Extracto
Este estudio es investigar la relación entre ectonucleoside trifosfato diphosphohydrolase (5) ENTPD5 cáncer de pulmón de expresión y los factores clínico-patológicos, y el impacto de ENTPD5 en las funciones celulares de cáncer de pulmón. especímenes de cáncer de pulmón y los tejidos normales adyacentes emparejados se obtuvieron de pacientes sin radioterapia preoperatoria o quimioterapia. Desmontables expresión ETNPD5 condujo a una disminución significativamente la tasa de cáncer de pulmón de células de crecimiento, marcado aumento de la apoptosis y la capacidad de reparar, y redujo significativamente la invasión. pruebas de chip de genes mostraron que desmontables de expresión ENTPD5 causada expresión más caspasa. reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real mostró que la expresión de caspasa 3 aumentó significativamente después de la caída de ENTPD5. Además, la inmunohistoquímica mostró que el marcador de crecimiento del tumor, antígeno nuclear de proliferación celular, se redujo significativamente en el modelo de caída. ensayo de tumorigenicidad y dUTP mediada por transferasa ensayo etiquetado nick-extremo terminal deoxynucleotidyl mostraron que la apoptosis de las células de cáncer de pulmón se incrementó en el modelo de caída. Nuestros resultados sugieren que ENTPD5 afecta apoptosis cáncer de pulmón a través de la caspasa 3 vía, y puede ser utilizado potencialmente para vigilar el pronóstico o para guiar a los regímenes terapéuticos apropiados
Visto:. Xue Y, Wu L, Liu Y, Ma Y, Zhang L, Ma X, et al. (2015) ENTPD5 induce la apoptosis en células de cáncer de pulmón a través de Regulación de la caspasa 3 Expresión. PLoS ONE 10 (3): e0120046. doi: 10.1371 /journal.pone.0120046
Editor Académico: Yi-Hsien Hsieh, Instituto de Bioquímica y Biotecnología, TAIWAN
Recibido: 23 de octubre de 2014; Aceptó 3 de febrero de 2015; Publicado: 20 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Xue et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el plan de Ciencia Beijing nueva estrella (Nº Z11111005450000) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81101598)
Conflicto de intereses.: los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer de pulmón, uno de los tumores malignos más comunes, es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 80% de los casos de cáncer de pulmón [2]. El cáncer de pulmón es considerado como un tipo de enfermedad genética en la que la expresión de genes patógenos endógena aberrante contribuye a la inestabilidad genómica que mejora la motilidad e invasividad de las células cancerosas, lo que lleva a las características de invasividad. A pesar del tratamiento con éxito de la neoplasia primaria, la recaída y la posterior metástasis a distancia todavía ocurrir en más de un cuarto de los pacientes [3] postoperatorias. Por lo tanto, el postoperatorio de seguimiento deben llevarse a cabo de forma rutinaria para buscar metástasis temprana para reducir la mortalidad. De acuerdo con investigaciones recientes, la sobreexpresión de los genes específicos durante la carcinogénesis se ha detectado en varios tipos de cáncer de pulmón, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico [4-6], factor de crecimiento epidérmico humano receptor-2 [7], p53 [8] y de células B linfoma de 2 [9]. La inhibición de la apoptosis de las células tumorales por lo general implica muchos genes importantes, que pueden estar funcionalmente vinculados a la progresión celular canceroso ilimitado como la proliferación, la migración y la invasión. Con el tiempo, las células cancerosas pueden hacer metástasis a órganos distantes y amenazar la vida. Los genes y las proteínas que regulan la agresividad del tumor podría servir como marcadores de pronóstico y /o dianas terapéuticas del cáncer de pulmón. Por lo tanto, es necesario desarrollar de diagnóstico genes /biomarcadores altamente sensibles y específicos para promover la exactitud en el diagnóstico precoz de la metástasis. Por ahora, se ha informado de varios genes para participar en diversos procesos patológicos y significativamente influir en la agresividad de las células cancerosas, tales como ALK [10], relacionados con la calicreína-peptidasa 8 de genes [11], y RAS [12].
