Extracto
Antecedentes
ETS factores de transcripción regulan importantes vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y el desarrollo en muchos tejidos y se han convertido en actores importantes en el cáncer de próstata. Sin embargo, el impacto biológico de los factores de ETS en la tumorigénesis de próstata sigue siendo objeto de debate.
Metodología /Principales conclusiones
Se realizó un análisis de la familia de genes ETS a partir de datos de microarrays y PCR en tiempo real en condiciones normales y los tejidos tumorales junto con los estudios funcionales en líneas celulares de cáncer y normales para entender el impacto en la tumorigénesis de próstata e identificar los objetivos clave de estos factores de transcripción. Encontramos desregulación frecuente de los genes ETS con oncogénico (es decir, ERG y ESE1) y supresor de tumor (es decir, ESE3) propiedades en los tumores de próstata en comparación con la próstata normal. subgrupos tumorales (es decir, ERG
altos ESE1
altos, ESE3
bajos y NoETS tumores,) se identificaron sobre la base de su estado de expresión de ETS y mostraron transcripcional distinta y características biológicas. ERG
altas y ESE3
tumores de bajo tenían las más sólidas firmas genéticas con las dos características distintas y superpuestas. La integración de datos genómicos con estudios funcionales en múltiples líneas celulares, hemos demostrado que ERG y ESE3 controlados en opuesta dirección de transcripción de la proteína del grupo Polycomb EZH2, un gen clave en el desarrollo, la diferenciación, la biología de células madre y la tumorigénesis. Además, demostró que la Nkx3.1 gen supresor tumoral prostático específico fue controlado por ERG y ESE3 tanto directamente como a través de la inducción de la EZH2.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la papel de la red de la transcripción ETS en la tumorigénesis de próstata y descubrir los vínculos no reconocidos previamente entre la expresión aberrante de factores de ETS, la desregulación de los efectores y epigenéticos silenciamiento de genes supresores de tumores. El vínculo entre la actividad aberrante de ETS y el silenciamiento epigenético de genes puede ser relevante para el manejo clínico de cáncer de próstata y el diseño de nuevas estrategias terapéuticas
Visto:. Kunderfranco P, M Mello-Grand, Cangemi R, S Pellini, Mensah A, Albertini V, et al. (2010) La transcripción ETS Factores de control de la transcripción de la EZH2 y epigenéticos silenciamiento del gen supresor de tumor Nkx3.1 en el cáncer de próstata. PLoS ONE 5 (5): e10547. doi: 10.1371 /journal.pone.0010547
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Noviembre 2009; Aceptado: April 12, 2010; Publicado: 10 de mayo de 2010
Derechos de Autor © 2010 Kunderfranco et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Oncosuisse (OCS-01913-08), la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (FNS-31003A-118113) y la Fundación de Investigación del cáncer Ticino al GMC. MGM y CG fueron apoyados por Compañía de San Pablo, Torino, Italia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en los países occidentales [1]. El cáncer de próstata tiene un comportamiento clínico muy heterogéneo y poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares que contribuyen a esta heterogeneidad [1]. Recientemente, los factores ETS de transcripción se han convertido en elementos importantes en la tumorigénesis de próstata debido al hallazgo de translocaciones recurrentes que implican genes ETS, siendo la más frecuente la TMPRSS2: fusión de genes omnes que conduce a la sobre-expresión de larga duración ERG [2], [3] , [4]. Sin embargo, el impacto biológico de los genes translocados ETS está siendo objeto de debate. Informes recientes sugieren que el ERG sobre-expresión no es suficiente para inducir la transformación neoplásica y la cooperación con otras vías oncogénicas, tales como la pérdida de PTEN y PI3K desregulación /AKT, es necesario [5], [6], [7], [8], [9]. La familia ETS humano incluye 27 miembros que comparten un dominio de unión a ADN altamente conservado y son puntos nodales de diversas vías de señalización que controlan la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia [10]. Aunque existe una gran posibilidad de superposición, los factores individuales ETS tienen características distintas que se manifiestan a través de la regulación positiva y negativa de los diferentes subconjuntos de genes y procesos biológicos [10]. Por otra parte, en muchos tejidos ETS constituyen factores de redes reguladoras complejas con respuestas celulares específicas dependiendo del equilibrio entre los factores con funciones similares u opuestas [10]. La mayoría de los factores de ETS, como los translocado en el cáncer de próstata, promover la proliferación celular, la supervivencia y la transformación, mientras que otros actúan como supresores de tumores [10]. Recientemente, hemos encontrado que el factor de ETS-epitelial específico ESE3 era frecuentemente el regulado en cáncer de próstata, la proliferación celular y la supervivencia afectado negativamente, y actuó como supresor de tumor en las células epiteliales de la próstata [11]. Por lo tanto, para entender el impacto global de ETS desregulación de genes en la tumorigénesis e identificar objetivos clave de factores ETS desregulados, sería importante tener en cuenta todo el conjunto de genes ETS expresados en un tejido determinado.
