón se incubaron con concentraciones variables de gefitinib o erlotinib durante 24 horas o se incubaron con 25 mM gefitinib o erlotinib para intervalos apropiados. El interruptor de LC3-I a LC3-II se detectó por inmunotransferencia. células C, A549 o NCI-H1299 se trataron con DMSO o 25 gefitinib mu M durante 24 h. Las células se marcaron con fluorescencia y la imagen por microscopio confocal. Rojo, liso lisosomas rastreador marcado; Verde, LC3 marcado con FITC; , Núcleo azul DAPI marcado. La superposición se muestra en la columna de la derecha. Las células de naranja manchado indicaron LC3 co-localizados con los lisosomas
A549 células fueron tratadas con 25 mM durante 24 h gefitinib (A, DMSO;. B, Gefitinb, de baja potencia; C, Gefitinb, alta poder). D (baja resolución) y E (alta resolución), las células AGS fueron tratados con erlotinib 25 M durante 24 h (D, erlotinib, de baja potencia; E, erlotinib, de alta potencia). Numerosas vacuolas autophagical con típica membrana de doble capa que contiene los restos de orgánulos se señala con flechas. Barra = 1 m.
A continuación examinó los efectos de la EGFR-TKI en la expresión de ATG5 y ATG7, dos componentes críticos en la regulación de la formación de autofagosomas [22]. Tanto EGFR-TKI aumentó ATG5 y ATG7 en el los niveles de proteína o mRNA (Figura 3), confirmando la inducción de la autofagia por EGFR-TKI.
A, las células A549 se trataron con 25 mM gefitinib durante 6 h y la el nivel de ARNm de ATG5 /7 se mide por el tiempo real de RT-PCR como se describe en M & amp; M. RQ, la cantidad relativa. Las células negras, gefitinib tratada; gris, las células control. B, inmunotransferencia para ATG5 o ATG7 usando lisados de A549 tratadas con concentraciones variables de gefitinib o erlotinib durante 24 horas. Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar, y se analizaron mediante la prueba t de Student. ** P & lt;. 0,01
La inhibición de la vía de señalización Akt /mTOR /p70S6K por EGFR-TKI
Los estudios previos han demostrado que la PI3K /Akt eje /mTOR /p70S6K juega un importante papel en la inhibición de la autofagia [23], [24], por lo tanto, investigar el efecto de gefitinib y erlotinib en esta vía de señalización autofagia-supresor. De hecho, la fosforilación de AKT, mTOR y p70S6K tanto en las células H1299 y A549 se redujo significativamente por gefitinib y erlotinib en una manera dependiente del tiempo (Figura 4A y B). Sin embargo, no se detectaron cambios en la expresión de PTEN después del tratamiento ITC (Figura 4 C y D).
La fosforilación de mTOR, Akt y p70s6k en el A549 (A) o células NCI-H1299 (B) tratados con gefitinib o erlotinib se determinó por Western Blot. La expresión de PTEN en el A549 (C) o las células tratadas con diferentes concentraciones de erlotinib o gefitinib NCI-H1299 (D) fueron detectados por Western Blot.
El bloqueo de la autofagia mejorar EGFR-TKI la muerte celular inducida por
Muchos estudios han demostrado que la autofagia puede servir como una respuesta protectora evitando que las células tumorales de la muerte celular inducida por el tratamiento [17], [20], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. En línea celular de cáncer de pulmón NCI-H292 y NCI-H1650 que son relativamente sensibles a gefitinib y erlotinib, no se detectó la autofagia después de gefitinib o erlotinib (Figura 5A). Sin embargo, se detectó la autofagia en EGFR-TKI tratada células cancerosas que son relativamente resistentes a EGFR-TKI, tales como A549, NCI-H1299 y SK-MES-1 en las células (Figura 1 y 5a). Estos datos indicaron que la autofagia puede afectar a la sensibilidad de las células cancerosas a EGFR-TKI. Para probar este consumo, se comparó el efecto inhibidor del crecimiento de erlotinib o gefitinib en las células cancerosas antes y después de la inhibición farmacológica y genética de la autofagia. Como se muestra en la Figura 5B, CQ lo que puede perjudicar la función de los lisosomas e inhibir la autofagia en etapa tardía aumentada significativamente la inhibición del crecimiento inducida por gefitinib o erlotinib en A549, NCI-H1299 y SK-MES-1 que son relativamente resistentes a EGFR-TKI. Sin embargo, no podría inhibir el crecimiento de células de cáncer de pulmón por su propio. (Figura 5B). Del mismo modo, la inhibición del crecimiento inducida por gefitinib o erlotinib en células A549 se mejoró después de la autofagia fue inhibida por la caída de ATG5 o ATG7 (Figura 5C y D), dos componentes esenciales para la formación de autophagosome, lo que confirma que protegían la autofagia células tumorales de EGFR ITC induce la muerte celular.
