Extracto
ruta de señalización del EGFR-MEK-ERK tiene un papel establecido en la promoción del crecimiento maligno y progresión de la enfermedad en los cánceres humanos. Por lo tanto, la identificación de dianas transcripcionales que median los efectos oncogénicos de la vía EGFR-MEK-ERK sería muy pertinente. inhibidor canceroso de la proteína fosfatasa 2A (CIP2A) es una oncoproteína humana caracterizado recientemente. CIP2A promueve el crecimiento de células malignas y se sobre expresa en alta frecuencia (40-80%) en la mayoría de los tipos de cáncer humano. Sin embargo, los mecanismos que inducen su expresión en el cáncer todavía permanecen en gran parte sin explorar. Aquí presentamos un análisis sistemático de la contribución de los posibles mecanismos de regulación de genes para la expresión de alto CIP2A en el cáncer. Nuestros datos muestran que la evolución islas CpG conservadas en el promotor proximal CIP2A no están metilados tanto en células normales y cancerosas. Por otra parte, la secuencia de la región promotora CIP2A activo a partir de un total de siete tipos de células normales y malignas no reveló alteraciones en la secuencia que incrementarían la expresión CIP2A específicamente en las células cancerosas. Sin embargo, el tratamiento de células de cáncer con diversos inhibidores de la vía de señalización reveló que la expresión de mRNA CIP2A era sensible a la inhibición de la actividad de EGFR así como la inhibición o activación de la vía MEK-ERK. Por otra parte, MEK1 siRNAs /2-específicos disminución de la expresión de proteínas CIP2A. CIP2A serie de construcciones promotor de luciferasa fueron creados para identificar proximal -27 a -107 región promotora responsable de la estimulación de MEK-dependiente de la expresión CIP2A. mutagénesis y la cromatina immunoprecipitation experimentos adicionales revelaron ETS1 como el factor de transcripción que media la estimulación de la expresión a través CIP2A vía EGFR-MEK. Por lo tanto, ETS1 es, probablemente, mediando la expresión de alto CIP2A en los cánceres humanos con una mayor actividad de la vía EGFR-MEK1 /2-ERK. Estos resultados también sugieren que además de su papel establecido en la invasión y la angiogénesis, ETS1 puede apoyar el crecimiento celular maligno a través de regulación de la expresión y de la proteína fosfatasa 2A inhibición CIP2A
Visto:. Khanna A, Okkeri J, Bilgen T, Tiirikka T, M Vihinen, Visakorpi T, et al. (2011) ETS1 media la MEK1 /2-dependiente de la sobreexpresión canceroso inhibidor de la proteína fosfatasa 2A (CIP2A) en células de cáncer humano. PLoS ONE 6 (3): e17979. doi: 10.1371 /journal.pone.0017979
Editor: Robert Oshima, SanfordBurnham Instituto de Investigación Médica, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Noviembre 2010; Aceptado: February 17, 2011; Publicado: 22 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Khanna et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Academia de Finlandia (proyectos: 217676 y 217675), Asociación Internacional para la Investigación del cáncer (proyecto 08-0614), Fundación para el Instituto Finlandés del cáncer (JW), Fundación Emil Aaltonen, Fundación Sigrid Juselius, financiación competitiva de la Pirkanmaa Distrito de Hospitales (proyectos: 9K152 y 9L115), Programa de Graduados de Tampere en Biomedicina y Biotecnología (AK), y La Científica y Tecnológica del Consejo de Investigación de Turquía (TB). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos o análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
p> la acumulación de diversas alteraciones genéticas
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mediada por la actividad de la vía /2 MAPK ERK-MEK1 se ha demostrado que regulan la práctica totalidad aspectos que intervienen en la génesis tumoral. De acuerdo con ello, el aumento de la actividad y la sobreexpresión de EGFR y la MEK1 /2 quinasas se ha observado en diversos cánceres humanos [3], [4], [5], [6]. Por otra parte, los inhibidores de EGFR, Raf y MEK1 /2 quinasas están en ensayos clínicos contra varios tipos de tumores sólidos [3], [4], [7], [8]. Curiosamente, el aumento de actividad de la vía MEK1 /2 debido a la hiperactividad de Ras y proteínas Raf también ha demostrado que contribuyen a la resistencia clínica a EGFR inhibidor de tirosina quinasa [4], [9], [10]. Estos resultados juntos sugieren que la inhibición de la actividad de la vía tanto en el nivel del receptor, y sus efectores aguas abajo puede ser necesaria para una terapia eficaz contra el cáncer.
