Extracto
Antecedentes
La sobreexpresión del factor de transcripción ERG debido a la genómica
ERG
-rearrangements define un subtipo molecular por separado de los tumores de próstata. Una de las consecuencias de la acumulación de ERG es la modulación de perfil de expresión génica de la célula. Tudor proteína 1 gen (
TDRD1
) se informó que se expresó diferencialmente entre el dominio que contienen
TMPRSS2: ERG
-negativo y
TMPRSS2: ERG
cáncer de próstata -positivo. El objetivo de nuestro estudio era proporcionar una explicación mecanicista de la activación transcripcional de
TDRD1
en los tumores de próstata de reordenamiento positivo ERG.
Metodología /Principales conclusiones
mediciones de expresión génica por PCR en tiempo real cuantitativo reveló un notable co-expresión de
TDRD1
y
ERG gratis (r
2 = 0,77), pero no
ETV1 gratis (r
2 & lt; 0,01) en el cáncer de próstata humano
in vivo
. el análisis de metilación del ADN por MeDIP-Sec y la secuenciación de bisulfito mostró que
TDRD1
expresión se correlaciona inversamente con la metilación del ADN en el
TDRD1
promotor
in vitro
y
in vivo gratis (ρ = -0.57). En consecuencia, la desmetilación de la
TDRD1
promotor en
TMPRSS2: ERG
células de cáncer de próstata negativos-metiltransferasa de ADN traducido en
TDRD1
inducción. Mediante la manipulación de
ERG
de dosificación a través de silenciamiento de genes y la expresión forzada mostramos que gobierna ERG pérdida de metilación del ADN en el
TDRD1
isla CpG promotor asociado, lo que lleva a
TDRD1
sobreexpresión.
Conclusiones /Importancia
se demuestra que la ERG es capaz de interrumpir un patrón de metilación del ADN específico de tejido en el
TDRD1
promotor. Como resultado,
TDRD1
se convierte en transcripcionalmente activa en
TMPRSS2: ERG
cáncer de próstata -positivo. Dada la prevalencia de fusiones ERG,
TDRD1
sobreexpresión es una alteración común en el cáncer de próstata humano que pueden ser explotados para procedimientos diagnósticos o terapéuticos
Visto:. Kacprzyk LA, Laible M, Andrasiuk T, Brase JC, Bornø ST, Fälth M, et al. (2013)
ERG
induce la activación epigenética del entramado contiene el dominio de la proteína 1 (
TDRD1
) en el cáncer de próstata
ERG
Reordenamiento-positiva. PLoS ONE 8 (3): e59976. doi: 10.1371 /journal.pone.0059976
Editor: Bandana Chatterjee, de la Universidad de Texas Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: Septiembre 4, 2012; Aceptado: 19 Febrero 2013; Publicado: 29 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Kacprzyk et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal alemán de Educación e Investigación (http://www.bmbf.de/en/) en el marco del Programa de Médico de Investigación del Genoma (NGFNplus; IG-cáncer de próstata, y 01GS0890 01GS0891; IG-Mutanom , 01GS08107; Modificador intestinal, 01GS08111), así como la Escuela Internacional de Posgrado de Helmholtz para la Investigación del cáncer de la DKFZ ((www.dkfz.de/phd/)). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aproximadamente la mitad de los casos de cáncer de próstata humanos identificados por puerto reordenamientos genómicos de PSA de detección en el que los elementos reguladores sensibles a andrógenos se yuxtaponen a los genes que codifican para factores de transcripción de la familia ETS [1] - [3]. Como resultado, los genes ETS convierten acoplado al receptor de andrógenos (AR) de señalización y se sobreexpresa en los tumores de próstata de fusión-positivas [4] - [6]. El más común de estos reordenamientos genómicos, el
TMPRSS2
:
ERG
fusión de genes, conduce a una fuerte sobreexpresión del factor de transcripción ERG, que es lo contrario ausente en las células del epitelio de próstata [7] ; en condiciones fisiológicas
ERG
muestra un patrón de expresión restringido de tejido y se transcribe en el linaje hematopoyético [8] y las células endoteliales [9]. La cuestión de cómo la acumulación ERG influye en la biología de las células de cáncer de próstata
in vitro
y
in vivo