En este estudio, a través de un análisis exhaustivo de la familia de genes ETS en los tejidos normales y tumorales prostáticas, hemos identificado subgrupos de tumores con patrones de expresión ETS distintas. Además de los objetivos del ETS ya conocidos, descubrimos genes previamente no reconocidos y las vías vinculados a la actividad aberrante ETS. Mediante la integración de datos genómicos con estudios funcionales, se estableció que el grupo Polycomb (PcG) proteína EZH2 es un objetivo directo del ERG y ESE3, y un actor clave en el silenciamiento transcripcional del supresor de tumores prostático específico Nkx3.1 gen. Tomados en conjunto, nuestros datos revelan alteraciones más frecuentes y complejos de genes ETS que se había reconocido e identificar genes clave como EZH2 y Nkx3.1 contribuir a la reprogramación del transcriptoma de células epiteliales de próstata en respuesta a la expresión aberrante de factores supresores tumorales y ETS oncogénicos. Estos hallazgos pueden ser relevantes para la gestión clínica para el cáncer de próstata y el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.
Resultados
ETS Definir patrones de expresión génica del cáncer de próstata Subgrupos
Para obtener una amplia Habida cuenta de la red ETS transcripcional en el cáncer de próstata, se analizó la expresión de la familia de genes ETS en los microarrays de datos de cáncer de próstata primario (
n = 59
) y próstata normal (
n = 14
) muestras clínicas. El análisis de datos de microarrays demostró que varios genes ETS fueron expresados diferencialmente en muestras de tumores de próstata en comparación con los normales. RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) se utilizó para confirmar la expresión diferencial de los factores ETS más frecuentemente alterados (Fig. S1). Los genes ETS más afectadas significativamente fueron ERG, y el ESE3-epitelial específica factor-1 de ETS (ESE1 /ELF3 /ESX). Anteriormente puso de manifiesto que ESE3, que se expresa en las células normales de la próstata, la proliferación del epitelio afectado negativamente y supervivencia de células de cáncer de próstata y propusimos que actuó como un supresor tumoral [11]. ESE1, que está estrechamente relacionado con ESE3, se expresa en células epiteliales normales de diversos órganos, incluyendo la próstata, de mama y de pulmón y se sabe que actúa como un oncogén cuando sobre-expresado en las células epiteliales de mama [12], [13]. Sin embargo, no se ha informado antes de la regulación de ESE1 en los tumores de próstata. En general, la expresión desregulada de los genes ETS era muy frecuente en los tumores de próstata. De hecho, la mayoría de los tumores tenían al menos un gen ETS regulada hacia arriba o hacia abajo en comparación con la próstata normal y con frecuencia múltiples ETS se vieron afectados de forma simultánea.