familia ETS de factores de transcripción incluyendo Elk1, ETS1 y ETS2 son algunos de los objetivos conocidos de la vía de señalización del EGFR-Ras-MEK1 /2 [11]. ETS1 y ETS2 están fosforilados por tanto la señalización de Ras [11], [12]. ETS1 es un miembro de la familia fundadora de factores de transcripción ETS-dominio. Se ha relacionado con el cáncer desde su identificación como una fusión oncogénica con el producto de c-Myb proto-oncogén en el E26 virus de la leucemia aviar [13], [14]. ETS1 se conoce para apuntar a una amplia variedad de genes [11], [12], [15], que a su vez determina su papel en diversos procesos celulares. Perteneciente a ETS1 cáncer es mejor conocido por su papel en la promoción de la invasividad de las células tumorales, la motilidad y la metástasis [13], [16]. Invasion promover el papel de ETS1 se cree que está mediada por la transcripción hasta la regulación de genes que participan en la degradación de la matriz extracelular y la estimulación de la angiogénesis [16]. Curiosamente, a pesar de que ETS1 y otros factores de transcripción ETS-familia se han relacionado principalmente a la invasión tumoral, poco después de la clonación de ETS1 humano, Seth y colaboradores demostraron que la sobreexpresión ETS1 transforma las células NIH3T3 que los hace capaces de crecimiento independiente de anclaje y el crecimiento tumoral en nude ratones [17]. Más recientemente, también se demostró que ETS1 promovido fenotipo transformado celular en células humanas, así como [18], [19]. Sin embargo, los genes diana implicados en la transformación celular mediada por ETS1 son poco conocidos.
canceroso inhibidor de la proteína fosfatasa 2A (CIP2A) es una oncoproteína humana caracterizado recientemente [20]. CIP2A interactúa con e inhibe la fosfatasa 2A (PP2A) complejo supresor de tumor de proteínas y por lo tanto inhibe la desfosforilación y la degradación proteolítica posterior del factor de transcripción MYC [20], [21]. CIP2A promueve la formación de focos provocados-Ras en fibroblastos de embrión de ratón y apoya la transformación de las células humanas inmortalizadas [20]. En la pérdida de estudios de la función, el agotamiento CIP2A se ha demostrado para reducir el tamaño total de xenoinjerto de tumor en ratones desnudos [20], [22], y para poner en peligro la clonogenicidad y el crecimiento independiente de anclaje de las células tumorales [20], [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Recientemente, CIP2A también ha demostrado inhibir la actividad de PP2A quinasa asociada Akt y por estos medios para proteger las células de carcinoma hepatocelular humano de bortezomib inducida por apoptosis [26]. CIP2A se expresa sólo en muy pocos tejidos normales pero se sobreexpresa con incidencia muy alta (40-80%) en varios tipos de cáncer humano, tales como la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas (HNSCC), carcinomas de colon, carcinomas gástricos, los carcinomas de mama y no el cáncer se forman pequeñas de pulmón de células [20], [22], [23], [24], [25]. Además de su sobreexpresión en los cánceres, los estudios recientes han demostrado que immunopositivity CIP2A se correlaciona con enfermedad agresiva y /o la supervivencia del paciente deficiente en varios tipos de cáncer [22], [23], [24]. Con respecto a los mecanismos que regulan la expresión CIP2A, hemos identificado hasta ahora MYC como un estimulador de la expresión CIP2A [24]. Sin embargo, otros mecanismos que contribuyan a una mayor expresión en los cánceres humanos CIP2A sigue siendo difícil de alcanzar.
En el presente estudio, hemos clonado región promotora funcional CIP2A y se identificaron las regiones promotoras que median alta CIP2A actividad transcripcional. Además, el uso de inhibidores químicos de diversas vías de señalización y siRNAs específicos diana, que diseccionado el papel de EGFR-MEK1 vía /2 en la regulación de la expresión CIP2A. inmunoprecipitación de la cromatina, promotor de mutagénesis y de destino específicas siRNAs fueron luego utilizados para identificar ETS1 como el factor de transcripción que regula EGFR-MEK1 /2-dependiente de la expresión CIP2A en los cánceres humanos.