ha ganado un interés significativo. Hasta ahora, los ERG se sugirió para modular el fenotipo de las células de cáncer de próstata en una amplia gama de procesos, incluyendo: la interrupción de AR de señalización [10], la activación de c-myc de señalización [11] y la red de los receptores de estrógenos [12], la activación de la vía Wnt y la inducción de la transición epitelio-mesenquimal [13], la promoción de la invasión de células [14], la interacción física con PARP1 [15] y la activación de TGF-β /BMP de señalización [16]. También se encontraron tumores que albergan la fusión ERG ser enriquecido por la pérdida de la
PTEN
supresor de tumores [17], [18]. En consecuencia, en modelos de ratón de cáncer de próstata ERG se muestra a cooperar con la vía PI3K para conducir la carcinogénesis [19], [20]. También se encontró acumulación de ERG a estar asociada con un patrón alterado de metilación del ADN en células de cáncer de próstata [10], [21], [22]. Análisis del transcriptoma cáncer de próstata realizado por nosotros y otros demostró que los tumores que alberga el
TMPRSS2
:
ERG
acción de fusión de un perfil de expresión génica única que difiere significativamente de los perfiles de tejido benigno de la próstata y los tumores malignos carecen de la fusión [1], [10], [12], [13], [16], [23]. Específicamente, los tumores que sobreexpresan ERG se caracterizan por la modulación de la transcripción de genes implicados en las vías Wnt y TGF-β /BMP [16], la red de β-estradiol [12], [23] y ruta de NF-kappa B [24].
entre los genes desregulados en
ERG
cáncer de próstata -rearranged, al menos dos estudios independientes identificados Tudor dominio que contienen proteínas-1 (
TDRD1)
como el gen más diferencialmente expresados entre los
ERG
cáncer de próstata reordenamiento-positivos y negativos, además de
ERG
en sí [16], [23]. De manera similar a
ERG
,
TDRD1
¿no transcritas en el epitelio normal de la próstata [25], [26].
TDRD1
se ha identificado inicialmente como un antígeno de cáncer /testículo, es decir, un gen que se expresa en los testículos y el cáncer, pero en silencio en tejidos somáticos adultos [26]. Su ortólogo de ratón,
Tdrd1
, se expresa durante la espermatogénesis, donde actúa en la vía piRNA conservada para reprimir la actividad de retrotransposones LINE1 por metilación [27]. Un estudio reciente sugiere que en el pez cebra Tdrd1 actúa como un andamio molecular de las proteínas Piwi, piRNAs y metas Pirna [28]. En el ratón y el pez cebra, Tdrd1 se requiere para un funcionamiento correcto de la vía piRNA y
Tdrd1
nocaut en los resultados de un ratón en la espermatogénesis defectuosa [28], [29].
En este sentido, informe que
ERG
y
TDRD1 ¿Cuáles son co-expresada en cánceres de próstata humanos y se proporciona una explicación mecanicista de la co-expresión observada. Se demuestra que la ERG activa
TDRD1
la transcripción mediante la inducción de la pérdida de metilación del ADN en el
TDRD1
isla CpG promotor asociado. Proponemos que esta consecuencia epigenética de los
TMPRSS2: ERG.
Fusión representa un nuevo mecanismo que puede explicar parte de la modulación transcripcional inducida por ERG en el cáncer de próstata humano
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
muestras de tejido de la próstata se obtuvieron del Centro Médico de la Universidad de Hamburgo Eppendorf. Aprobación para el estudio se obtuvo del comité de ética local y todos los pacientes de acuerdo a la toma de muestras de tejido adicional para fines científicos.
Las muestras de tejido de próstata, de todo el genoma de perfiles de expresión y análisis de metilación
Los detalles de humanos colección de muestras, la extracción de RNA, la conversión a ADNc y de perfiles de expresión de todo el genoma se describen en otra parte [16]. extracción de ADN y análisis de metilación de todo el genoma por MeDIP-Seq se describen en otra parte [22]. Los datos de los perfiles de expresión de todo el genoma y el análisis de metilación de todo el genoma están disponibles al público en la base de datos Gene Expression Omnibus (números de acceso GSE29079 y GSE35342).