Nuestro objetivo era entender cómo estas alteraciones ETS individuales y compuestos podrían afectar la biología del cáncer de próstata. Utilizando datos QRT-PCR de la expresión de genes ETS y los datos genómicos se evaluó si los perfiles de transcripción específicos se asociaron con los patrones de expresión ETS distintas. Utilizamos varios criterios para minimizar los posibles efectos de confusión de la presencia de múltiples factores de ETS. En primer lugar, se utilizaron los datos de QRT-PCR para clasificar con precisión los tumores en función de su estado de expresión de genes ETS. Entonces, sólo los tumores con muy alta o muy baja expresión de un ETS dado (es decir, ≥4 veces mayor o menor que el valor medio en la próstata normal) fueron asignados a un grupo y se incluyen en el análisis. Utilizando estos criterios de aproximadamente 80% de los cánceres de próstata tenía expresión altamente desregulada de al menos un gen ETS predominante. Sobre estas bases, se identificaron tres principales subgrupos de tumores caracterizados por la desregulación predominante de un factor de ETS: i) los tumores con elevada expresión ERG (ERG
alta,
n = 14
), ii) los tumores con alta ESE-1 de expresión (ESE1
alta,
n = 12
) y iii) los tumores con baja expresión ESE3 (ESE3
bajo,
n = 13
). Un cuarto grupo (NoETS,
n = 14
) incluye tumores que tenían niveles normales, como de todos los genes ETS (Fig. 1A). Ocho tumores con ≥4 veces sobre-expresión de cualquiera de ETV1, ETV4, ETS2 o ETS1 se excluyeron del análisis debido a su escaso número. ESE1 fue altamente expresado en 26 de los (44%) tumores de próstata 59, pero sólo en el 12, que fueron incluidos en el ESE1
grupo de alta expresión, que era la única ETS sobreexpresado. ESE3 era el regulado ≥4 veces en 27 de los (46%) tumores de próstata, pero sólo en 59 de los 13 casos, que se incluyeron en el ESE3
baja grupo que expresa, que era la única ETS desregulado. Se aplicó un enfoque similar al de un conjunto de datos de microarrays a disposición del público a partir de un estudio independiente [14] para obtener una distribución similar de los tumores de próstata en cuatro subgrupos principales (Fig. S2). Curiosamente, en nuestra serie 6 y 8 de los 14 ERG
tumores de alto había mal regulada de forma concomitante expresión de ESE3 y ESE1, respectivamente (fig. 1A). Del mismo modo, en el conjunto de datos pública los 15 ERG
altos tumores habían mal regulada de forma concomitante expresión de ESE3 y ESE1 (Fig. S2A). Por lo tanto, ERG sobreexpresión podía coexistir claramente con la expresión desregulada de estos otros factores ETS. En nuestra serie de tumores, 11 de los 14 ERG
tumores de alto (79%) fueron positivos para el TMPRSS2: transcripción de fusión omnes evaluada por el punto final de RT-PCR (Figura S3 A.). Los otros ERG sobre-expresión de los tumores tenían probablemente otros tipos de transcripciones de fusión no detectados por el ensayo. Siete tumores tenían niveles muy bajos de TMPRSS2: omnes transcripción por punto final de RT-PCR, expresión normal-como del ERG por QRT-PCR y no se incluyeron en el ERG
grupo alto. Ninguna de las 8 muestras normales y de las 11 muestras de hiperplasia benigna de próstata (HBP) examinados tenían evidencia de la TMPRSS2: omnes transcripción (Fig. S3 A). Los parámetros clínicos y patológicos de los cuatro subgrupos de tumores se muestran en la Fig. S3 B. No hubo asociación estadísticamente significativa entre los subgrupos de ETS y ninguno de los parámetros clínicos /patológicos evaluados.
A. La expresión de ERG, ESE1 y ESE3 determinado por QRT-PCR en los tumores de próstata y de próstata normales. Los tumores se agrupan de acuerdo con el factor de ETS expresa predominantemente. B. Análisis de componentes principales. Los puntos representan muestras individuales con su ubicación determinada por los componentes principales del transcriptoma. C. Número de genes expresados diferencialmente con Q≤0.1 en cada subgrupo ETS. DELAWARE. Diagramas de Venn que muestra compartida y distintos genes expresados diferencialmente entre los subgrupos tumorales indicadas.
Programas transcripcional en el cáncer de próstata Subgrupos
Se utilizó el Análisis de Componentes Principales (PCA) para evaluar el grado global de las similitud o divergencia de la transcriptomes individuales de muestras normales y cancerosas de la próstata. Como se muestra en la Fig. 1B, los tumores que pertenecen a diferentes subgrupos formados parcialmente grupos distintos que sugieren que la divergencia en los programas transcripcionales dependía al menos en parte en sus ETS patrones de expresión génica. ERG
altas y ESE3
tumores de bajo fueron los más distantes de la próstata normal y en gran medida distinta de los otros subgrupos. A continuación, se compararon los perfiles de transcripción de los subgrupos tumorales con el de próstata normal utilizando la Expresión Génica Análisis de Perfil Suite (GEPAS) [15] para identificar características comunes y distintas y extraer firmas de genes ETS-específicos. El número de genes expresados diferencialmente (Q≤0.1) en cada subgrupo se muestra en la Fig. 1C y las listas de genes se muestran en la Tabla S1. ERG
tumores de bajo altas y ESE3
tenían las más sólidas firmas genéticas con el mayor número de genes expresados diferencialmente en relación con la próstata normal, mientras que el número de genes expresados diferencialmente fue considerablemente menor en ESE1
alto y tumores NoETS .