Ectonucleoside trifosfato diphosphohydrolase 5 (ENTPD5) es un tipo de enzima en el retículo endoplásmico que hidroliza UDP a UMP para promover la proteína N-glicosilación y plegado en el retículo endoplasmático. ENTPD5 proteína se distingue de otros NTPDases ya que es el único miembro que se describe como una proteína proto-onco [13]. ENTPD5 se informa para promover la proliferación celular y Warburg efecto [13]. La evidencia existente confirma que ENTPD5 participa en varios procesos funcionales celulares y promueve la capacidad de invasión de las células de cáncer de próstata con la ayuda de la proteína quinasa Cδ [14]. Además, se identificó que de resistencia a fármacos del cáncer de próstata durante la quimioterapia basada en platino está relacionado con el estado estable mediada por Cδ proteína quinasa de linfoma de células B-2 [15]. Estudios anteriores también destacan la importancia de ENTPD5 que se asocia con la formación de tumores y la progresión cancerosa de líneas celulares de cáncer de próstata. Estos hallazgos demuestran que la baja regulación de la expresión ENTPD5 influye negativamente en la capacidad de las células tumorales para sobrevivir en condiciones adversas.
Hay una gran cantidad de informes sobre la relación entre ENTPD5 y el crecimiento del tumor maligno, pero casi no es una informar sobre la correlación entre ENTPD5 y cáncer de pulmón. Recientemente, Curry et al. informó que la supresión de ENTPD5 en PTEN modelo animal nula es suficiente para disminuir el factor de crecimiento 1 los niveles de receptores similares a la insulina y para sensibilizar a las células tumorales bronquiolar a la privación de suero
in vitro Hoteles en y para la restricción dietética
in vivo
[16]. Este estudio confirma que ENTPD5 podría estar relacionado con la aparición de cáncer de pulmón en los experimentos con animales.
Teniendo en cuenta la deficiencia de la investigación ENTPD5 en cáncer de pulmón y el importante papel de ENTPD 5 en el proceso de desarrollo de tumores, hemos diseñado este estudio para entender el papel detallado de ENTPD5 en el crecimiento celular del cáncer de pulmón y el proceso de invasión. Además, nos gustaría determinar si ENTPD5 es un objetivo prometedor en la terapia para el cáncer de pulmón.
Materiales y métodos
Células
Todas las líneas celulares de cáncer de pulmón, incluyendo A549, PC9, H1650, H1975, H1299 SKMES-1, y GLC82, fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, EE.UU. ), 100 U /ml de penicilina, y lg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 37 ° C.
Las secuencias de ENTPD5 siRNA y silenciamiento no-siRNA control fueron 5'CCUGGGAUUUGGAUUGAAATT 3 'y 5' UUUCAAUCCAAAUCCCAGGTT 3 ', respectivamente. Los siRNAs fueron generados por Genepharma (Shanghai, China). Los siRNAs fueron transfectadas en células A549 y células PC9 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante.
Los pacientes
especímenes de cáncer de pulmón (n = 131) y se emparejan tejidos normales adyacentes fueron obtenidas de pacientes sin ningún tipo de radioterapia o quimioterapia preoperatoria en el hospital de cáncer de Beijing de 1999 a 2011. consentimiento escrito e informado antes fueron obtenidos de todos los pacientes y sus familias o. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Pekín. características clínico-patológicas de los tumores se definen de acuerdo con el sistema de estadificación metástasis tumoral nodo de la Unión Internacional contra el Cáncer. factores clínico-patológicos se muestran en la Tabla 1.
La inmunohistoquímica
muestras de cáncer pulmonar primaria se fijaron y embebido en parafina. Secciones (5 micras) se procesaron rutinariamente, y tiñeron con un anticuerpo monoclonal de conejo anti-ENTPD5 anticuerpo (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK) a una concentración de 2 g /ml, seguido de la incubación con anti conejo peroxidasa de rábano conjugada -rabbit anticuerpo secundario (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK). áreas de tinción positiva en toda la sección de tejido fueron clasificadas por el porcentaje de células teñidas positivamente: 0, para & lt; 25%; 1, para 25 a 49%; 2, por 50 a 74%; y 3, por 75 a 100%. En este estudio, se consideró 0 negativo o tinción moderada, mientras que 1, 2 y 3 se consideraron tinción positiva.
reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR)
El ARN total se extraído por medio de reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. Para madura cuantificación miRNA, se añadió una cola de poliA de ARN total (100 ng) por polyA de la polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.), seguido de la transcripción inversa con adaptador oligo-dT cebadores y virus de la leucemia murina de Moloney (Invitrogen, ESTADOS UNIDOS). Los ADNc se sintetizaron usando 2 g de ARN total utilizando el kit de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK). Los cebadores para GAPDH ENTPD5 y se enumeran en la Tabla 2. GAPDH se utilizó como control de carga. QRT-PCR se realizó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japón) el Light-Cycler 480 Real-Time PCR System (Roche, EE.UU.). La cantidad relativa de miRNAs o genes se normalizó a GAPDH. Los datos se calculan sobre la base de 2
-ΔCt donde Ct = Ct (Meta) -Ct (Referencia). cambio veces se calculó utilizando el método 2
-ΔΔCt.
Western Blot
Las proteínas se extrajeron de las células utilizando tampón RIPA que contienen completa cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Mannheim, Alemania ). Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon a continuación con 5% de leche sin grasa seca en TBST (15 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% de NaCl, y 0,05% de Tween-20, pH 7,4) seguido por análisis de transferencia utilizando anticuerpos especificados: monoclonal de conejo anti-humana anticuerpo ENTPD5 (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido), y el conejo anti-anticuerpo secundario de conejo (1: 1000). Las bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando SuperSignal West Femto Sustrato quimioluminiscente. Los experimentos se realizaron al menos dos veces con resultados consistentes.
proliferación de las células de ensayo
La proliferación celular se determinó utilizando el recuento de células kit-8 ensayo. Las células (2 × 10
3) se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos. Las células se resuspendieron en medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS, y se dividieron en grupos antes de ser cultivadas durante 0, 24, o 48 h. El número de células viables se determinó midiendo la absorbancia a 450 nm utilizando FLUOstar OPTIMA (BMG LAB-TECH, Offenburg, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Cada experimento se realizó por triplicado
Citometría de flujo
Las células se recogieron y se ensayaron para la apoptosis usando Anexina V-FITC & amp.; PI kit de detección de apoptosis (imgenex, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células se analizaron en el citómetro analizador (Becton-Dickinson, EE.UU.) utilizando el software CellQuest Pro.
Transwell ensayo de invasión
ensayo de invasión Transwell se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 5 × 10
4 células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 0,1% de FBS se sembraron en placas de 24 pocillos que contienen medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS como quimioatrayente. Después de 24 h, las células que migraron a través de y se adhiere al otro lado de la pieza de inserción fueron fijadas y teñidas con 0,5% (w /v) de violeta cristal. células invasoras en la parte inferior de los filtros se obtuvieron imágenes usando microscopía de fluorescencia. Cinco campos de alta potencia se contaron por filtro de anotar para la invasión. El número de células se cuantificó utilizando el software ImageJ.
cicatrización de heridas ensayo
Las células se cultivaron hasta la confluencia en placas de 6 pocillos antes de rayar con una punta de pipeta de 200 l. Los escombros se eliminó por extenso lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las células se incubaron adicionalmente durante otras 24 h o 48 h después de la lesión.
cDNA microarray análisis
El ARN total se extrajo utilizando método de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), purificado con el mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), procesada utilizando una expresión GeneChip 3'-amplificación kit de Reactivos (Affymetrix, EE.UU.), e interrogado con un Affymetrix Human gene Primeview matriz expresión. El ARN se purificó adicionalmente usando RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con la introducción de Affymetrix. Para el análisis de matriz de expresión, se utilizó ARN total (250 ng) para generar marcado con biotina cRNA usando la expresión GeneChip 3'-amplificación Kit Reactivos (Affymetrix, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cRNA se hibridó a Affymetrix Primeview Human Gene gama de expresión y digitalizadas utilizando un array Affymetrix GeneChip 7G 3000 escáner.
tumorigenicidad ensayo
Seis semanas de edad Balb /c atímicos ratones desnudos hembra (Vitalriver los animales de laboratorio, Pekín, china) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho con 2,0 x 10
6 células en 0,1 ml de PBS. Una vez se formaron tumores, se realizaron mediciones diaria de la pinza y el volumen tumoral (V) se calculó utilizando la fórmula V = (L x W
2) /2, donde L es la longitud y W es la anchura del tumor. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 30 a 69 mm
3, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 6) para la inyección intratumoral diaria de ENTPD5-siRNA y control negativo durante 16 días. Para cada inyección, 15 mg miARN se mezclaron con 15 l
in vivo
reactivo de transfección en (Entranster-in vivo, Engreen, China). Las curvas de crecimiento se representaron usando el volumen medio de los tumores dentro de cada grupo experimental en varios puntos de tiempo. Los volúmenes de los tumores de los ratones se registraron durante 16 días, después de lo cual se sacrificaron los ratones. Los tumores diseccionados se recogieron y se prepararon para los análisis posteriores. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Centro de Animales del Hospital de Cáncer de Beijing.