Resultados
El análisis bioinformático y la metilación estado de CIP2A Promotor
Para iniciar un análisis sistemático de los mecanismos que regulan la expresión CIP2A, 1,8 kb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción de genes CIP2A predicho se analizó usando el software Genomatix. La Figura 1A muestra el factor de transcripción predicho sitios de unión, que tiene similitud matriz de 95% y la similitud de núcleo de 100%, en la región genómica. software Genomatix también se utilizó para obtener el árbol filogenético del promotor CIP2A en diferentes especies (Fig. 1B). Curiosamente, el análisis de la región -1500 a 450 pb con software MethPrimer identificó una isla CpG entre los nucleótidos -150 a 400 pb (azul región sombreada en la Figura 1C). Es importante destacar que, la alineación de los promotores CIP2A en diferentes especies también reveló conservación de secuencias ricas en CpG en la región (Fig. S1A). La metilación de sitios CpG en las regiones reguladoras de los genes se sugiere que se correlaciona con el silenciamiento transcripcional. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la expresión CIP2A en tejidos normales y líneas celulares [20], [22], [23], [25] podría ser silenciado debido a la metilación del promotor. Con este fin, el estado de metilación de -150 a 400 pb región se analizó mediante el uso de secuenciación de bisulfito. muestras de ADN genómico recogidos para este análisis incluyen las células recién aisladas de sangre humana normal, los fibroblastos de piel humana cultivadas y células cancerosas cultivadas (AGS y HeLa). tratamiento de bisulfito del ADN genómico resultó en la conversión de todas las citosinas en la región promotora se secuenció para thymidines, en todas las muestras (Fig. 1D y la Fig. S1). Por lo tanto, ya que la metilación de las islas CpG en el promotor CIP2A no se observó en las células normales, es poco probable que el promotor de-metilación explicaría el aumento de expresión CIP2A en las células cancerosas.
A. Identificación del factor de transcripción sitios con matriz de similitud de 95% y la similitud de núcleo de 100% en promotor CIP2A -1802 pb utilizando software Genomatix unión. B. árbol filogenético que representa la conservación evolutiva de promotor CIP2A. C. Identificación de putativa CpG isla de -150 pb a 400 pb (azul área sombreada) en el promotor CIP2A utilizando el software MethPrimer. D. Muestra los resultados de la secuenciación del ADN genómico extraído de la sangre humana normal. Todos los sitios CpG (representados por los bloques rectangulares negras) que están dentro de la isla CpG se convirtieron de CG de TG cuando son tratados con bisulfito, lo que implica que el promotor CIP2A en estos sitios no está metilado.
Análisis funcional y SNP CIP2A del promotor
se han notificado polimorfismos de nucleótido único (SNP) para crear nuevo factor de transcripción sitios en los promotores de genes vinculante. Específicamente, un estudio previo demostró que un SNP en MMP-1 promotor creó un nuevo sitio de unión ETS que aumenta la transcripción de MMP-1 en células de cáncer [27]. Con el fin de evaluar el estado de SNP de promotor CIP2A, una región que contiene el promotor CIP2A representado en la Fig. 1A y el exón 1 (-1802 pb a 182 pb) fue secuenciado a partir de ADN genómico extraído a partir de sangre periférica humana normal, monocitos mononucleares no malignos humanos (MN-50), normales fibroblastos humanos dérmicos (NHDFc), línea celular de fibrosarcoma humano ( HT1080), línea celular de carcinoma de células escamosas (SCC7), línea cervical carcinoma de células (HeLa) y la línea celular de adenocarcinoma gástrico (AGS). Este análisis identificó varios SNPs en la región analizada, pero sólo dos de ellos (T & gt; C en -592 en HeLa y G & gt; A en -1100 en SCC7) no se encontraron resultados de las muestras normales (Fig 2A.). Sin embargo, como cada uno de estos dos SNPs se encontraron sólo de una línea celular de cáncer, pero no en los otros analizados, es poco probable que crear sitios de unión de factores de transcripción que aumentan la transcripción CIP2A generalmente en el cáncer. Es de destacar que T & gt; C a -592 en las células HeLa no ha sido documentado previamente en las bases de datos
A.. Identificado polimorfismos de nucleótido único en -1.802-182 región del promotor CIP2A a partir de células indicadas. Se observaron dos cambios específicos línea celular de cáncer, es decir, G /A en -1101 en SCC-7 línea celular y T /C a -592 en la línea celular HeLa. Ensayo de la luciferasa relativa B. que muestra la actividad relativa de -1802 pb del promotor CIP2A en comparación con promotores oncogénicos conocidos como EGFRLuc y 5xJunLuc. C. ensayo de luciferasa que muestra una comparación de la actividad entre el tipo salvaje (WT), el promotor CIP2A y los mutantes SNP indicados. D. Ensayo de la luciferasa que muestra la actividad de los promotores CIP2A indicados. alta actividad basal está mediado por primera 392 pb del promotor, de los cuales, casi dos tercios de los que se debía a la primera 108 pb. B-D, que se muestra es la media ± SD de tres experimentos independientes.
