Extracto
Antecedentes
silenciamiento epigenético es un mecanismo común para inactivar los genes supresores de tumor durante la carcinogénesis. Potenciador de Zeste 2 (EZH2) es la subunidad histona metiltransferasa en Polycomb represivas complejo 2 que media la represión transcripcional a través de metilación de las histonas. EZH2 sobreexpresión se ha relacionado con fenotipos agresivos de ciertos tipos de cáncer. Sin embargo, el mecanismo que EZH2 jugado en la promoción de la malignidad en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) no está clara. Además, la correlación de EZH2 sobreexpresión y el pronóstico de los pacientes con CPNM en la cohorte no asiático necesitan ser determinados.
Metodología /Principales conclusiones
Sobre regulación de EZH2 se encontró en las células NSCLC en comparación con las células epiteliales bronquiales humanas normales mediante ensayo de transferencia de Western. Tras la caída EZH2 utilizando pequeños ARN de interferencia (siRNA), la proliferación, crecimiento independiente de anclaje y la invasión de células de NSCLC se suprimieron notablemente con profunda inducción de la detención G1. Por otra parte, la expresión de ciclina D1 se redujo notablemente, mientras que p15
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Kip1 se incrementaron en las células NSCLC después del parto EZH2-siRNA. Para determinar si la expresión de EZH2 contribuye a la progresión de la enfermedad en pacientes con NSCLC, Taqman cuantitativa en tiempo real RT-PCR se utilizó para medir la expresión de EZH2 en tumor emparejados y las muestras normales. El análisis univariante reveló que los pacientes con CPNM cuyos tumores tenían una expresión EZH2 más alta tuvieron significativamente inferiores en general, supervivencia específica de la enfermedad, y libre de enfermedad en comparación con aquellos cuyos tumores expresado menor EZH2 (P = 0,005, P = 0,001 y P = 0,003, respectivamente ). En el análisis multivariante, la expresión EZH2 era un predictor independiente de supervivencia libre de enfermedad. (Razón de riesgo = 0,450, IC del 95%: 0,270-0,750; p = 0,002)
Conclusiones /Importancia
Nuestro resultados demuestran que la sobreexpresión de EZH2 es crítica para la progresión de NSCLC. los niveles de mRNA de la EZH2 pueden servir como un predictor de pronóstico para pacientes con NSCLC
Visto:. Cao W, Ribeiro RDO Liu D, Saintigny P, R Xia, Xue Y, et al. (2012) EZH2 Promueve comportamientos malignos a través de desregulación del ciclo celular y su nivel de ARNm asociados con el pronóstico del paciente con células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (12): e52984. doi: 10.1371 /journal.pone.0052984
Editor: Qing Yi-Wei, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Julio, 2012; Aceptado 22 de noviembre de 2012; Publicado: 31 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Cao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo con el apoyo de subvenciones del NIH R01 CA126818 y R01 CA136635. WC está apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81202130). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos, que mata a más de 160.000 que los estadounidenses cada año [1], de los cuales, el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa más de 85% de los casos. A pesar de la mejora continua en las técnicas quirúrgicas y la quimiorradioterapia, la tasa de supervivencia a los 5 años de los pacientes con NSCLC avanzado estado no mejoró dramáticamente debido a la falta de tratamientos efectivos [2]. Al igual que en otros tipos de cáncer, múltiples pasos que dieron como resultado la acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas estaban implicados en la iniciación y progresión de cáncer de pulmón [3], [4]. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo molecular de la progresión del cáncer es crítica para el avance del tratamiento de cáncer de pulmón [5], [6], [7].
La metilación de las islas CpG en las regiones promotoras es un mecanismo epigenético común a inactivar los genes supresores de tumores, como
p16, PTEN, DAPK
[8], [9]. proteínas del grupo Polycomb (proteínas PcG) son importantes reguladores epigenéticos de genes implicados en la proliferación celular, la diferenciación, la formación del patrón y el tallo renovación celular [10], [11], [12]. EZH2 es un miembro de las proteínas PcG y parte del complejo Polycomb represor (República Popular China) 2, que methylates histona H3 en la lisina 27 (H3K27me3). H3K27me3 a su vez servir como un punto de referencia para la contratación de otros complejos de proteínas, tales como PRC1, para mediar en el silenciamiento epigenético [13]. Se demostró que los PRC puede reclutar metiltransferasas de ADN directa e inducir la metilación del ADN [14], [15]. La sobreexpresión de EZH2 se ha observado en varios tipos de tumores [16] - [25], y se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo, EZH2 parece tener funciones biológicas distintas en diferentes tipos de cáncer ya que está vinculada con el pronóstico más preferida en algunos tipos de cáncer [26], [27].