a, autofagia fue inducida por EGFR-TKI en células de cáncer de pulmón resistentes pero no sensibles. expresión LC3 en células de cáncer de pulmón se incubaron con gefitinib 25 M o erlotinib durante 24 h se analizaron por inmunotransferencia. B, La viabilidad de las células cancerosas tratadas con 12,5 M gefitinib o erlotinib para 48 h con o sin 5 CQ mu M se midió mediante el ensayo de MTT. C, La expresión de ATG5 y ATG7 en las células A549 transfectadas transitoriamente con control negativo siRNA, ATG7 o ATG5 siRNA se determinó por inmunotransferencia. D, células transfectadas transitoriamente con control negativo siRNA, ATG7 o ATG5 siRNA se trataron con 12,5 M gefitinib o erlotinib 25 M durante 48 h. El efecto de la EGFR-TKIs en las células cancerosas con o sin ATG5 o ATG7 desmontables se analizaron mediante el ensayo de MTT. Carolina del Norte, Control de siRNA. Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar, y se analizaron mediante la prueba t de Student. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01
EGFR-TKI inducir la autofagia en las células cancerosas con EGFR-desmontables
A continuación, nos gustaría conocer el papel de EGFR en el erlotinib o gefitinib inducen la autofagia. Dos siRNAs específicos se utilizaron para derribar la expresión de EGFR. SiRNA 1 podría reducir en gran medida la expresión de EGFR mientras siRNA 2 que tenía efecto moderado sobre la expresión de EGFR (Figura 6A y B). Curiosamente, la autofagia activado por cualquiera de gefitinib o erlotinib no fue inhibida pero aumenta después de la expresión de EGFR se redujo drásticamente por siRNA 1 (figura 6C y D). Por el contrario, siRNA 2 casi no tenía ninguna influencia sobre la autofagia inducida por los receptores EGFR-TKI (Figura 6 C y D).
expresión de EGFR en el A549 (A) o células H1299 (B) transfectadas con siRNA control, EGFR siRNA1 o siRNA2 se determinó mediante Western Blot. LC3 expresión de EGFR-TKI células tratadas A549 (C) o H1299 (D) con o sin EGFR desmontables fueron determinados por Western Blot.
Discusión
La autofagia fue designado como celular programada la muerte de tipo II, mientras que la apoptosis es bien conocido como celular programada tipo muerte I. Sin embargo, recientemente se ha encontrado la autofagia para promover la supervivencia celular en condiciones desfavorables tales como la privación de aminoácidos o ATPs, revelando un nuevo papel de la autofagia en el desarrollo del cáncer.
la autofagia se caracteriza morfológicamente por la aparición de vacuolas "de doble membrana" (autofagosomas) en el citoplasma. Además, el homólogo de mamífero de la proteína de levadura Apg8p, (también llamado LC3), se encuentra que es un marcador bioquímico específico para la autofagia. LC3 recién sintetizado denomina LC3-1 se distribuye uniformemente por todo el citoplasma. Tras la inducción de la autofagia, algunos LC3-I se convierte en LC3-II, que está estrechamente unido a las membranas autophagosomal que forman estructuras en forma de anillo en el citosol. Se confirmó bioquímicamente y morfológicamente que la autofagia puede ser activado por erlotinib o gefitinib, dos bien utilizado EGFR-TKI, en dos líneas celulares de cáncer de pulmón independientes. Curiosamente, un papel muy reciente informó que la autofagia puede ser inducida por anticuerpos anti-EGFR [31]. Ambos anticuerpos EGFR y EGFR-TKI son ampliamente utilizados para el tratamiento de paciente de cáncer mediante la inhibición de EGFR, revelando un nuevo enlace entre la inhibición de EGFR y la activación de la autofagia.