Con el fin de iniciar la caracterización funcional de promotor CIP2A, el -1802 pb a 182 pb 5 'aguas arriba del gen de la región que CIP2A se analizó de SNPs anteriormente, fue clonado en vectores para crear pGL4.10 CIP2A promotor de luciferasa reportero construir (-1802CIP2ALuc). La región promotora se amplificó a partir del ADN genómico de células AGS, y este clon particular, albergaba nucleótidos A en la posición -98 y T en la posición -1487 (Fig. 2A). Con el fin de estimar la actividad transcripcional relativa del fragmento de promotor CIP2A clonado, se comparó la actividad de la luciferasa de -1802CIP2ALuc a promotor /constructos de luciferasa se sabe que son activos en las células cancerosas. Como se muestra en la Fig. 2B, la actividad -1802CIP2ALuc era o equivalente o claramente superior a la actividad de EGFRLuc [28] o mínima 5xJunLuc [29] promotores, respectivamente. Sobre la base de este resultado se concluye que el -1802 pb a 182 pb 5 'región aguas arriba del gen clonado CIP2A contiene un promotor activo CIP2A
A continuación, el constructo -1802CIP2ALuc se utilizó para analizar si los SNPs 592 T & gt.; C y 1100G & gt; A identificado anteriormente eran funcionales. Con este fin, 592 T & gt; C y 1100G & gt; A se introdujeron mutaciones para -1802CIP2ALuc por mutagénesis específica de sitio y la actividad de las construcciones mutantes se comparó con el tipo salvaje 1802CIP2ALuc en las células AGS. En comparación con el tipo salvaje, no hubo ningún cambio visto en la actividad de luciferasa CIP2A con el 1100 G & gt; Un clon mutante, mientras que 592 T & gt; C clon mutante mostraron una marcada disminución en la actividad de la luciferasa (Fig 2C).
Finalmente, con el fin de caracterizar las regiones en el promotor CIP2A que median su alta actividad transcripcional, se clonaron varias deleciones 5 'del promotor /reportero. La comparación de las actividades basales de estas construcciones de deleción en células AGS reveló que no parecían regiones entre -392 y -1.802 para contener sitios de unión de factores de transcripción que podrían contribuir en gran medida a la alta actividad basal del promotor CIP2A (Fig. 2D). Curiosamente, la alta actividad de la luciferasa de -392CIP2ALuc se redujo significativamente cuando se eliminaron 57 nucleótidos adicionales que resulta en construcción -335CIP2ALuc (Fig. 2D). Esto parece estar causada por la exposición de un dominio de represión de la transcripción, como la supresión de más -335CIP2ALuc a -108CIP2ALuc resultó de nuevo en aumento significativamente la actividad de la luciferasa (Fig. 2D). Curiosamente, este promotor CIP2A 108 pb representó más del 50% de la actividad luciferasa producida por el -1802CIP2ALuc (Fig. 2D).
En su conjunto, estos datos se presenta en primer lugar un análisis funcional de la región promotora CIP2A. Por otra parte, estos resultados sugieren fuertemente que los SNPs en el promotor CIP2A no contribuyen de manera significativa a CIP2A sobreexpresión en cáncer.