a continuación, cruzó las listas de genes expresados diferencialmente en relación con la próstata normal para determinar el grado de coincidencia y divergencia entre los subgrupos de tumores (Fig. 1D-e). En particular, ERG
altas y ESE3
tumores de bajo comparten muchos genes expresados diferencialmente con un gran solapamiento entre ambos genes regulados hasta regulados y hacia abajo, lo que indica que la expresión alterada de ERG y ESE3 tuvo efectos parcialmente similares. Por otra parte, ERG
altas y ESE3
tumores de bajo tenían un gran número de características distintivas con respecto a n ETS (Fig. 1D) y los tumores ESE1
alta (Fig. 1E). Estas diferencias en el gen conjunto solapamiento fueron estadísticamente significativas (P & lt; 0,0001, prueba exacta de Fisher). Los genes modulados tanto en ERG
alta y ESE3
tumores de bajo pero no en los otros subgrupos de tumores, identificadas a través de una de 3 vías (Fig. 1D) y de 4 vías diagramas (Fig. S4) de Venn, se enumeran en la Tabla S2.
para entender las implicaciones funcionales de las diferencias entre los subgrupos de tumores que utilizamos MetaCore, un paquete de software para el análisis funcional integrada de los datos de expresión de genes [16]. MetaCore permitió mapear características comunes, similares y únicos entre los subgrupos tumorales y definir afectadas comúnmente diferencialmente y vías de ontología de genes. Como se muestra en la Fig. 2A, hubo muchas características comunes y similares entre los subgrupos de tumores. Por otro lado, ERG
altas y ESE3
tumores de bajo tenían el mayor número de características únicas. La parte superior afectada comúnmente mapas de ruta GeneGo (GGPM), que se muestra en la Fig. 2B, incluido
respuesta inmune, la remodelación del citoesqueleto, desarrollo, ciclo celular
y
regulación transcripcional
. Pueden representar genes y las vías comúnmente activados en tumores en comparación con el tejido normal. Los GGPMs diferencialmente afectados fueron predominantemente o exclusivamente enriquecidos en ERG
alto y ESE3
tumores de bajo (Fig. 2C). La parte superior diferencialmente afectados GGMPs incluido
adhesión celular mediada por integrina
,
citoesqueleto remodelación
,
adhesión celular ECM remodelación
y
adhesión celular quimiocinas
, lo que sugiere que la activación de estas vías, relacionados con la migración celular y la invasión, podría ser características predominantes de estos tumores. Curiosamente, estos datos implicados también que la pérdida ESE3 tuvieron consecuencias muy similares a ERG sobre-expresión en el programa transcripcional de los tumores de próstata.
A. Serie de características únicas, similares y comunes entre los genes expresados diferencialmente en comparación con el normal de la próstata en el ERG
alta, ESE3
Bajo, ESE1
altas y NoETS tumores según MetaCore. B. comúnmente afectados GeneGo Pathway Mapas en los subgrupos de tumores. C. diversamente afectados GeneGo Pathway Mapas en ERG
alta, ESE3
baja, ESE1
altas y NoETS tumores.