TMPRSS2: ERG
estado de fusión se determinó mediante PCR utilizando los cebadores descritos anteriormente [30] y por qPCR [16]. Las muestras, para los cuales estaban disponibles tanto la expresión como la metilación del ADN ARNm de datos, se incluyeron en el análisis.
Cell Cultura y
VCAP, NCI-H660, LNCaP, DU145, PC-3, y RWPE -1 células se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). células de HPB-1 eran una especie de regalo de Doris Mayer (DKFZ, Heidelberg). K-562 y KG-1 células fueron proporcionados por Christoph Plass y Peter Krammer, respectivamente (DKFZ, Heidelberg). células MOLT4 y CMK se obtuvieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania). células VCAP se mantuvieron en medio DMEM (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% FBS (Gibco). células NCI-H660 se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 5% FBS (Gibco), 2 mM L-gluatmine, 0,005 mg /ml de insulina, 0,01 mg /ml de transferrina, 30 selenito de sodio nM, 10 nM de hidrocortisona y 10 nM beta-estradiol (todos de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). LNCaP y DU145 se mantuvieron en RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% FBS. las células PC-3 se cultivaron en medio F12-K (ATCC) suplementado con 10% FBS. células RWPE1 se cultivaron en medio libre de suero de queratinocitos suplementado con 0,05 mg /extracto pituary bovina ml y 5 ng /ml de EGF recombinante (Gibco). células BPH1 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco) suplementado con FBS 10% y 20 ng /mL 5α-dihidrotestosterona (Sigma). K-562 y las células MOLT-4 se cultivaron en RPMI-1640 y se suplementó con inactivado por calor 10% de FBS, KG-1 y las células CMK se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con 20% FBS inactivado por calor.
Generación de clones estables LNCaP y la inducción de expresión transgénica
ERG secuencia de codificación (exones 4-11 de NM_004449.3), que corresponde a TMPRSS2: ERG fusión T1 /E4 [31], se amplificó a partir NM_004449. 3 que contiene el plásmido (Genómica y Proteómica, DKFZ) mediante PCR utilizando los cebadores: GCAGGCTCCACCATGACCGCGTCCTCCTCCAG adelante, atrás CAAGAAAGCTGGGTCTTAGTAGTAAGTGCCCAGAT. clones LNCaP transfectadas de manera estable se generaron como se describe anteriormente [32]. La expresión del transgen se indujo con 50 ml de doxiciclina /ng (Sigma).
Extracción de ARN y transcripción inversa
ARN total fue aislado de crecimiento exponencial líneas celulares utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania ) siguiendo las instrucciones del fabricante. síntesis de ADNc se performend usando superíndice III transcriptasa (Life Technologies) y cebadores oligo-dT (Sigma-Aldrich) siguiendo las instrucciones del fabricante inversa. Para la medición de LINE1-ORF2 ARNm, ARN total se trató con Turbo DNasa (Life Technologies) para eliminar la contaminación de ADN genómico. DNasa trata a continuación el ARN se purificó usando RNeasy Kit de Limpieza MinElute (Qiagen) y se sometió a transcripción inversa usando RevertAid H Minus Kit Primera Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Burlington, Canadá) y cebadores hexámeros aleatorios.
cuantitativa RT- PCR
niveles de expresión génica se midieron en el sistema LightCycler 480 real-Time PCR (Roche, Mannheim, Alemania). cDNA equivalente a 10 ng de ARN total fue utilizado por pocillo. Todas las mediciones se realizaron por triplicado. ensayos TaqMan (Applied Biosystems) se realizaron con absoluta 2x QPCR Mix (Abgene, Thermo Fischer, Epsom, Reino Unido). Biblioteca universal Probe (UPL) ensayos del sistema (Roche) se realizaron utilizando 480 Sondas Master (Roche). valores Cp primas se calcularon por el software de Roche LightCycler 480 usando el segundo método de máxima derivada. Los ensayos y las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1 junto con los números de las figuras correspondientes. Los niveles de expresión se presentan como valores absolutos (Cp) o como expresión relativa a un gen de referencia interna (utilizando ΔCp método).