A pesar de que los niveles de proteína EZH2 ha demostrado ser un indicador pronóstico negativo en NSCLC [17], [18], el mecanismo subyacente de EZH2 en la promoción de la malignidad en NSCLC no han sido bien caracterizado. En este estudio, hemos tratado de determinar el impacto biológico de la EZH2 ovexpression en CPNM y evaluar la posibilidad de utilizar los niveles de expresión de mRNA de la EZH2 como un posible biomarcador para predecir los resultados clínicos en pacientes con NSCLC.
Materiales y Métodos
líneas celulares y pacientes
líneas celulares de NSCLC (H157, H226, H292, H358, H460, H522, A549, H596, H1299, H1792, H1944, Calu-1, y SK-Mensajero 1) utilizado en el estudio se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en medio DMEM con 10% de suero fetal bovino (Mediatech, Manassas, VA). Las líneas bronquiales humanas normales de células epiteliales HBE1, HBE2 y HBE3 (amablemente proporcionado por el Dr. John Minna de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas TX) se cultivaron en medio libre de suero de queratinocitos con 25 mg de extracto /ml de pituitaria bovina y 0,2 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante (Invitrogen, Carlsbad, CA) como se describe antes [28], [29].
las muestras clínicas incluidas en el estudio consisten en tumores primarios y sus correspondientes tejidos pulmonares no malignas forman 94 individuos con patológica en estadio I a IV NSCLC. Todos los pacientes fueron tratados con resección quirúrgica de los tumores primarios, excepto aquellos en estadio III y IV de tumores que también podrían recibir radioterapia postoperatoria y quimioterapia adyuvante, en el MD Anderson Cancer Center de 1995 a 2000. Las muestras fueron inmediatamente congelados y almacenados a -80 ° C hasta su análisis. La selección de estos pacientes se basó en la disponibilidad de tumor fresco archivado y tejidos pulmonares normales correspondientes para los investigadores. La información clínica y la información de seguimiento para el estudio se basaron en revisión de las historias y de los informes del servicio de registro de tumores M. D. Anderson. El consentimiento informado para el uso de tejidos resecados residuales para la investigación se obtuvo de todos los pacientes incluidos en el estudio y todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este trabajo. El estudio fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center.
La extracción de RNA y Taqman Expresión Génica Análisis
El ARN total de muestras de tejido se extrajo utilizando Trizol reactivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1 a 2 g de ARN total de cada muestra fue convertido a cDNA utilizando transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) en un volumen de 20 l. El producto de ADNc se diluyó hasta 100 l con agua estéril. Para el ensayo de la expresión de genes Taqman, 2,5 l de cDNA diluido se mezcló con deshidrogenasa cebador limitado gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) sonda de control endógeno (Cat#432631) y la sonda de EZH2 (Ensayo ID Hs001016789_m1, cat#4331182) en un total de 25 volumen l de reacción y se ensayó en un sistema de PCR en tiempo real Fast 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) de acuerdo a la condición de fabricación recomendado. El nivel de expresión de GAPDH-normalizado de EZH2 en los tejidos tumorales o tejidos pulmonares normales adyacentes se calculó como Ct (dCt_Tumor o dCt_Normal) = Ct
EZH2-Ct
GAPDH. carreras duplicados se realizaron y se utilizó el promedio de? Ct para el análisis. El uso de los niveles de expresión relativa a los tejidos normales correspondientes, se determinó el nivel EZH2 individual. La diferencia veces de la expresión EZH2 en un tejido tumoral en comparación con el tejido normal correspondiente se calcula por 2
-ΔΔCt (el método comparativo Ct), donde ΔΔCt = Ct Tumor (dCt_Tumor) -ΔCt Normal (dCt_Normal) (25). Una diferencia & gt redil;. 1 se considera una expresión de alto EZH2 en el tejido tumoral
transfección siRNA
Desde EZH2 tiene dos grandes variantes de corte y empalme, químicamente siRNAs sintetizados fueron diseñados para dirigir las dos variantes de corte y empalme y EZH2 adquirido de Ambion Inc. (siRNA ID: SI-4916 y SI-4917). Las secuencias de estos ARNsi son 5'GCUGACCAUUGGGACAGUATT-3 '(SI-4916) y 5'-GUGUAUGAGUUUAGAGUCATT-3' (SI-4917). La FAM etiquetados revueltos siRNA también se obtuvo de Ambion Inc in vitro de transfección transitoria se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante.