ERG regula al alza la expresión EZH2 en los tumores de próstata
evaluación integral de la expresión génica ETS y los datos genómicos mostró robustos y se superponen parcialmente firmas genéticas en los ERG
altas y ESE3
tumores bajas con muchos genes activados y reprimidos. A continuación, se realizaron búsquedas ERG
altas y ESE3
firmas bajos para los genes que pudieran actuar como nodos principales que median los efectos de estos factores ETS expresadas aberrantemente en el transcriptoma del cáncer de próstata. EZH2 se encontraba entre los 169 hasta los genes regulados tanto en ERG
ESE3
bajos tumores genes (Fig. S4 y el cuadro S2), mientras que no fue mayor en los otros subgrupos de tumores de alto y. EZH2 también se correlacionó positivamente con el ERG y una correlación negativa con ESE3 en un análisis de correlación de todo el conjunto de datos de microarrays (Tabla S3). EZH2 es una lisina de la histona H3 27 (H3K27) metiltransferasa y un elemento clave en el silenciamiento epigenético de genes [17], [18]. H3K27 metilación de las histonas es una marca que crea un punto de anclaje para la contratación de factores de remodelación de la cromatina adicionales inducir un estado represivo cromatina [17]. Por lo tanto, la inducción de la EZH2 asociado con el aumento y la pérdida de ERG ESE3 podría contribuir a la amplia firma represivo observado en estos tumores (Fig. 1C). EZH2 ha demostrado ser hasta reguladas en los cánceres de próstata en comparación con el normal de la próstata con niveles particularmente altos en alto grado y tumores metastásicos [19]. Sin embargo, algunos factores han sido identificados que podrían aumentar la expresión de EZH2 en los tumores de próstata [20], [21], [22], [23]. Se encontró que la EZH2 fue significativamente hasta reguladas en ERG
altos tumores en comparación con la próstata normal y los tumores NoETS (Fig. 3A), lo que indica que puede haber una relación directa entre la expresión EZH2 y ERG que no se había reconocido antes. En consonancia con este hallazgo, EZH2 fue significativamente mayor en ERG
alto en comparación con los tumores NoETS (Q & lt; 0,0001). También en un conjunto de datos independientes (Fig. 3B)
A. expresión EZH2 en muestras de tejido. Microarray datos se presentan como log2 ratios en comparación con la referencia. B. Expresión EZH2 en NoETS y ERG
tumores de alto en la Wallace et al. conjunto de datos de microarrays. C. expresión EZH2 en las células LNCaP y 22Rv1 transfectadas transitoriamente con vacío (
ev
) o expresión ERG (
Erg
) del vector determinado por RT-PCR (
izquierda) y Western blot (
derecha). D. EZH2 nivel de control y ERG-que expresan las células estables 22Rv1 y LNCaP determinados por RT-PCR (
superior) y Western blot (
parte inferior). E. nivel EZH2 en las células transfectadas transitoriamente con VCAP control y ERG-específica (siERG) siRNA determinada por RT-PCR (
izquierda) y Western blot (
derecha). F. chip en las líneas celulares indicadas con anticuerpos ERG y qPCR con conjuntos de cebadores que abarcan la EBS en el promotor EZH2. Positivo (promotor MMP3) y controles negativos (ETS2) se muestran en la Fig. S6A-B y 7A, respectivamente. Las muestras de tejido de ERG G
tumores de alto y se sometieron a NoETS chip con anticuerpo anti-ERG y analizados por qPCR. ETS2 se utilizó como control negativo (Fig. S7B). *, P & lt; 0,01; **, P & lt;.
0,0001
A continuación, se investigó la relación funcional entre ERG y EZH2 y la posibilidad de la regulación directa de la EZH2 por ERG en las células de cáncer de próstata, en el que experimentalmente arriba y abajo -regulated ERG. En estos experimentos se sobre-expresado en células ERG ERG-translocación negativos 22Rv1 y LNCaP de cáncer de próstata que no expresan endógeno ERG. Tras la transfección, las células LNCaP y 22Rv1 expresaron ERG a niveles similares a TMPRSS2: células positivas VCAP ERG de translocación (Fig. S5A). En paralelo, knock-down de ERG se realizó en células VCAP utilizando un siRNA ERG. El nivel de ERG ARN y proteínas se redujo significativamente en las células transfectadas siRNA en comparación con las células control VCAP (Fig. S5B). Para validar estos modelos celulares, hemos examinado la expresión de los genes, como MMP 3, PLA-1 y CRISP3, que estaban en la parte superior de la lista de genes regulados hasta en ERG
tumores de alto y había sido previamente demostrado ser controlado por ERG en otros sistemas celulares [6]. La expresión de estos genes se incrementó a ERG sobre-expresión en 22Rv1 y LNCaP células (Fig. S5C) y la disminución en ERG ronda en células VCAP (Fig. S5D). Estos resultados demostraron la idoneidad de nuestros modelos celulares para investigar los posibles genes diana ERG, junto con el valor predictivo de los genes de las firmas que deriva de muestras clínicas de cáncer de próstata.