Western Blotting
células exponencial de crecimiento se lisaron con tampón RIPA (50 mM pH 8 Tris-HCl, NaCl 150 mM, 1% desoxicolato de sodio NP-40, 0,5%, 0,1% SDS) suplementado con EDTA 5 mM y detener inhibidor de la proteasa Cocktail (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Las concentraciones de proteína se determinaron con el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce). A menos que se indique lo contrario, 30 g de proteína lisados fueron separados en geles al 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y se sondearon con los anticuerpos listados en la Tabla S1. Se detectaron señales utilizando la solución de sustrato ECL [33] y se registran con Fusión-SL 3500 WL sistema de adquisición de imágenes (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Francia).
Gene siRNA mediada por silenciamiento
Todos los siRNAs utilizados en el estudio fueron sintetizados por Dharmacon (Thermo Fisher Scientific, Epsom, Reino Unido) y se resuspendieron en el tampón de siRNA 1x (Dharmacon). A menos que se indique lo contrario, las células se sembraron un día antes de la transfección en la confluencia de 50-70%. siRNA transfección se realizó utilizando Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. complejos de transfección se prepararon en medio OptiMEM exento de suero (Gibco) y se añaden a un medio de crecimiento completo en 20:80 v /v proporción. Las concentraciones finales de siRNAs fueron 50 nM (piscina no director siRNA, ERG siRNA) o 25 nM (TDRD1 siRNAs). Todo siRNA utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla S1.
CpG Island Definición y bisulfito de secuenciación de ADN
TDRD1
-promoter isla CpG asociada se define de acuerdo con el valor por defecto criterios proporcionados por la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/). ADN genómico fue extraído de las células utilizando QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Sodio conversión de bisulfito del ADN se realizó con el Kit de bisulfito EpiTect (Qiagen) usando 1 g de ADN genómico. El fragmento de ADN de 525 pb que contiene el CpG-isla asociado-promotor TDRD1 se amplificó con ADN polimerasa de HotStarTaq (Qiagen) usando los cebadores listados en la Tabla S1. El producto de PCR se clonó en el vector pCR2.1 usando el kit de clonación TOPO TA (Life Technologies). TOP10 células químicamente competentes (Life Technologies) se transformaron con el producto de ligación. Después de la selección azul-blanco, los plásmidos de las colonias que contienen el inserto se sometieron a secuenciación de Sanger (GATC, Konstanz, Alemania). secuenciación Sanger prima lecturas fueron analizados para eventos de metilación utilizando la herramienta en línea BISMA [34].
5-aza-2'- desoxicitidina Tratamiento
células LNCaP o VCAP fueron sembradas en poli-L- lisina (Sigma-Aldrich) recubierto placas de 12 pocillos a baja densidad. A partir del día siguiente, las células se trataron con vehículo (0,1% DMSO, Applichem, Darmstadt, Alemania) o las concentraciones indicadas de 5-aza-2 'desoxicitidina (Sigma-Aldrich) durante cinco días consecutivos. Cada 24 h, el medio de cultivo se reemplazó con un medio recién preparado que contenía 5-aza-2 'desoxicitidina o vehículo.
viabilidad celular Ensayo
Para el ensayo de viabilidad, 2.5x10
4 células VCAP se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo negro (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) en 80μl del medio de crecimiento normal. Después de 24 h, las células fueron transfectadas con siRNAs como se describe arriba y el día de hoy se conocen como "día 1". La viabilidad celular se evaluó con la célula CellTiter-Blue Viabilidad de ensayo (Promega Corporation, WI, EE.UU.) en los días 1, 3, 5, 7 y 9 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se registró con lector de placas Tecan Infinito M200 (Tecan Group Ltd, Männedorf, Suiza).
Análisis estadístico Los datos
Todos los datos fueron analizados utilizando GraphPad Prism 5.04. Los datos cuantitativos se muestran como la media ± SEM (error estándar de la media) calculada a partir de todos los experimentos realizados, a menos que se indique lo contrario. Todas las comparaciones entre los grupos experimentales se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney-Wilcoxon con la corrección de Bonferroni (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, **** P & lt; 0,0001). Spearman (
ρ
) y Pearson (r) coeficientes de correlación se calcularon con GraphPad Prism 5.04.