deoxinucleotidil terminal transferasa mediada dUTP nick etiquetado de extremo (TUNEL) ensayo de
deoxinucleotidil terminal transferasa mediada dUTP nick-end se utilizó el etiquetado (TUNEL) kit de ensayo (en la celda de la muerte situ kit de detección, Instituto de Biotecnología Beyotime, china) para evaluar el número de células apoptóticas. Las secciones congeladas se fijaron en 4% de paraformaldehído en PBS pH 7,4 durante 1 h a temperatura ambiente y se permeabilizaron en PBS con 1,0% de Triton X-100 durante 2 minutos. Los extremos rotos de ADN de las células muertas se marcaron utilizando el kit TUNEL siguiendo el protocolo del fabricante.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS versión 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU. ). Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para el análisis de las variables continuas. prueba de chi-cuadrado, se utilizó la prueba exacta de Fisher o de una vía ANOVA para el análisis de las variables categóricas. P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
puntajes ENTPD5 se correlacionan con los géneros, la historia humo y las fases del tumor, con la expresión negativa de ENTPD5 que conduce a mayor tiempo de supervivencia
Para detectar la expresión ENTPD5 en tejidos de cáncer de pulmón, células de cáncer de pulmón se tiñeron para el análisis inmunohistoquímico. Las células de cáncer mostraron una fuerte y difusa tinción citoplásmica de ENTPD5 (Fig. 1A-D). Las puntuaciones altas de ENTPD5 (1-3) en el CPNM se encontraron en 32 casos (24,4%). Entre todos los parámetros disponibles, etapas sexo, antecedentes de humo y tumorales mostraron correlación significativa con las puntuaciones ENTPD5 (P & lt; 0,05) (Tabla 1). El análisis univariante de la incidencia de la condición de la expresión ENTPD5 en el pronóstico mostró que el mayor tiempo de supervivencia fue significativamente correlacionado con la expresión negativa de ENTPD5 (tiempo medio de supervivencia, 81 meses frente a 45,6 meses, P & lt; 0,001). curva de supervivencia de Kaplan-Meier, basado en ENTPD5 puntuación de expresión, demostró que el tiempo de supervivencia acumulada para los pacientes con expresión negativa ENTPD5 (puntuación = 0, n = 96) fue significativamente mayor que en los pacientes con altos niveles de ENTPD5 (puntuaciones = 1- 3, n = 31) (Fig. 1E). Estos datos sugieren que las puntuaciones ENTPD5 se correlacionan con los géneros, la historia humo y las fases del tumor, con la expresión negativa de ENTPD5 que conduce a mayor tiempo de supervivencia.
ENTPD5 tinción de tejidos de cáncer de pulmón con (A) y marcó el 0, (B ) puntuación de 1+, (C) puntuación de 2+, y (D) puntuación de 3+. análisis (E) de Kaplan-Meier de la correlación entre la supervivencia global de los pacientes con cáncer de pulmón y el estado de expresión de la proteína ENTPD5 (P & lt; 0,001).
inhibición de la expresión ENTPD5 reduce el crecimiento de células de cáncer de pulmón y aumenta su tasa de apoptosis
in vitro
Para probar el efecto de ENTPD5 sobre el crecimiento celular del cáncer de pulmón y la apoptosis
in vitro
, se construyó con éxito los modelos celulares de transfección transitoria. Evaluación de ENTPD5 niveles de expresión en diferentes líneas de cáncer de pulmón, incluyendo H1975, H1650, H1299, A549, GLC82, PC9 y SKMES1, mostró que SKMES-1 tenía la expresión ENTPD5 relativo más alto (Fig. 2A). Además, desmontables de ENTPD5 inducida redujo significativamente los niveles de expresión en ENTPD5 PC9 y A549 células (Fig. 2B y C). Además, el ensayo de crecimiento celular en las células PC9 y A549 con una expresión moderada de ENTPD5 mostró que desmontables de ENTPD5 redujo significativamente el crecimiento de células de cáncer de pulmón (Fig 2D y E.) (P & lt; 0,001). análisis de apoptosis en las células PC9 y A549 demostró que desmontables de ENTPD5 aumentó tasa de apoptosis de las células en comparación con los grupos control (P & lt; 0,05) (Fig 2F.). Estos datos indican que la inhibición de la expresión ENTPD5 reduce el crecimiento de células de cáncer de pulmón y el aumento de su tasa de apoptosis
in vitro
.