Tanto expresión transitoria y estable de ERG en el ERG-negativas células LNCaP y 22Rv1 conducido a un aumento de nivel de EZH2 (Fig. 3C-D). Por otra parte, EZH2 ARNm y proteínas se redujeron en siRNA mediada por knock-down de ERG en las células VCAP (Fig. 3E). Los cambios en la expresión EZH2 observados tras la regulación hacia arriba y abajo del ERG sugirieron la posibilidad de regulación directa por ERG. Se identificaron ETS putativo sitios (EBSS) dentro de 1 kb de la EZH2 TSS por análisis computacional y experimentos chip realizadas de unión para determinar si ERG era capaz de unirse a estos sitios (Fig. 3F). La unión de ERG al promotor EZH2 se observó en células VCAP positivo ERG de translocación y en las células LNCaP y 22Rv1 sobre la expresión estable de ERG, mientras que no se observó en la unión no ERG expresar LNCaP parentales y células 22Rv1 (Fig. 3F). Del mismo modo, ERG estaba obligado al gen MMP3, un objetivo ERG conocido usado aquí como control positivo, sólo en los clones que expresan ERG y en células VCAP (Fig. S6a). No unión de ERG se observó al promotor ETS2, que se utilizó como control negativo (Fig. S7A). La región del promotor ETS2 evaluada por chip incluye el sitio de inicio de la transcripción y ambos ARN polimerasa II y Sp1 se había demostrado que se unen a esta región en gel de cambio y ensayos de chip ([24] y los datos no se muestra). Tomados en conjunto, estos datos apoyan la conclusión de que ERG actuó como un activador transcripcional de EZH2 mediante la unión a su promotor. Por último, para demostrar que esta interacción se produjo también en muestras de tumores clínicos hemos realizado chip para evaluar la unión de ERG al promotor EZH2 en ERG
muestras de alta y NoETS (Fig. 3G). ERG se asoció con el promotor EZH2 en ERG
tumores de alto, mientras que estuvo ausente en los tumores NoETS, consistente con la hipótesis de que controla la transcripción de este gen. La especificidad se demostró por la ausencia de unión de ERG al promotor ETS2 en las muestras tumorales (Fig. S7B).
ERG reprime Nkx3.1 en los tumores de próstata a través de EZH2 y la histona H3K27 metilación
Además de los genes regulados hasta, el transcriptoma del ERG
tumores de alto incluyó numerosos genes cuya expresión se redujo significativamente en comparación con el normal de la próstata, lo que sugiere que estos genes podrían ser reprimidos, ya sea directa o indirectamente por ERG. La lista de las reguladas por los genes en el ERG
tumores de alto incluyen muchos genes relevantes que podrían tener un impacto significativo sobre la biología del cáncer de próstata. Entre los genes con funciones conocidas supresores de tumores, nos centramos en Nkx3.1, que se vio afectada de manera similar en ERG
alto y ESE3
tumores bajos. Nkx3.1 es un gen homeobox específico de la próstata y un factor de transcripción que tiene funciones críticas en el desarrollo de la próstata y la supresión de tumores [25]. La pérdida de expresión Nkx3.1 es un evento frecuente en la tumorigénesis de próstata y se ha atribuido a diversos mecanismos, incluyendo la pérdida alélica, la metilación y silenciamiento post-transcripcional [25], [26], [27], [28]. Se encontró que el nivel de Nkx3.1 se redujo significativamente en ERG
tumores de alto en comparación con los tumores de próstata y NoETS normales (Fig. 4A). Para determinar si Nkx3.1 baja regulación fue funcionalmente ligado a ERG sobre-expresión, se analizó el nivel de Nkx3.1 en células de cáncer de próstata en la modulación de la ERG. ERG knock-down en células VCAP resultó en el aumento de expresión Nkx3.1 en el nivel de ARNm y proteína (Fig. 4B). Por otro lado, el nivel de Nkx3.1 se redujo por la expresión estable de ERG en LNCaP negativo ERG y 22Rv1 células, proporcionando una prueba de control de la expresión Nkx3.1 por ERG (Fig. 4B). Dado que los factores ETS pueden actuar como activadores o represores de la transcripción, dependiendo del contexto del promotor [10], [29], se realizaron búsquedas en el promotor Nkx3.1 para su posible EBS que podrían mediada ERG vinculante. Análisis computacional mostró la presencia de un EBS putativo en el promotor de Nkx3.1. ensayos de chip mostraron unión del ERG a esta región del promotor en las células VCAP (Fig. 4C). ERG ocupado el promotor Nkx3.1 también en células LNCaP y 22Rv1 sobre expresión ERG estable y de forma concomitante a la silenciamiento del gen (Fig. 4C). Por lo tanto, la unión de ERG al promotor Nkx3.1 se asoció con la represión transcripcional del gen. Hemos observado ocupación promotor Nkx3.1 por ERG también en muestras de tumores clínicos mediante la realización de chip en ERG
altas y NoETS tumores. ERG estaba obligado al promotor Nkx3.1 en ERG
tumores altos, en consonancia con la hipótesis de que controla negativamente la transcripción del gen en este subgrupo de tumores (Fig. 4D).