Resultados
TDRD1
es co-expresada con
ERG
pero no con
ETV1 Hoteles en cáncer de próstata humano
Nuestra expresión anterior estudio de perfiles de muestras de cáncer de próstata humano reveló que
TDRD1
es decir, aparte de
ERG
, el gen más diferencialmente expresados entre los
TMPRSS2
:
ERG
-negativo y tumores -positivos [16]. por tanto, se realizó un análisis de correlación en los datos de las muestras de tejido de la próstata 93 (46 benigna, 30
TMPRSS2: ERG
-negativo, 17
TMPRSS2: ERG
-positivas tumores de próstata) y se encontró que el ARNm niveles de
ERG
y
TDRD1
medida por Human exón 1,0 ST matriz están correlacionados notablemente en todas las muestras (r
2 = 0,84), lo que sugiere una relación mecánica entre los dos genes. Por el contrario,
TDRD1
no fue co-expresada con
ETV1 gratis (r
2 = 0,05), que es un factor de transcripción ETS encontrado para ser reorganizado de forma esporádica en el cáncer de próstata. Para corroborar estas observaciones, hemos medido
TDRD1
,
ERG
y
ETV1
niveles de mRNA con RT-PCR cuantitativa en el mismo conjunto de muestras. Una vez más,
fue encontrado TDRD1
expresión se correlaciona con
ERG gratis (r
2 = 0,77), pero no con
ETV1 gratis (r
2 & lt; 0,01 ) expresión (Fig. 1a). Para proporcionar una validación independiente de nuestros resultados, nos preguntó la base de datos Oncomine [35] usando "TDRD1" y "cáncer de próstata" como términos de búsqueda. El análisis de dos estudios identificados apoya nuestras observaciones: en los datos de Grasso et al. [36]
ERG
fue el más elevado de genes expresados co con
TDRD1
. En los datos de Taylor et al. [17],
fue encontrado TDRD1
a ser co expresado con
ERG gratis (r
2 = 0,55), pero no con
ETV1 gratis (r
2 = 0.02) a través de 149 tumores de próstata primarios. Para explicar la co-expresión observada, se emplearon modelos celulares de cáncer de próstata, incluyendo las células que representan benigna (RWPE-1, BPH-1), la fusión-negativo (PC-3, DU145),
ERG
-rearranged (VCAP, NCI-H660) y el cáncer de próstata
ETV1
-rearranged (LNCaP). mediciones de la expresión génica en líneas celulares de próstata mostraron que mientras que
TDRD1
niveles de mRNA fueron independientes de
, existe ETV1
expresión de una asociación evidente entre
TDRD1
y
ERG
expresión
in vitro gratis (Fig. 1b). Ninguna de las líneas celulares sin
ERG
sobreexpresión expresó
TDRD1
, mientras que las líneas de células NCI-H660 y VCAP, los cuales albergan el
TMPRSS2: ERG sobre Fusion, expresaron altos niveles de
TDRD1 gratis (Fig. 1b). Luego preguntamos si los altos niveles de
TDRD1
y
ERG
ARN mensajero en células de la próstata ERG-positivas traducirse en considerables cantidades de las respectivas proteínas y encontró que las células expresan VCAP ERG y en TDRD1 niveles detectables por Western Blot (Fig. 1c). Sobre la base de estos resultados iniciales, se decidió utilizar células VCAP como un
in vitro
modelo para estudiar la relación mecanicista entre la
ERG
y
TDRD1
genes en
ERG -
reorganizado el cáncer de próstata
(a) análisis de correlación de los niveles de mRNA medidos mediante qRT-PCR en
TMPRSS2: ERG
-negativo (ERG-, n = 30) y
TMPRSS2: cánceres -positivo ERG
(ERG +, n = 17) de la próstata, así como tejido de la próstata benigna adyacente (n = 46). se muestra el coeficiente de correlación de Pearson. (B) Análisis de la expresión de ARNm en las líneas celulares de próstata por QRT-PCR. Dos experimentos independientes se realizaron por triplicado. RNA testículo humano se utilizó como control positivo para
TDRD1
expresión. (C) Análisis de expresión de proteínas en líneas celulares de próstata por Western Blot. (D) Análisis de la expresión de ARNm en las líneas celulares de cáncer hematopoyético de QRT-PCR. Dos experimentos independientes se realizaron por triplicado.