(A) Expresión de ENTPD5 en diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón. ENTPD5 expresión relativa en las células (B) PC9 y A549 (C) determinados por QRT-PCR y Western Blot. capacidad de crecimiento de la PC9 (D) y las células A549 (E) después de la caída del gen ENTPD5 determinada por ensayo de crecimiento. (F) La apoptosis de PC9 y las células A549 después de la caída del gen ENTPD5 determinada por citometría de flujo. Los datos son medias ± SD. El doble asterisco indican valores que son significativamente diferentes entre sí.
El descenso de regulación de la expresión ENTPD5 disminuye la capacidad de invasión y la motilidad de las células de cáncer de pulmón
in vitro
Para investigar el efecto de ENTPD5 en la invasión de células de cáncer de pulmón y la motilidad
in vitro
, transwell ensayo de invasión de la herida y la curación de ensayo se realizaron. Transwell invasión de ensayo mostró que la baja regulación de la expresión ENTPD5 inhibió significativamente la capacidad de invasión de las células PC9 y A549 (P = 0.000142 y P = 0,00158, respectivamente) (Fig. 3A). Wound ensayo demostró que la curación de las reguladas expresión de ENTPD5 disminuyó drásticamente la movilidad de las células PC9 y A549 de 24 h hasta el final de los experimentos en comparación con células de control (Fig. 3B y C). Estos datos sugieren que la baja regulación de la expresión ENTPD5 disminuye la capacidad de invasión y la motilidad de las células de cáncer de pulmón
in vitro
.
ENTPD5-KD o KD indica la caída de las líneas celulares de cáncer de pulmón. Los datos son medias ± SD. El doble asterisco indican valores que son significativamente diferentes entre sí (P & lt; 0,05). (B) la curación de las células PC9 y A549 de la herida después de la caída del gen ENTPD5 comparación con los modelos de control normal (NC) de tipo salvaje (WT) y al 0, 24 o 48 h. Durante la invasión y de heridas de curación experimentos, se añadió la caspasa 3 para inhibir la apoptosis de las células.
caspasa 3 podría desempeñar un papel importante en la apoptosis de las células de cáncer de pulmón después de la caída de ENTPD5
para comprender los mecanismos de acción de las proteínas relacionadas con la apoptosis de las células de cáncer de pulmón después de la caída de ENTPD5, se realizó un análisis de chips de genes en las células PC9 y A549, que se centró principalmente en las pruebas de la vía de la apoptosis celular. Para las células PC9, desmontables de ENTPD5 aumentó la expresión de algunos genes en más de 1,5 veces en comparación con el control, incluyendo CASP4, APAF1, BCL2L11, CASP7, y BCL2A1. Para las células A549, desmontables de ENTPD5 aumentó la expresión de algunos genes en al menos 2 veces en comparación con el control, incluyendo CASP7, MDM2, y BIRC3 (Fig. 4A). Es de destacar que la caspasa 7 (CASP7), un miembro de la caspasa 3 subgrupos, se observó una elevación significativa expresión después ENTPD5 caída en ambas líneas celulares PC9 y A549 (Fig. 4A). Estos datos sugieren que la caspasa 3 podría desempeñar un papel importante en la apoptosis de células de cáncer de pulmón después de la caída de ENTPD5.