autofagia se puede activar como la respuesta celular a la terapia del cáncer. Un número de la terapéutica del cáncer incluyendo dañan el ADN quimioterapéuticos, terapias endocrinas (por ejemplo, tamoxifeno) y la terapia de radiación se han encontrado para inducir la autofagia in vitro e in vivo [32], [33], [34]. Recientemente, se encontró que la autofagia puede ser activado y protegido células tumorales de terapias dirigidas, tales como el mesilato de imatinib en las células positiva para el cromosoma Filadelfia [18], trastuzumab en cáncer de mama [20], los inhibidores de quinasas de la familia Src en el cáncer de próstata [35 ], los inhibidores del proteasoma en el cáncer de próstata [16]. Consistentemente, se encontró que la autofagia puede ser activado por gefitinib y erlotinib en cáncer de pulmón y promover la supervivencia celular en la terapia de destino con EGFR-TKI. El bloqueo de la autofagia mediante enfoques farmacológicos o genéticos ha mejorado en gran medida el efecto inhibidor del crecimiento de gefitinib o erlotinib. Así, la inhibición de la autofagia tiene el potencial de mejorar la eficacia clínica de EGFR-TKI para el tratamiento del cáncer.
Como sensor de aminoácidos y ATP, mTOR regula negativamente la autofagia. De hecho, encontramos que tanto los ITC puede inhibir la activación de mTOR y su regulador de aguas arriba, PI3K /Akt. Otra vía de señalización importante autofagia es Raf /MAPK vía [23]. Sin embargo, no hemos podido encontrar una correlación clara entre la vía Raf /MAPK y la autofagia en las líneas celulares que usamos. Esto es probablemente debido a mutaciones oncogénicas predominantemente producido en Ras vías /MAPK. Por ejemplo, el gen k-Ras se sabía que estaba mutado en células A549. Clínicamente, los pacientes con mutaciones de K-RAS fallaron en la respuesta al tratamiento TKIs. Sería interesante saber si los pacientes con mutaciones de K-RAS podrían beneficiarse de la combinación de los ITC y los inhibidores de la autofagia.
Curiosamente, nuestros resultados indicaron que erlotinib o gefitinib inducida por la autofagia podría ser EGFR independiente. Como se muestra en la Figura 6, tanto EGFR-TKI podría inducir la autofagia incluso la expresión de EGFR se redujo en gran medida. Aunque gefitinib y erlotinib fueron desarrollados como los inhibidores específicos dirigidos al dominio quinasa de EGFR, sin embargo, resultados recientes acusadas que estos dos inhibidores pueden tener otros objetivos, tales como tirosina quinasas no receptoras que actúa también aguas arriba de PI3K /Akt /mTOR [36]. Consistentemente, los ensayos clínicos a gran escala confirmaron que la medición de la expresión de EGFR mediante inmunohistoquímica no era útil para la recogida de los pacientes que se beneficiaron de la terapia con gefitinib. Ciertamente, todavía no podía excluir por completo la relevancia de EGFR en erlotinib o gefitinib autofagia inducida desde cierta cantidad de EGFR aún se detectó después de la caída de EGFR siRNAs. De hecho, el EGFR-TKI activa autofagia fue mucho más reforzada por siRNA 1, que muestra una mejor eficiencia caída de siRNA 2 (Figura 6B). Por lo tanto, necesitamos más investigaciones para aclarar el papel de EGFR en el gefitinib o erlotinib autofagia inducida. Sin embargo, EGFR-TKI del EGFR siRNA y tuvieron un efecto sinérgico en la inducción de la autofagia, que podría ser inhibida específicamente para aumentar la eficacia clínica de la terapia dirigida.
En resumen, nuestro trabajo refuerza la noción de que las células cancerosas pueden sobrevivir en un ambiente estresante, después de la inhibición de las vías oncogénicas críticos, mediante la inducción de la autofagia. Estas células tumorales están preparados para reanudar la proliferación vez que la concentración de fármaco disminuye después de la retirada del fármaco debido a la toxicidad o mutaciones desarrollar para conferir resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, en combinación de estrategias terapéuticas que tienen como objetivo inhibir la autofagia en pacientes tratados con quimioterapia convencional o novedosa terapia dirigida con EGFR-TKI representa un enfoque prometedor con mayor eficacia para pacientes con cáncer.
Información de Apoyo
Figura S1 .
La cuantificación de la autofagia en las células de cáncer de pulmón tratados con gefitinib. El porcentaje de células con señales de color naranja se calculó contando las células en 3-4 campos bajo el microscopio. Los datos se representan como la media ± SD
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