A. Nkx3.1 expresión en muestras de tejidos normales y tumorales. B. Nivel Nkx3.1 en las células LNCaP transfectadas transitoriamente con vacío (
ev
) o expresión ERG (
Erg
) del vector determinado por Western blot (panel superior), nivel Nkx3.1 en VCAP células transfectadas transitoriamente con siERG y control de siRNA determinada por RT-PCR y Western blot (panel central), el nivel de Nkx3.1 en el control y ERG células que expresan 22Rv1 y LNCaP estables analizados por RT-PCR y Western blot (panel inferior). C. La unión del ERG al promotor Nkx3.1 determinado por chip y qPCR en líneas celulares indicadas. Los controles negativos se muestran en la Fig. S7A. Las muestras de tejido de D. ERG
alto y NoETS tumor se sometieron a chip con anticuerpo anti-ERG y analizados por qPCR. Los controles negativos se muestran en la Fig. S7B. E. VCAP, parental (control) y ERG expresar (ERG 18) células LNCaP transfectadas con EZH2 específico (siEZH2) y ARNsi de control y se analizaron por RT-PCR. F. chip con un anticuerpo para H3K27 metilado y qPCR con conjuntos de cebadores que abarca el EBS (
panel superior
) y un potenciador de respuesta de andrógenos (ARE) (
panel inferior
) en el Nkx3.1 gene. ETS2 se utilizó como control negativo (Fig. S8A). la actividad del promotor G. Nkx3.1 en las células LNCaP transfectadas con el reportero de promotor Nkx3.1 humana junto con los vectores de expresión indicados. reportero de la actividad luciferasa se midió después de 24 h. nivel de la proteína H. Nkx3.1 en las células LNCaP transfectadas transitoriamente con vacío - vector de expresión o bien ERG (Perg) o EZH2 (pEZH2) determinada por Western blot (). I. Nkx3.1 metilación del promotor se evaluó mediante secuenciación de ADN tratado con bisulfito. círculos vacíos y llenos representan los sitios CpG no metilados y metilados, respectivamente. *, P & lt; 0,01; **, P. & Lt; 0,001
Para determinar si la inducción de la EZH2 por ERG podría contribuir al silenciamiento de Nkx3.1, hemos derribado EZH2 en las células que expresan ERG. siRNA mediada por knock-down de EZH2 en células VCAP aumento de la expresión de Nkx3.1, consistente con la hipótesis de que el gen estaba bajo el control de EZH2 en estas células (Fig. 4E). Además, EZH2 knock-down en ERG que expresan clones LNCaP parcialmente restaurada expresión Nkx3.1 a un nivel similar al de las células LNCaP parentales (Fig. 4E). Para demostrar aún más el papel de la EZH2, determinamos de chip si el promotor Nkx3.1 adquirió la H3K27 metilación marca característica de la actividad de EZH2 en las células en las que se reprime el gen. Se observó el aumento de metilación H3K27 en la región que rodea el EBS, que indentified en el promotor, y en el nivel de un potenciador sensibles a los andrógenos (ARE), que es un sitio regulador importante en el gen Nkx3.1 [30] en ERG- células VCAP positivos de translocación (Fig. 4F). Un enriquecimiento similar de H3K27 metilación también se observó en las células LNCaP y 22Rv1 con expresión estable de ERG (Fig. 4F). Por lo tanto, Nkx3.1 adquirió una marca característica de la actividad represiva EZH2 de una manera dependiente del ERG. Tomados en conjunto, estos datos establecen que Nkx3.1 era un objetivo de ambos ERG y EZH2. ERG reprimida Nkx3.1 directamente mediante la unión a su promotor e indirectamente a través de la inducción de la EZH2 y H3K27 metilación. los ensayos de reportero de luciferasa y experimentos de transfección transitoria apoyaron esta hipótesis. la actividad