Análisis Western Blot
Las proteínas se cosechadas a partir de células cultivadas con tampón RIPA más inhibidores de proteasa (Complete inhibidor de la proteasa, Roche Bioscience). Veinte microgramos de proteína total de cada muestra fueron separados en sodio dodecil Sulfate- electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un aparato Bio-Rad Mini-Protean II. Las proteínas separadas en el gel se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Schleicher & amp; Schuell BioScience, Keene, NH). Las membranas fueron bloqueadas con 1% de leche sin grasa para 30 min a temperatura ambiente, se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche, seguido de peroxidasa de rábano picante conjugado con anticuerpos secundarios para detectar inmunorreactividad específica. El anticuerpo contra EZH2 (clon 11) se obtuvieron de BD Transduction Laboratories (San Jose, CA). anticuerpos contra la ciclina D1, ciclina D3, CDK4, CDK6, p15
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Kip1, exfoliados PARP Asp214, exfoliados caspasa-3 Asp175, caspasa-3 y GAPDH se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA) o Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). SuperSignal West sustrato (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) fue utilizado como el agente de detección.
Ensayo de proliferación celular
Las células fueron transfectadas con revueltos, siRNAs si-si-4916 o el 4917 se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
3 células por pocillo, por triplicado, y se ensayó la viabilidad celular a 24 h de intervalo usando un reactivo de proliferación celular (WST-1, Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 10 l de reactivo WST-1 a cada pocillo y la placa se incubó a 37 ° C durante 1 h. La absorbancia que es un indicador de la viabilidad celular se midió a 450 nm. Todos los experimentos se repitieron de forma independiente al menos 3 veces.
Ciclo Celular Análisis
Las células transfectadas con siRNA se cosecharon 72 horas después de la transfección, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en 70% durante la noche etanol frío. Las células fijadas se tiñeron con PI /RNasa tinción Buffer (BD Pharmingen ™) que contenía 0,1% citrato de sodio y 0,1% de Triton X-100 a 4 ° C en la oscuridad durante 30 min. datos del ciclo celular se recogieron en la Universidad de Maryland, Baltimore Citometría de Flujo Core y se analizaron con el software FlowJo.
Colonia Ensayo de agar blando Formación
Para evaluar el efecto de la EZH2 caída en el crecimiento independiente de anclaje , 2 × 10
4 células siRNA transfectadas se mezclaron con 1,5 ml de agarosa al 0,35% en DMEM-FBS al 10% y se sembraron en la parte superior de solidificado de agarosa al 0,5% en placa de 6 pocillos por triplicado. Después de la solidificación de la capa superior a 4 ° C durante 30 min, el gel se cubrió con 1 ml de medio de cultivo y se incubaron durante 3 semanas con cambio de medio cada 3 días. Al final de 3 semanas, las colonias & gt; 0,1 mm de diámetro se contaron bajo un campo microscópico en × 20 aumentos. Los recuentos medios de colonias se calcularon a partir de 6 campos seleccionados al azar para cada condición de tratamiento.
In Vitro Cell Invasion
Ensayo
In vitro ensayo de invasión se realizó en BD BioCoat Matrigel cámaras de invasión (Falcon 354480; BD Biosciences). Después de la rehidratación de las cámaras, 1 × 10
se añadieron 5 células transfectadas transitoriamente en 500 l DMEM que contiene FBS al 1% en cada una de las cámaras superior e 750 DMEM l que contiene 10% de FBS se colocó en la cámara inferior. Después de 20 h de incubación, las células se fijaron en formaldehído al 4% y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. Las células no invasoras en el lado superior de la cámara se retiraron usando un hisopo de algodón. células invasoras se fotografiaron y se contaron en 8 campos seleccionados al azar (magnificación, × 20). Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron 3 veces.