(A) prueba de chip de genes que muestra análisis de la vía que estaba asociado con la apoptosis. Se observó la sobreexpresión del gen de la caspasa en las células PC9 y A549 después de la caída de ENTPD5. (B) Prueba de QRT-PCR que muestra la caspasa 3 expresión en células PC9 y A549 después de la caída de ENTPD5. Los datos son medias ± SD. Los asteriscos indican los valores que son significativamente diferentes del grupo NC (P & lt; 0,05). (C) La apoptosis de las células PC9 y A549 después de la caída de ENTPD5 en presencia de inhibidor de la caspasa 3.
caspasa 3 inhibidor evita el aumento de la tasa de apoptosis de las células de cáncer de pulmón inducida por la caída de ENTPD5
Para confirmar la importancia de la caspasa 3 en la apoptosis de células de cáncer de pulmón después de la caída de ENTPD5, QRT-PCR y citometría de flujo se realizó. Los resultados de QRT-PCR mostraron que la expresión relativa de la caspasa 3 mRNA se incrementó significativamente por la caída de ENTPD5 en ambos PC9 y A549 células (Fig. 4B). Además, la citometría de flujo mostró que ENTPD5 caída no inducir aumento significativo de la tasa de apoptosis en las células PC9 y A549 en presencia de inhibidor Casepase 3 (Fig. 4C). Estos datos indican que inhibidor de la caspasa 3 evita el aumento de la tasa de apoptosis de las células de cáncer de pulmón inducida por la caída de ENTPD5.
Desmontables de ENTPD5 inhibe el crecimiento y promueve la apoptosis de células de cáncer de pulmón
in vivo
Para validar el efecto de ENTPD5 en modelos animales, ensayo de tumorigenicidad, ensayo de transferencia de Western, inmunohistoquímica y ensayo de TUNEL. estado de crecimiento del tumor en ratones inyectados con células A549 mostró que grupo ENTP5-KD de ratones tenían tamaños más pequeños de tumor, menor velocidad de crecimiento del volumen del tumor, y menor peso final del tumor que los de los grupos de WT y NC (Fig. 5A-C). análisis de transferencia de Western de los tejidos tumorales mostró que la expresión de la proteína de antígeno nuclear de proliferación celular y ENTPD5 se redujo, sino la de la caspasa 3 se incrementó en el grupo ENTPD5-KD de los ratones en comparación con los grupos de control (Fig. 5D).
(B) de cambio de volumen del tumor en diferentes grupos de inyecciones de células A549. (C) el cambio de peso del tumor en diferentes grupos. Los datos son medias ± SD. El doble asterisco indican valores que son significativamente diferentes del grupo NC (P & lt; 0,05). (D) antígeno nuclear de proliferación celular, la caspasa 3 y ENTPD5 estado de expresión en diferentes grupos de modelos animales determinada por Western Blot. (E) las pruebas de inmunohistoquímica muestran ENTPD5, caspasa 3 y la proliferación celular estado de la expresión del antígeno nuclear en diferentes grupos de modelos animales. (F) La apoptosis de las células de tejido tumoral en modelos animales después de la caída de ENTPD5 determinó in situ usando ensayo de TUNEL.
El análisis inmunohistoquímico de la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular, y ENTPD5 Casepase 3 estuvo de acuerdo con la los datos obtenidos por transferencia Western (Fig. 5E). Además, el ensayo de TUNEL de tejidos tumorales demostró que los niveles de apoptosis de las células tumorales en el grupo ENTP5-KD de los ratones eran más altos que los del grupo de control (Fig. 5F). Estos datos sugieren que la caída de ENTPD5 inhibe el crecimiento y promueve la apoptosis de las células de cáncer de pulmón
in vivo
.
Discusión
marcadores relacionados con el pronóstico de cáncer de pulmón-juegan un papel importante en muchos procesos, tales como el crecimiento de células tumorales, la apoptosis, la angiogénesis tumoral, y la invasión de células tumorales. En el cáncer de pulmón, la introducción de agentes dirigidos en los pacientes portadores de anomalías genéticas se ha traducido en mejores resultados clínicos con mejor calidad de vida. La inestabilidad genómica o la selección conduce a aberraciones que se pueden agrupar en seis vías esenciales: i) la adquisición de señales autosuficiente, o de crecimiento autónomo; ii) falta de sensibilidad a las señales de inhibición del crecimiento; iii) la resistencia a las señales de apoptosis; iv) potencial de proliferación ilimitada; v) la angiogénesis sostenida; y vi) la invasión y metástasis [17]. Las células cancerosas aberraciones genéticas complejas manifiesto que se producen durante la carcinogénesis de múltiples etapas. Algunas aberraciones moleculares son más propensos que otros para influir en el comportamiento clínico de cáncer, incluyendo el riesgo de metástasis. Tales aberraciones, una vez identificado, potencialmente podrían servir como marcadores de pronóstico, que son características de los tumores que pueden influir y predecir el resultado clínico de pacientes con cáncer.