TDRD1
no está co-expresada con
ERG Hoteles en cánceres hematopoyéticos
Algunos cánceres hematopoyéticos sobreexpresan proteína ERG [37], [38] y se sabe que mieloide, T y leucemias Bcell dependen de ERG para su mantenimiento [39], [40]. Así se investigó
ERG
y
TDRD1
co-expresión de QRT-PCR en un panel de líneas celulares que representan diversos cánceres hematopoyéticos. Aunque se detectaron altos niveles de
ERG
mRNA en varias líneas celulares de cáncer derivadas del linaje hematopoyético, la expresión correspondiente de
TDRD1
mRNA fue de aproximadamente 50 veces menor que en las células VCAP (Fig. 1d). Para extender nuestro análisis más allá de las líneas celulares, se compararon
ERG
y
TDRD1
expresión de mRNA en tejidos de la próstata y en la leucemia mieloide aguda citogenética anormal (CA-AML) medido por la misma plataforma (Human exón 1.0 ST array) [41]. En contraste con lo observado en el cáncer de próstata (r
2 = 0,84),
ERG
y
TDRD1
no fueron co-expresada en el documento CA-ALD (r
2 = 0,07 ).
ERG
También se ha informado de que se sobreexpresa en sarcomas de Ewing [42] - [45]. por tanto, analizamos la expresión de genes disponibles estudios de perfiles de tumores sarcoma de Ewing para
TDRD1
y
ERG
expresión [46], [47]. En contraste con el cáncer de próstata, no había co-expresión de
ERG
y
TDRD1 Hoteles en cualquiera de estos estudios (r
2 = 0,03 y 0,02, respectivamente). Esto sugiere que la co-expresión de
ERG
y
TDRD1
es específico para el cáncer de próstata.
ERG factor de transcripción se requiere para mantener un alto
TDRD1
expresión en
TMPRSS2: ERG
células positivas
Co-expresión de dos genes pueden ser explicados por, entre otros, la regulación de uno de los genes de la otra o por su regulación mutua en una alimentación directa bucle. Para probar estas posibilidades, hemos empobrecido ya sea ERG o proteína en las células TDRD1 VCAP por la interferencia de ARN y se determinó el ARNm y proteínas de expresión de ambos genes. El silenciamiento de
ERG
con una eficiencia del 80% dio como resultado la regulación por disminución de 3,9 veces de
TDRD1
ARNm 72 h después de la transfección (P & lt;. 0,0001, Figura 2a). Por el contrario, el silenciamiento de
TDRD1
no dio lugar a ningún cambio en la expresión de ARNm
ERG
. El análisis de los correspondientes niveles de proteína por transferencia Western reveló que el silenciamiento de
ERG
y
TDRD1
genes fue muy eficaz, dando lugar a un agotamiento completo de ambas proteínas de las células (Fig. 2b). Mientras desmontables de
ERG
causó una profunda regulación a la baja de la proteína TDRD1 a las 72 h, no se detectaron tales efectos sobre el ERG después de silenciamiento del gen
TDRD1
. Un patrón de expresión similar se observó también a las 48 h después de la transfección (datos no mostrados). En conclusión, se requiere una presencia constante de ERG para mantener una alta expresión de
TDRD1
en células VCAP y la co-expresión observada de los dos genes en los tumores de próstata podría explicarse por una activación unidireccional de
TDRD1
a través del factor de transcripción ERG.