Análisis estadístico
Los datos clínicos se resumen utilizando estadística descriptiva estándar y la tabulación de frecuencias. prueba de Kruskal-Wallis y Wilcoxon rango suma de prueba se realizaron para evaluar la diferencia de las variables continuas entre /entre los parámetros clínico-patológicas de los pacientes. Las correlaciones entre la expresión de ARNm EZH2 y los parámetros clínicos se evaluó mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Las curvas de supervivencia se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier. Se aplicó univariado de Cox modelo de riesgo proporcional para evaluar el efecto de las covariables sobre la supervivencia global, la supervivencia específica de la enfermedad (es decir, los que murieron de causas pulmonares relacionados con el cáncer específicamente) y la supervivencia libre de enfermedad (es decir, los que desarrollaron recurrencia y /o metástasis). modelo multivariado de Cox se utilizó para evaluar el efecto de EZH2 en el tiempo con el resultado de eventos, ajustando por otras variables que se muestran significación estadística en el análisis univariado. Todas las pruebas estadísticas son de doble cara y un P
-
valor de 0,05 o más bajo fue considerado estadísticamente significativo. El
t
test para datos emparejados se utilizó para el análisis de los
in vitro
estudios. Todos los cálculos se realizaron en SAS (Cary, Carolina del Norte) y S-plus 7.0 para Windows (perspicaz Corp).
Resultados
fenotípicas Efectos de la EZH2 descenso de regulación en las células NSCLC
proteína EZH2 se detectó como una única banda de 91 kDa en Western blot en todas las 13 líneas celulares de cáncer y en células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas (HBE). La expresión en células de NSCLC fue en general mayor que en HBE (Fig. 1A). tinción EZH2 se localizó exclusivamente en los núcleos de las células de cáncer de pulmón (Fig. 1B). H1299 y A549, que tenía niveles altos y moderados de expresión EZH2 respectivamente, se seleccionaron para la investigación adicional de la relación entre el nivel de EZH2 y fenotipos malignos.
(A) expresión EZH2 en células de cáncer de pulmón NSCLC y bronquial humana células epiteliales (HBE) se determinaron por transferencia de Western usando lisado de células enteras. La transferencia se sondeó primero con el anticuerpo anti-EZH2 y volvieron a sondar con el anticuerpo anti-GAPDH para indicar la cantidad de carga. (B) tinción inmunocitoquímica de células de NSCLC cultivadas. células A549 y Calu-1 se fijaron por 1% de formaldehído después se tiñeron con anticuerpo anti-EZH2, seguido por la detección con anticuerpos anti-ratón anticuerpo secundario y DAB como agente cromógeno. Secondary-anticuerpo sólo se utiliza como control negativo. (C) Ejemplo de baja regulación de la expresión de siRNA transfección EZH2. células H1299 y A549 fueron transfectadas con siRNA dirigido EZH2 SI-4916 y SI-4917 siRNAs o un control de si-ARN codificado. El lisado de células enteras se cosecharon 72 horas después de la transfección y se analizó como se describe en A.
dos que no se solapan siRNAs (si-4916 y si-4917) se utilizaron para silenciar la expresión EZH2 en H1299 y A549 Células. La transfección de si-4916 en estas células de NSCLC resultó en la reducción de 10 a 60% de la expresión de EZH2, mientras que la transfección con si-4917 reducido nivel de proteína EZH2 por 70 a 80% (Fig. 1C). La reducción de la expresión de EZH2 disminuyó significativamente la proliferación de H1299 y células A549 (Fig. 2A y 2B). Para determinar qué población de células fue perturbado en el ciclo celular, citometría de flujo El análisis se llevó a cabo en estas células de cáncer de pulmón transfectadas. Los resultados mostraron que la reducción de EZH2 plomo expresión a la acumulación de las células en la fase G1 y la reducción de células en fase S (Fig. 2C y 2D).