La sobreexpresión de algunos marcadores, como el factor de crecimiento endotelial vascular [18] , factor de crecimiento epidérmico receptor [4-6], factor de crecimiento epidérmico humano receptor-2 [7], p53 [8] y el linfoma-2 de células B de correlación [9], se ha demostrado con un mal pronóstico. En este estudio, el análisis de inmunohistoquímica confirmó la sobreexpresión específica de proteína ENTPD5 en tejidos de cáncer de pulmón. Otras investigaciones sobre la supervivencia general sugieren que el aumento de expresión de ENTPD5 se asocia con peor pronóstico. Estas observaciones ponen de manifiesto el potencial de ENTPD5 como indicador pronóstico.
ENTPD5 se identifica como un componente clave en el /fosfatidilinositol 3-quinasa /fosfatasa y homólogo de tensina bucle de regulación de Akt, capaz de sinergizar la glucólisis aeróbica [19,20 ]. Algunos investigadores muestran que la sobreexpresión de ENTPD5 afecta el crecimiento de muchos tumores, tales como gliomablastoma [20], cáncer de mama [21], cáncer de cuello uterino [22], tumor testicular de células germinales [23], y de laringe neoplasia [24]. Tumorigénesis es un proceso de múltiples etapas que implica el crecimiento celular, invasión, metástasis y angiogénesis. Investigación del efecto de ENTPD5 en el proceso de la progresión celular muestra que la baja expresión de ENTPD5 en líneas celulares A549 y PC9 disminuye significativamente los grados de proliferación celular, la apoptosis y la migración. En conjunto, estos datos indican que ENTPD5 podría actuar como un oncogén jugar papeles importantes en la regulación de diversos procesos celulares que promueven la progresión neoplásica en múltiples niveles. Sin embargo, los mecanismos por los cuales ENTPD5 ejerce sus efectos en las vías de señalización específicas necesitan más estudios.
Células
NSCLC son resistentes a la apoptosis. Las estrategias para des-reprimir los inhibidores de caspasas endógenas en el CPNM sugieren una actividad prometedora en sistemas modelo y presentar una estrategia racional y completamente novedoso para mejorar el tratamiento del cáncer de pulmón. La apoptosis está orquestada por la activación secuencial de las caspasas, una familia de cisteína proteasas con especificidad para residuos de ácido aspártico. Dos vías pueden mediar la apoptosis: i) la muerte receptores vía (factor de necrosis tumoral, ligando Fas o receptores de TRAIL) que activa la caspasa 8 y 10, y ii) la vía mitocondrial que activa la caspasa 9. Ambas vías conducir a caspasas efectoras 3, 6 y 7 [25]. Nuestra investigación ha confirmado la relación entre ENTPD5 y caspasa 3 en experimentos con animales y nivel celular. La comprensión de las bases moleculares de este fenotipo es crítica, si la terapia es ir más allá de la meseta terapéutica que se ha alcanzado con la quimioterapia convencional. Caspasa 3 de expresión puede estar asociada con proceso sensible de la quimioterapia o la radiación [26]. MacCarthy et al. informó de que la expresión anormal de ENTPD5 en células de carcinoma colorrectal humano podría influir en los niveles de ATP y la resistencia al oxaliplatino, un agente quimioterapéutico para el cáncer relevante colorrectal [27]. Villar et al. También se encuentra la relación entre ENTPD 5 y respuesta a la quimioterapia en el cáncer de próstata 15]. Parece que la expresión ENTPD5 no sólo puede ser un poderoso reportero para el cambio metabólico en las células tumorales, pero también un posible predictor para las respuestas de quimioterapia tumor. Este estudio encontró que ENTPD5 inhibe la apoptosis de las células de cáncer de pulmón a través de la caspasa 3. Sin embargo, la relación entre el efecto de la quimioterapia y ENTPD5 necesita más investigación en el futuro. En conclusión, el gen ENTPD5 es crucial en NSCLC. Podría ser utilizado potencialmente para vigilar el pronóstico o para guiar a los regímenes terapéuticos apropiados.
Reconocimientos
Este trabajo fue apoyado por el Plan de Ciencia Beijing nueva estrella (Nº Z11111005450000) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81101598).