Regulación de la expresión CIP2A por el EGFR-MEK1 /2 vía
Los resultados sugirieron que por encima de CIP2A expresión puede ser regulada positivamente por vías que estimulan su actividad promotora del gen de señalización. Para resolver si conocidos vías de señalización oncogénicas tenían papel en la regulación de la expresión CIP2A, las células AGS se trataron con inhibidores y activadores de la vía química bien definidos. Mientras que la inhibición de p38 o bien PI3 quinasas por SB23580 o LY294002, respectivamente, no reguló en los niveles de ARNm CIP2A, tanto los inhibidores de EGFR MEK1 /2 y (PD98059 y AG1478) disminución de la expresión de ARNm CIP2A (Fig. 3A). Además, el tratamiento de las células con éster de forbol TPA, un activador bien caracterizado de vía de señalización de MEK1 /2-ERK, aumento de la expresión mRNA CIP2A más de tres veces (Fig. 3A). Como se muestra en la Fig. 3B, los efectos de ambos AG1478 y TPA sobre la expresión de mRNA CIP2A ya eran evidentes tratamiento post 6 horas lo que sugiere un modo directo de la acción. Con el fin de mapear la región de promotor CIP2A que es sensible a la actividad de la vía EGFR-MEK1 /2, las células transfectadas con diversas longitudes de CIP2A construcciones del promotor de luciferasa fueron tratados con la actividad de luciferasa AG1478 o TPA, y, en comparación con el tratamiento control DMSO, se midió como una lectura de salida de la actividad promotora. Como se muestra en las Figs. 3C y D, el tratamiento AG1478 disminuyeron, mientras que el tratamiento TPA aumentó la actividad de luciferasa de todo, excepto la construcción -27CIP2ALuc más corto.
A. El análisis cuantitativo PCR (qPCR) que muestra los niveles de CIP2A mRNA extraído de células AGS tratados con DMSO, SB23580 (20 uM), LY294002 (10 uM), PD98059 (20 uM), AG1478 (10 uM) y TPA (100 nM) en 24 h punto de tiempo. Si bien se observó una disminución en el nivel de mRNA CIP2A con PD98059 y tratamientos AG1478, el tratamiento TPA aumenta los niveles de mRNA en CIP2A células AGS. B. Análisis de qPCR que muestra la regulación dependiente del tiempo de los niveles de ARNm en las células CIP2A AGS tratados con DMSO, AG1478 (10 uM) y TPA (100 nM) para los puntos de tiempo indicados. ensayos C y D de luciferasa que muestran la actividad de CIP2A indicada deleciones del promotor en las células tratadas ya sea con DMSO, AG1478 (10 uM) o TPA (100 nM) durante 24 h. (*,
P Hotel & lt; 0,05; n.s. = no significativo). B-D. Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes.
En conjunto, estos resultados muestran que la expresión CIP2A se regulated` positivamente por EGFR-MEK1 vía /2 y que la región sensible por las mentiras actividad de la vía entre -27 y -672 pb pb en el promotor CIP2A.
Caracterización de MEK1 /2 quinasa región sensible sobre el promotor CIP2A
con el fin de validar la contribución de MEK1 /2 quinasas en el regulación positiva de la expresión CIP2A, las células AGS se trataron con UO126, un MEK1 2 inhibidor más potente y específico /que el PD98059 utilizado anteriormente, y la expresión de proteínas CIP2A se estudió 48 horas post tratamiento. Como se muestra en la Fig. 4A, UO126 disminuyó dosis-dependiente la expresión de proteínas CIP2A. Por otra parte, dos diferentes siRNAs contra tanto MEK1 y MEK2 disminución de la expresión de proteínas en células AGS CIP2A (Fig. 4B). Es importante destacar que los efectos no fueron línea celular específica, ya sea como expresión de la proteína CIP2A inhibido MEK1 /2 inhibición química o basado en siRNA también en PC-3 línea celular de cáncer de próstata (Fig. S2). Para delimitar la región de MEK1 /2-sensibles en el promotor CIP2A, las células transfectadas con AGS serie de CIP2A luciferasa reportero construcciones fueron tratadas con UO126 (20 uM) y las actividades de luciferasa se midieron 48 horas después del tratamiento. En línea con los resultados observados con los tratamientos AG1478 y TPA, disminución de la actividad luciferasa de todas las otras construcciones, excepto el -27CIP2ALuc se observó en las células tratadas UO126 (Fig. 5A). Para reducir aún más la región MEK1 /2-sensibles en el promotor CIP2A, se clonaron diversas construcciones promotoras adicionales CIP2A luciferasa (Fig. 5B). La comparación de las actividades basales de estas nuevas construcciones, junto con construcciones de promotor seleccionado ya analizados en la Fig. 2D, confirmó además que existen dos regiones represivas un promotor de activación de promotor CIP2A entre -27 y -400 pb pb (Fig. 5B). Sin embargo, independientemente de la actividad basal del reportero, el tratamiento UO126 inhibió la actividad de todos los reporteros, incluyendo -108CIP2ALuc, con una notable excepción de la construcción -27CIP2ALuc (Fig. 5C). Por lo tanto, estos resultados demuestran que MEK1 /2 quinasas regulan positivamente tanto CIP2A promotor de la actividad y expresión de proteínas. Además, estos resultados identifican 81 pb entre -108 pb y -27 como una región MEK1 /2-sensible en promotor CIP2A.