(A, B) parcela proliferación de las células con baja -regulated EZH2. A549 o 1299 fueron transfectadas con siRNA dirigidos EZH2-o revueltos siRNA control durante 6 horas, luego se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado por tratamiento. La proliferación de las células se evaluó mediante el ensayo de WST-1 a las 24 horas de intervalo. (C, D) Distribución de la población celular en células de NSCLC EZH2 desmontables. A549 o 1299 células fueron transfectadas con siRNA o control mezclado. Las células se recogieron 72 horas más tarde, se fijaron y tiñeron con yoduro de propidio. contenido de ADN celular se determinó por citometría de flujo y la distribución de las células se analiza por el software FlowJo.
Además, H1299 o A549 células con expresión regulada EZH2 down-mostraron una capacidad de formación de colonias reducido significativamente. células de NSCLC transfectadas con si-4916 o si-4917 resultaron en 1.5 a la reducción de 2,8 veces en colonias formadas en agar blando en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control revueltos en el ensayo de formación de colonias independiente del anclaje en agar blando (Fig. 3A). Además, la capacidad de estas células de NSCLC para invadir a través de la matriz extracelular también se redujo significativamente en EZH2 baja regulación como se determina mediante un ensayo de cámara de invasión recubierta matrigel Boyden (Fig. 3B).
A549 o 1299 se transfectaron con EZH2 de metas de siRNA o control siRNA revueltos durante 6 horas. (A) Para el ensayo de formación de colonias independiente del anclaje, las células transfectadas se sembraron en 0,35% de agarosa en una placa de 6 pocillos a 2 x 10
4 /pocillo. Las colonias formadas se contaron después de 3 semanas incubadas con cambio regular de medio. (B) Para la invasión y ensayo de migración, 1 × 10
5 células transfectadas en 1% de suero se sembraron en la parte superior de una cámara de invasión BD BioCoat Matrigel con 10% de FBS en la cámara inferior. Después de 24 horas, las células se fijaron con formaldehído al 4% con 0,5% de cristal violeta. Células invadidas a la cámara inferior fueron contados bajo el microscopio de baja magnificación. Los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces. El número medio y la desviación típica de cada tratamiento se graficaron aquí.
Impacto de la EZH2 descenso de regulación en reguladores del ciclo celular y metastásico Inhibidor
Correlación de EZH2 Expresión y el resultado clínico en pacientes con NSCLC
para determinar si la expresión EZH2 contribuye a la progresión de la enfermedad en pacientes con CPNM, que mide los niveles de expresión de EZH2 en 94 tejidos tumorales de NSCLC y las características determinadas adyacentes tejidos pulmonares no malignas por Taqman cuantitativa en tiempo real PCR, hemos analizado a continuación, la correlación de los niveles de expresión EZH2 con parámetros clínicos y los resultados del tratamiento.
Entre los 94 pacientes, 59 pacientes murieron y 35 pacientes todavía estaban vivos en el momento del último seguimiento. El tiempo medio de seguimiento es de 56 meses. la edad de los pacientes en el momento del diagnóstico varió de 41 a 84 años, con una edad media de 63 años. El cuarenta y uno (43%) de los pacientes eran mujeres y cincuenta y tres (56%) eran hombres. Sesenta y tres (67%) de los pacientes eran fumadores actuales o formales. Se encontró que los tipos histológicos de adenocarcinoma, carcinoma escamoso, y otros en 51%, 40% y 9% de los pacientes, respectivamente. Etapa I y II los pacientes representan el 66% de los todos los pacientes, y los restantes 34% de los pacientes en estadio III y IV de la enfermedad. Las características clínicas y patológicas generales de los pacientes se resumen en la Tabla 1.
No se observó asociación significativa entre la expresión de EZH2 en el tumor o el pulmón normal adyacente y los parámetros clínico-patológicos, al lado de una asociación estadísticamente insignificante de fumar y la expresión EZH2 en el tumor (p = 0,1), y una correlación límite entre el estadio clínico y expresión EZH2 en el tumor en comparación con tejidos pulmonares normales adyacentes (p = 0,07, Tabla 1). En general, encontramos, bastante inesperado, que el nivel medio de expresión de EZH2 en el tejido tumoral fue similar a la de los tejidos adyacentes no malignas pulmonares (DCT = 3,86 vs 3,90; mediana de cambio veces = 1,0, Tabla 1).