(A)
ERG
y
TDRD1
los niveles de expresión de ARNm en células VCAP midió 72 h después de silenciamiento génico con siRNAs. Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado. (B) expresión de la proteína ERG y TDRD1 en las células VCAP 72 h después de silenciamiento génico con siRNAs
TDRD1
Promotor asociada CpG Island es hypomethylated en
TMPRSS2:. ERG
-positivas tumores de próstata
la expresión de
TDRD1
, junto con la de otros genes específicos de la línea germinal, se sabe que está reprimida en tejidos somáticos por silenciamiento epigenético [26], [48 ]. Por ello, investigó el estado de metilación de la
TDRD1
promotor y la isla CpG asociada en el contexto de
ERG
reordenamientos. Se inspeccionaron metilación del ADN en todo el
TDRD1
sitio de inicio de transcripción en los tumores de próstata, que habíamos analizado por MeDIP-Sec [22], y encontramos esta región para ser metilado diferencialmente entre los tumores con y sin el
TMPRSS2: ERG
fusión de genes. En concreto, la región 1 kb que abarca el
TDRD1
isla CpG promotor asociado se hypomethylated significativamente en el
TMPRSS2: ERG
tumores benignos en comparación con -positivas y
TMPRSS2: ERG
tumores negativos al (P & lt;. 0,0001, Fig 3A). Una ventana 500 pb inmediatamente aguas abajo de la isla CpG no mostró diferencias en la metilación del ADN entre los tumores ERG-negativos y ERG-positivos (p = 0,41, Fig. 3a). Por otra parte, la secuencia de ADN que flanquea el putativo
TDRD1
promotor no fue metilado diferencialmente entre cualquiera de los tres grupos (P & gt; 0,05), lo que indica que la metilación del ADN diferencial se produce en la proximidad directa de la
TDRD1
inicio transcripcional sitio, pero no alrededor de ella. Es de destacar que el nivel medio de
TDRD1
metilación del promotor se correlacionó inversamente con los niveles
TDRD1
de ARNm en todas las 93 muestras (
ρ
= -0.57), lo que sugiere que la pérdida de metilación del promotor contribuye sustancialmente a
TDRD1
sobreexpresión en
TMPRSS2:. ERG sobre fusion positivos de cáncer de próstata (Fig. 3b)
(a) Análisis de
TDRD1
metilación del promotor de tumores de próstata por MeDIP-Seq. Los valores representan el grado medio de la metilación del ADN de los contenedores de 500 pb. (B) Análisis de correlación de
TDRD1
la metilación del promotor y
TDRD1
la expresión del ARNm en el cáncer de próstata. Se indica el coeficiente de correlación de Spearman.
inducida por ERG La pérdida de la represión epigenética en el
TDRD1
promotor es un importante mecanismo de
TDRD1
activación
Desde la región diferencialmente metilado se extendió por la isla CpG asociada con el
TDRD1
promotor y CpG islas se sabe que juegan un papel en la regulación de la transcripción [49], hemos realizado la secuenciación de bisulfito de la
TDRD1
-asociado isla CpG en líneas celulares de próstata. Se encontró que la isla CpG era totalmente metilado en células benignas y líneas celulares de cáncer de ERG-negativas, con una metilación medio que varía de 89,3% para LNCaP a 98,6% para PC-3 (Fig. 4a). Por el contrario, la metilación CpG estaba casi completamente ausente en el
TMPRSS2: ERG
líneas de células positivas a NCI-H660 y VCAP (11,4% y 0,7%, respectivamente). La comparación de los niveles de
TDRD1
mRNA (Fig. 1b) a la metilación del ADN de la isla CpG en el
TDRD1
promotor (Fig. 4a) reveló una correlación inversa entre los dos parámetros a través de la líneas celulares investigadas, que estaba de acuerdo con los datos correspondientes de los tumores de próstata. Dadas las grandes diferencias en la metilación del ADN en el
TDRD1
promotor entre el ERG-reorganizado y líneas celulares restante, la hipótesis de que la pérdida de metilación del ADN en el
TDRD1
promotor es el principal mecanismo responsable de
TDRD1
activación. Para probar esta posibilidad, se trataron las células LNCaP ERG-negativas con el ADN metiltransferasa inhibidor de la 5-aza-desoxicitidina (decitabina; [50]). Después de cinco días de tratamiento con concentraciones submicromolares de decitabina se observó un aumento dependiente de la dosis en la expresión de
GSTP1
gen que se sabe que ser silenciado por metilación en las células LNCaP [51] (Fig. 4b). En particular,
TDRD1
ARNm se reguló por más de 25 veces. En consecuencia, tras el aumento de
TDRD1
niveles de ARNm, la proteína TDRD1 resultaron detectables en las células LNCaP por inmunotransferencia (Fig. 4b, inserto), lo que indica que la pérdida de metilación del ADN puede de hecho ser suficiente para impulsar
TDRD1
análisis de la expresión.