A. Western blot que muestra el efecto dependiente de la concentración del inhibidor de MEK específica, U0126, en los niveles de proteína en las células AGS CIP2A a las 48 h punto de tiempo. B. Transferencia Western que muestra el efecto de ambos MEK1 y MEK2 siRNAs en los niveles de proteína en las células AGS CIP2A a las 72 h punto de tiempo.
A. Ensayo de la luciferasa que muestra la actividad de diferentes promotores longitud CIP2A cuando son tratados con DMSO y U0126 (10 uM) durante 24 h, la identificación de la región sensible MEK a estar entre -672 pb a -27 pb del promotor CIP2A. B. Ensayo de luciferasa que muestra la actividad basal indicó promotores CIP2A. C. Luciferase unos ensayos que muestra la actividad de diferentes promotores longitud CIP2A cuando son tratados con DMSO y U0126 (10 uM) durante 24 h, la reducción de más abajo de la región sensible MEK a estar entre -108 pb y -27 pb del promotor CIP2A (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,00; ns = no significativo). Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes.
EGFR-MEK1 vía /2 regula la expresión CIP2A través ETS1
Con el fin de identificar el factor de transcripción (s) la mediación de la estimuladora efectos de EGFR-MEK1 vía /2 en la regulación de la expresión CIP2A, que volvieron de nuevo al análisis bioinformático hecho por la región entre -27 pb a -108 pb (fig. 1A). Fuera de los factores de transcripción predichos que se unen a esa región, ETS1 tiene un papel establecido como un efector aguas abajo de la vía de MEK1 /2 [11], [12]. Por lo tanto, el próximo creado mutantes para estos sitios Ets1 y comparó la actividad de la luciferasa de la -108CIP2ALuc constructos que alberga las mutaciones a la del tipo salvaje. Los dos sitios de ETS y la estrategia de mutación se representan en la Fig. 6A, B. Como se muestra en la Fig. 6C, la mutación de cualquiera de los sitios Ets1 redujo drásticamente la actividad del promotor CIP2A. Para investigar si ETS1 media la regulación CIP2A MEK1 /2-dependiente, las células transfectadas con tanto de tipo salvaje y mutante ETS1 (sitio 1) construcciones -108CIP2ALuc fueron tratados con AG1478, UO126 o TPA. Mientras que la actividad -108CIP2ALuc tipo salvaje fue significativamente inhibido por AG1478 (Fig. 6D) o UO126 (Fig. 6E), y por el contrario activado por TPA (Fig. 6F), el promotor mutante ETS1 no respondió de manera significativa a estos tratamientos.