A continuación, analizó la asociación entre la expresión EZH2 y los resultados clínicos de los pacientes. En el análisis univariante, se observó que la expresión EZH2 alta en el tumor de tejido en relación con el tejido pulmonar normal adyacente emparejado (modificar alta EZH2 veces) se asoció fuertemente con la supervivencia global, la supervivencia libre de enfermedad y las enfermedades específicas de supervivencia de los pacientes con NSCLC (razón de riesgo = 0,477, 0,414, 0,468 y P = 0,006, 0,002, 0,004, respectivamente, Tabla 2). El estadio clínico tuvo una asociación marginal con la supervivencia libre de enfermedad (p = 0,090). El análisis de Kaplan-Meier mostró que los pacientes cuyos tumores tenían alta expresión tumoral EZH2 en relación con el tejido pulmonar normal adyacente emparejado tuvieron un resultado clínico significativamente inferior en comparación con aquellos cuyos tumores tenían una baja expresión EZH2. En la cirugía posterior a los 5 años, la probabilidad de supervivencia global, la supervivencia específica de la enfermedad y la supervivencia libre de enfermedad fueron 25%, 27% y 15%, respectivamente, para el grupo de la expresión de alto, en comparación con 57%, 59% y 47% para el grupo de baja expresión (P = 0,005, P = 0,001 y P = 0,003, respectivamente, Log rank test; Fig. 5A). Curiosamente, el nivel de expresión EZH2 en el tejido tumoral (dCt_Tumor) por sí misma es insuficiente para predecir el pronóstico de pacientes con NSCLC (Fig. 5B). En análisis multivariados proporcionales de Cox con estadio de la enfermedad como el co-factor, la expresión EZH2 en el tejido tumoral con respecto al tejido pulmonar normal anexa adaptada fueron los predictores independientes de la supervivencia libre de enfermedad (razón de riesgo = 0,045, IC del 95%: 0.270 a 0.750, P = 0,002) (Tabla 2).
Discusión
proteínas del grupo Polycomb son importantes para mantener los patrones espaciales de la expresión de genes homeóticos que se establecieron temprano en el desarrollo embrionario, manteniendo el estado silenciado de genes homeóticos [30], [31]. La expresión anormal de proteínas del grupo Polycomb puede cambiar la forma de patrón de expresión génica celular. La sobreexpresión de EZH2 se ha demostrado que causa la hiperplasia epitelial en las glándulas mamarias [32], y para promover la transformación maligna de las lesiones precancerosas en los cánceres en diversos tejidos epiteliales [33] - [36]. Además, cada vez mayores evidencias sugieren que la sobreexpresión de EZH2 en los cánceres de contribuir a un comportamiento clínico más agresivo [16], [25], lo que probablemente mediado en parte a través de silenciar la expresión de células inhibidores del ciclo p15
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INK4A [37], [38]. Sin embargo, el papel preciso EZH2 jugó en la progresión del cáncer de pulmón sigue siendo poco clara.
En células de mamíferos, CDK4 /ciclina D-6 y CDK2-ciclina E son la principal G1 /S del ciclo celular puesto de control de los factores que controlan el compromiso de las células al tránsito desde la fase G1 y entrar en la síntesis de ADN. Mientras que los complejos E /6-ciclina D y CDK2-ciclina CDK4 promueven la célula entra en la fase S a través de aliviar la inhibición de PRB en la transcripción de la fase S de la promoción de los genes, p15
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Kip1 son reguladores negativos de estos dos complejos, respectivamente [39], [40]. En este estudio, hemos demostrado que la sobreexpresión de EZH2 es necesaria para el crecimiento de NSCLC mediante la promoción de la transición G1-S; golpeando hacia abajo la expresión de EZH2 en células de NSCLC inducidas por las células se acumule en fase G1, mientras que la reducción de las células en la fase S. Los fenómenos fueron similares a lo que se observa en otros tipos de células transformadas aerodigestivo superior pista epitelios [33], [41]. Los cambios en la distribución del ciclo celular se acompaña por la reducción de expresión de la ciclina D1, y el aumento de p15 expresión
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Kip1 en una o ambas de las líneas de células de NSCLC, comparable con los resultados en otros tipos de tumores [33], [42], [43], [44], lo que indica EZH2 puede promover la malignidad por mecanismo similar en diferentes tipos de tumores. El efecto global de EZH2 baja regulación se disminuye actividades de CDK4 /6-ciclina complejos E D y CDK2-ciclina, reduciendo así la proliferación celular. Esto sugiere uno de los principales efectos de la desregulación EZH2 en el CPNM es el control del ciclo celular alterada.