(a) la metilación del ADN de la em> TDRD1
isla CpG
ERG
. Dos experimentos independientes se realizaron por triplicado. Insertar: análisis de la expresión del ERG a las 48 h en LNCaP clones mediante Western Blot. (D) la secuenciación de bisulfito de la
TDRD1
isla CpG promotor asociado en las células LNCaP 48 h después de la inducción de la expresión del ERG con doxiciclina. (E) secuenciación de bisulfito de la
TDRD1
promotor asociado isla CpG 96 h después de silenciar
ERG Hoteles en células VCAP. Los datos mostrados en (D) y (E) son la media de metilación% de toda la isla CpG calculada a partir de los 11-12 clones secuenciados.
Para comprobar si ERG puede imitar los efectos ejercidos sobre
TDRD1
expresión por desmetilación del genoma LNCaP, hemos generado células LNCaP estables que sobreexpresan la secuencia de codificación de la
TMPRSS2: ERG
fusión T1 /E4 de una manera inducible. La inducción de la
ERG
expresión con doxiciclina dado lugar a un aumento de casi 5 veces en la
TDRD1
ARNm, mientras que la doxiciclina no tuvo influencia en
TDRD1
expresión en el clon que lleva el LNCaP vector de expresión vacío (Fig. 4c). Hemos utilizado la secuenciación de bisulfito para analizar el estado de metilación del ADN correspondiente de la
TDRD1
isla CpG promotor asociado a la inducción ERG. ERG sobreexpresión llevó a la hipometilación del
TDRD1
región promotora en el 27% de los alelos investigados, mientras que no se observó ninguna hipometilación tras el tratamiento doxiciclina en el control de vector vacío (Fig. 4d, Fig. S1a). Dado que el experimento inverso, es decir, el agotamiento del ERG en las células VCAP por RNAi, ha llevado a la regulación a la baja de la expresión TDRD1 (Fig. 2) también hemos realizado la secuenciación de bisulfito de la
TDRD1
isla CpG después de ERG silenciamiento en VCAP Células. En 96 h después de la transfección, silenciando de ERG con eficiencia 65% dio como resultado aumento de casi 3 veces en la metilación media de ADN en la isla CpG, desde 15,7% de CpG metilados en control no la orientación a 45% en las células tratadas con siRNA dirigidos
ERG gratis (Fig. 4e, Fig. S1b).
las observaciones mencionadas anteriormente demuestran que el estado de metilación del ADN de la
TDRD1
promotor y por lo tanto su actividad transcripcional están unidos mecánicamente a los niveles de factor de transcripción ERG en las células del cáncer de próstata.
papel diferencial de
TDRD1 Hoteles en los testículos y el cáncer de próstata
La vía evolutiva conservada piRNA juega un papel importante en el sexo masculino de la línea germinal durante la espermatogénesis [52] - [54]. Los componentes de la vía de acto piRNA para suprimir la actividad de los elementos transponibles, potencialmente con el fin de mantener la integridad de los cromosomas de la línea germinal durante la desmetilación de todo el genoma en células germinales primordiales [55] - [57]. Los estudios realizados en el ratón y pez cebra han demostrado que Tdrd1, ortólogo humano de
TDRD1
, es un componente de la vía piRNA que interactúa específicamente con proteínas asociadas a piRNA para potenciar el silenciamiento mediado por piRNA de retrotransposones LINE1. Por consiguiente, se demostró la pérdida de Tdrd1 en ratón para resultar en LINE1 desrepresión [27], [58]. En los seres humanos, existen cuatro ortólogos codifican proteínas asociadas a piRNA:
PIWIL1 CD -
PIWIL4
[59]. [17].