A. Diagrama esquemático del fragmento de 108 pb del promotor CIP2A que muestra la ubicación de dos sitios de unión Ets1 predicho superpuestas. B. Secuenciación resultados de ETS-1 mutantes sitio de unión en el promotor CIP2A crean mediante mutagénesis. La secuencia en la parte superior representa la secuencia de tipo salvaje (lectura de 5 'a 3' final), mientras que la secuencia de abajo es la secuencia mutada (leída de 5 'a 3' final). El cambio inducido en la secuencia se muestra dentro de la caja rectangular. C. Ensayo de la luciferasa que compara la actividad de cualquiera de las de tipo salvaje o -108CIP2ALuc indicado unión mutante sitio ETS -108CIP2ALuc construye. D, E & amp; F. Los ensayos de luciferasa que compara la actividad de cualquiera de las de tipo salvaje o mutante -108CIP2ALuc ETS1 Site1 -108CIP2ALuc construye después del tratamiento con DMSO, AG1478 (10 uM; D), UO126 (10 uM; E) o TPA (100 nM; F) durante 24 h. (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; n.s. = no significativo). Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes.
En conjunto, estos resultados identifican dos sitios Ets1 funcionales en el promotor proximal CIP2A. Además, estos resultados sugieren fuertemente que la estimulación /2 dependiente de MEK1 de la actividad promotora CIP2A está mediada por factores de transcripción ETS-familia.
ETS1 se une al promotor CIP2A y regula su expresión en células de cáncer de
para verificar que el HTA proteínas no se unen al promotor CIP2A en MEK1 /2 de manera dependiente de la actividad, se realizó un experimento de inmunoprecipitación de la cromatina con anticuerpo ETS1 y amplificación del pb -66 a +20 pb fragmento del promotor CIP2A. Como se muestra en la Fig. 7A, inmunoprecipitación ETS1 dio lugar a un enriquecimiento de 4 veces de CIP2A promotor de ocupación en comparación con la IgG control. Curiosamente, en el mismo experimento CIP2A enriquecimiento fue incluso más fuerte que UNQ9419, un objetivo ETS1 establecido que se utilizó como control positivo [30]. Además, el enriquecimiento de promotor CIP2A se inhibió significativamente por el tratamiento de las células con U0126. Además, mientras que la inhibición de la CIP2A enriquecimiento por UO126 fue estadísticamente significativa, la inhibición de la UNQ9419 enriquecimiento no era (Fig. 7A).
A. ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de ETS1 unión al promotor CIP2A en DMSO o UO126 células tratadas. promotor UNQ9419 se muestra como un control positivo. (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; n.s. = no significativo). B. ensayo de luciferasa que compara la actividad de cualquiera de las de tipo salvaje o -1802CIP2ALuc indicado unión mutante sitio ETS -1802CIP2ALuc construye. C, D & amp; E. El análisis de transferencia Western de los niveles de CIP2A y proteínas ETS1, ya sea en AGS (C), las células transfectadas con revueltos PC-3 (D) o LNCaP (E) (Scr.) o ETS-1 siRNAs específicos para 72 h.
los resultados anteriores demuestran que los elementos ETS median en gran medida la actividad basal y suscitó-MEK del promotor -108CIP2ALuc mínima (Fig. 6). Con el fin de establecer si estos elementos son esenciales para la ETS de longitud completa actividad promotora CIP2A la mutación de estos sitios en -1802CIP2ALuc y se comparó su actividad a la del tipo salvaje. Como se muestra en la Fig. 7B, la mutación de cualquiera de los sitios Ets1 redujo drásticamente la actividad del promotor -1802CIP2ALuc. Además, con el fin de verificar que ETS1 regula la expresión de proteínas CIP2A endógeno, se inmunotransfirieron dos diferentes siRNAs específico para ETS1 se transfectaron en las células y lisados de células AGS 48 horas después para CIP2A, ETS1 y los niveles de actina. Como se muestra en la Fig. 7C, disminución de los niveles de proteína CIP2A se observaron con ambos de los siRNAs específicos Ets1. Además, ETS1 regula positivamente la expresión CIP2A en líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP (Fig. 7E) PC-3 (Fig. 7D) y. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia experimental concreto de ETS1 ser el factor de transcripción que media EGFR-MEK1 /2 regulación dependiente de CIP2A en células de cáncer.