Además, se observó EZH2 regulación a la baja significativamente impactados otros comportamientos agresivos de células de NSCLC, tales como la capacidad de formar colonias en de forma independiente de anclaje y el invasor a través de la matriz extracelular. Se observó que la expresión de DIAB2IP, un supresor de la metástasis y un objetivo de silenciamiento epigenético EZH2 mediada en el cáncer de próstata [45], [46], fue significativamente mayor en EZH2 desmontables, lo que sugiere un papel potencial de DIAB2IP en la regulación de Ras de señalización en células epiteliales de pulmón, y su inactivación como parte del proceso oncogénico en el pulmón.
además, también se observó que la expresión de caspasa 3, marcadores apoptóticos escinde PARP Asp214 y se escindió de la caspasa-3 Asp175 se incrementaron en las células A549 con EZH2 desmontables (Fig. 4B), lo que sugiere EZH2 sobreexpresión podría tener la función de anti-apoptosis en algunas células de NSCLC.
H1299 (a) o las células A549 (B) se transfectaron con EZH2 de metas de siRNA o revueltos control de siRNA como se indica. 72 horas después de la transfección, se recogieron las células y se extrajo la proteína total. Veinte microgramos de proteína por pocillo se separaron en SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. La transferencia se sondeó con el anticuerpo indicado y se visualizaron mediante un anticuerpo secundario conjugado con HRP y ECL. Imágenes, películas fueron digitalizadas mediante escáner de película de Canon. El nivel de expresión se cuantificó por recuento de densidad de píxeles digitalizados usando Adobe Photoshop y se expresa como cambios veces por debajo de las imágenes.
estimación de Kaplan-Meier de la supervivencia global, la supervivencia específica de la enfermedad y la supervivencia libre de enfermedad por ( a) EZH2 expresión en los tejidos tumorales relativos a los tejidos pulmonares normales adyacentes (cambio EZH2 veces); y (B) los niveles de expresión EZH2 en el tejido tumoral por sí mismo (dCt_Tumor). La mediana de cada medida se utilizó para dicotomizar la población de pacientes.
EZH2 elevada inmunorreactividad en el tumor se asoció con el resultado clínico adverso en lo que parece ser predominantemente orientales cohortes de pacientes con NSCLC [17], [18 ]. Para determinar la correlación de la expresión de EZH2 y el resultado clínico en una cohorte de pacientes de Estados Unidos, se utilizó el método de PCR cuantitativa en tiempo real. Nuestros datos indican que la expresión EZH2 en el tumor en relación con el tejido pulmonar normal adyacente es un predictor fuerte e independiente de la evolución clínica en estos pacientes. También se observó expresión EZH2 relativamente fuerte en el tejido no maligno de pulmón adyacente tumor, que puede resultar de la exposición carcinógeno crónica de todo el pulmón. De acuerdo con esta posibilidad, nuestro estudio mostró que la expresión EZH2 en los tumores de los fumadores fue ligeramente mayor que en los tumores de ninguno fumadores.
Una limitación importante de nuestro análisis es su tamaño de muestra relativamente pequeña. No para, no fuimos capaces de ver una fuerte asociación de la evolución de la enfermedad en estadio clínico, tampoco se ha observado ninguna asociación de la expresión EZH2 con la aparición de metástasis.
En resumen, hemos demostrado que la sobreexpresión de EZH2 contribuye a la desregulación del ciclo celular y fenotipos agresivos de células de NSCLC, posiblemente a través de la alteración del mecanismo de control del ciclo celular y la promoción del crecimiento maligno. Se demostró además que específico de tumores sobre regulación de la expresión de ARNm EZH2 es un factor independiente de mal supervivencia en pacientes con NSCLC. Estos resultados también sugieren que un subconjunto de pacientes con CPNM cuyo tumor tiene una expresión alta EZH2 puede beneficiarse de therapys que se dirigen a EZH2 [47].