del promotor Nkx3.1 y el nivel de proteínas se redujeron tras la expresión transitoria del ERG en las células LNCaP (Fig. 4G-H). En contraste, la transfección transitoria de EZH2 solo no tuvo ningún efecto sobre la actividad del promotor de Nkx3.1 en el ensayo de reportero o nivel de proteína Nkx3.1 (Fig. 4G-H), lo que indica que EZH2 requiere ERG y de expresión estable para silenciar Nkx3.1. Estos resultados son por lo tanto compatible con la capacidad de los factores de ETS para actuar activador alternativamente como la transcripción y represor [10], [29] y con la hipótesis de que los factores de transcripción pueden influir en el reclutamiento de efectores epigenéticos como EZH2 a promotores de genes [31].
Adquisición de marcas de histona represivas, como H3K27 metilación, es sólo uno de los múltiples mecanismos que contribuyen al silenciamiento de los genes supresores de tumores en las células del cáncer [18]. El promotor del gen de Nkx3.1 contiene una isla CpG y el gen ha sido informado de que se silenciada por CpG promotor de la metilación en los tumores de próstata [26]. Por lo tanto, determinamos si la metilación del ADN también estuvo implicado en el silenciamiento inducido por Nkx3.1 ERG. secuenciación de bisulfito mostró la ausencia de metilación de CpG en el promotor de Nkx3.1 en las células ERG-translocación positivos VCAP y ERG que expresan y las células que no expresan LNCaP (Fig. 4I). En contraste, el promotor Nkx3.1 fue metilado en células de cáncer de próstata PC3 negativo ERG-translocación que no expresan Nkx3.1 (Fig. 4E), indicando que en estas células Nkx3.1 fue silenciada por CpG metilación del promotor. Por lo tanto, inducida por ERG silenciamiento Nkx3.1 se basó principalmente en la EZH2 y fue independiente de la metilación del promotor, en consonancia con la reactivación de la expresión de Nkx3.1 sobre EZH2 knock-down.
ESE-3 reprime EZH2 y activa Nkx3.1 transcripción
El transcriptoma del ERG
tumores de alto y ESE3
bajos comparte muchos genes en común. Esto sugirió que ERG y ESE3 podrían afectar a la transcripción de muchos genes en direcciones opuestas y que ERG regulación y ESE3 baja regulación podría resultado en efectos parcialmente similares en el transcriptoma cáncer de próstata. Como se ve en ERG
tumores de alto, EZH2 fue significativamente mayor en ESE3
tumores de bajo en comparación con los tumores de próstata y NoETS normales (Fig. 5A). La relación inversa entre el nivel de expresión y ESE3 EZH2 también fue visto en un conjunto de datos de microarrays independiente (Q & lt; 0,0004) [14] (Figura 5B;. S2D). Estas observaciones sugirieron que podría regular negativamente ESE3 EZH2 en la próstata y la pérdida de ESE3 podría dar lugar a una mayor expresión EZH2 en los tumores de próstata. Para probar esta hipótesis, se generaron clones de células LNCaP (ESE3-
kd
) en el que de forma estable derribado ESE3 usando shRNA constructos. Estos clones tenían niveles significativamente más bajos de ESE3 comparación con las células LNCaP parentales, que expresan niveles detectables de ESE3 (Fig. S5E). De acuerdo con nuestra hipótesis, ESE3-
kd
células LNCaP tuvieron mayor expresión de EZH2 que las células parentales (Fig. 5C). Para determinar si ESE3 controla la expresión de la EZH2 también en células epiteliales normales de la próstata que de forma estable knock-down ESE3 en las células inmortalizadas LHS [32], lo que hemos mostrado previamente para expresar ESE3 [11]. Como se muestra en la Fig.