Finalmente, con el fin de revelar si el estado de la expresión de EGFR-MEK-ETS1 componentes de la vía y CIP2A en los cánceres humanos, que hace referencia a la base de datos Oncomine (www.oncomine.org). Este análisis reveló M6 subtipo de leucemia mieloide aguda como un tipo de cáncer en el que CIP2A y genes representativos de cada nivel de la vía (EGFR, MEK2 y ETS1) se upregulated significativamente en dos genoma amplia estudios de leucemia diferentes [31], [32] ( La Fig. 8)
A, B, C & amp;. D. análisis de la base de datos Oncomine de perfiles de expresión génica para los genes de la vía EGFR-MEK-Ets1 reveló M6 subtipo de leucemia mieloide aguda como un tipo de cáncer en el que CIP2A y genes representativos de cada nivel de la vía son upregulated significativamente (**,
P
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Discusión
una caracterización sistemática reciente de mutaciones somáticas en 441 tumores humanos identificó el factor de crecimiento de señalización de vía /2-ERK MEK1 receptor sea una de las vías alteradas más significativamente a través de los cánceres humanos [33]. Por otra parte, la inhibición de forma oncogénica de B-Raf en los melanomas malignos humanos por parte de una pequeña molécula inhibidora demostró una eficacia clínica muy prometedor ya en la fase I de ensayos clínicos [7]. Basándose en los resultados de estos estudios y amplio de los datos anteriores que demuestran la función oncogénica de activación de la vía MEK1 /2-ERK mediada por EGFR, es evidente que la identificación de efectores oncogénicas de la actividad de la vía es importante. En este estudio hemos demostrado que CIP2A es un objetivo oncogénico novela upregulated de actividad de la vía MEK1 /2-ERK EGFR inducida. Después de su clonación original [34], y la caracterización funcional adicional [20], CIP2A se ha demostrado para promover el crecimiento de células malignas mediante el uso de varios modelos celulares de cáncer humano [20] [22], [23], [24], [25, ]. Por otra parte, la proteína CIP2A se ha demostrado que se sobreexpresa con frecuencia muy alta en diferentes tipos de tumores malignos humanos. Con excepción del cáncer de mama humano, donde CIP2A se sobreexpresa en el 40% de las muestras de los pacientes [22], en todos los demás tipos de cáncer estudiado la frecuencia es de entre el 65 al 87% de los pacientes [20], [23], [24], [25]. Esto hace que la sobreexpresión CIP2A junto con activación de la vía MEK1 /2-ERK como una de las alteraciones más frecuentes en los cánceres humanos. Sin embargo, antes de este estudio, los mecanismos por los cuales se induce la expresión CIP2A en células cancerosas humanas han sido muy mal entendido.
Con el fin de identificar los mecanismos responsables de la alta expresión basal de CIP2A en células cancerosas humanas, tenemos en este estudio analizado sistemáticamente contribución de los diversos mecanismos de regulación de genes potencial que han sido anteriormente demostrado que afectan a la expresión de genes en los cánceres humanos. Aunque no hemos descartado que sea exclusivamente la metilación del promotor o funcional SNPs en el promotor CIP2A podrían contribuir a la expresión de alto CIP2A en el cáncer, nuestros datos indican que hace que estos mecanismos más probable que no son relevantes para la regulación de la actividad del promotor CIP2A. Con el fin de identificar las regiones de promotor funcionalmente implicados en la regulación de la expresión en células de cáncer CIP2A, hemos creado en conjunto 10 promotor reportero construcciones eliminación. Los datos mostrados en las figuras 2D y 5B nos permiten concluir que la región promotora entre -335 -392 pb pb y contiene un fuerte elemento promotor de activación, mientras que la región entre -108 y -204 pb pb contiene un elemento represor fuerte. Además, los datos muestran, que la región promotora aguas arriba de -417 pb no contribuyen significativamente a la alta actividad basal del promotor CIP2A estudiado en células AGS, mientras que, región promotora entre -27 y -108 pb pb tiene un elemento de activación muy fuerte representando por lo menos 50% de la actividad total del promotor -1802 pb. Además de la regulación del promotor, otro mecanismo importante que contribuye a la expresión de la proteína es la modificación de su turno sobre la tasa o la estabilidad. CIP2A se ha demostrado previamente que la proteína muy larga vida en la línea celular de carcinoma hepatocelular [26]. Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos que contribuyen a la estabilidad CIP2A en células de cáncer será una cuestión relevante que se abordarán en el futuro.
Nuestros experimentos posteriores con el promotor CIP2A identificaron dos sitios de unión ETS-parte se solapan entre -60 pb hasta -30 pb ser en gran parte responsable de la alta actividad del promotor de longitud completa.