Extracto
La reorganización del citoesqueleto de actina a través de la remodelación es un paso básico de la locomoción celular. Aunque la migración celular de las células normales y cancerosas puede ser estimulada por una variedad de factores intra y extracelulares, todas las trayectorias finales sobre la regulación de la actividad de la cofilina. Cofilina es una pequeña proteína de unión a actina capaz de obligar a ambas formas de actina globular y el filamento, y está regulada por la fosforilación en la serina 3. Como consecuencia de la fosforilación en la serina 3 cofilina está inactivo, por lo tanto no se puede unir moléculas de actina y la remodelación del citoesqueleto está deteriorado. El EZH2 histona metiltransferasa es frecuentemente sobreexpresado en muchos tipos de tumores, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC). EZH2 sobre la actividad, lo que resulta en epigenética la silenciación del gen, se ha asociado con muchas de las propiedades de tumores incluyendo la invasión, la angiogénesis y la metástasis, pero se sabe poco sobre los mecanismos moleculares por debajo. Aquí, nos informan de que EZH2 es capaz de controlar la actividad de la cofilina y en consecuencia la locomoción celular de líneas celulares de CRC a través de un novedoso eje no convencional que implica la señalización de integrina. De hecho, se muestra cómo la inhibición genética y farmacológica (DZNep y GSK343) de EZH2 función produce la fosforilación de la cofilina hiper y reduce la migración celular. Hemos demostrado anteriormente por la cromatina inmuno-precipitación que la integrina alfa 2 (ITGα2) expresión está regulada por EZH2. En el presente estudio nos proporcionan pruebas de que en las células EZH2-silenciado la actividad de señalización de la de-reprimidos ITGα2 es capaz de aumentar la fosforilación de la cofilina, que a su vez reduce la migración celular. Este estudio también propone nuevos mecanismos que podrían ofrecer nuevas estrategias contra la metástasis CRC para el tratamiento basado en la inhibición del factor epigenético EZH2 y /o su gen diana
Visto:. Ferraro A, T Boni, Pintzas A ( 2014) EZH2 Regula Cofilin Actividad y migración de las células del cáncer de colon por la orientación ITGA2 génica. PLoS ONE 9 (12): e115276. doi: 10.1371 /journal.pone.0115276
Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemania |
Recibido: 6 Agosto, 2014; Aceptado: noviembre 20, 2014; Publicado: December 30, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ferraro et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por las 7PM de la UE conceder FP7-241783 EpiDiaCan a AP
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que existen conflictos de intereses.
Introducción
migración de las células del tumor es esencial para la adquisición de la capacidad metastásica [1], [2]. competencia de la migración requiere la activación de vías que convergen en la polimerización de actina y polimerización de que accionan la formación de protuberancias de la membrana celular especiales como lamelipodia, invadopodios filopodios y señalización. dinámica de la actina está regulada por numerosas proteínas de unión a actina, entre ellos actina-despolimerización de los factores (ADF), cofilina-1 (tipo no muscular) y la cofilina-2 (tipo músculo) son aquellos que permiten la locomoción celular a través de la descrita anteriormente estructuras de membrana [3], [4]. Desde cofilina-1 es la forma más extendida de las proteínas de unión a la actina, en el presente estudio se analizaron únicamente este tipo, y en este documento nos referimos a ella como la cofilina. Cofilina activación es un paso clave para la migración de células tumorales [5], [6], aunque, lo más probable, es la actividad global de las vías cofilin-regulación que impulsan la movilidad de las células del cáncer [4]. Se conocen varios mecanismos de regulación de la cofilina [3], [4]. La mejor caracterizados son a través de la fosforilación en la serina 3 (p-cofilina) por LIM cinasa 1 y 2 (LIMK1, LIMK2) [7], por la proteína testicular quinasa 1 y 2 (TESK1, TESK2) [8], y por de-fosforilación 3 en la serina por la fosfatasa tirachinas (SSH) y chronophin [9], [10]. La fosforilación en la serina 3 inactiva cofilina, impidiendo su unión a los principales sustratos globular-actina (actina G) y el filamento-actina (F-actina) [11], mientras que la fosforilación des en la serina 3 permite la unión del sustrato y F-actina de corte . Varios mecanismos de señalización de control de funciones y, en consecuencia cofilin célula-forma y -locomotion. Se extienden de la familia Rho GTPasas pequeñas que actúan sobre LIMKs, a la señalización mediada por la integrina que actúa sobre TESK1 /2 [12]. fosfatasa SSH puede ser activado por F-actina, proteínas 14-3-3, PKDs y por PLCß /PI3K-GSK3 vía [12] de señalización.
reforzador de Zeste Homólogo 2 (EZH2) pertenece al grupo Polycomb familia [13] y es la subunidad catalítica del complejo histona metiltransferasa llamado Polycomb represiva Complex 2 (PRC2). PRC2 se une a los promotores de genes diana para la represión epigenética a través de di- o trimethylation de la histona H3 en la lisina 27 residuo (H3K27me2-3). EZH2 sobre-expresión se asocia, en muchos tumores agresivos [14], [15], con mal pronóstico [16] y la presencia de metástasis a distancia en el cáncer colorrectal (CCR) [17]. EZH2 regulación a la baja puede reducir el crecimiento del carcinoma invasivo de mama [18], la angiogénesis del tumor [19] y
in vitro de células
la migración /invasión de líneas celulares de CRC [17].
La arquitectura bien definida de los tejidos epiteliales, tales como la mucosa de colon, depende en gran medida en la expresión de moléculas de adhesión de la superficie celular específicos, tales como integrinas, que interactúan con la matriz extracelular (ECM) y las células vecinas. Los genomas de mamíferos codifican 18 α- y 8 subunidades β-integrina, que en combinación producir 24 heterodímeros diferentes de integrina (α-β-) sin funciones redundantes que van desde receptores de colágeno extracelular para señalar mediadores de transducción de [20]. Los cambios en la expresión de la integrina se producen en muchos tipos de cáncer y si integrinas sólo actúan como potenciadores tumorales o supresores de tumor todavía se discute. ITGα2 forma heterodímeros con ITGβ1 -α2β1- e interactúa con las fibras de colágeno de ECM [20]. Se ha informado de que la integrina α2β1 es capaz de bloquear la proliferación celular [21] - [23] y para suprimir la metástasis en ratones y seres humanos [24]. En el cáncer de próstata, la regulación ITGα2 abajo se ha propuesto como potencial marcador tumoral [25]. Recientemente hemos demostrado que reprime EZH2 epigenetically ITGα2 expresión [17]. Curiosamente, durante la caracterización de la línea celular EZH2 silenciados recientemente establecida (nombrado HCT-shez-2) se detectó, una notable hiper-fosforilación de la cofilina en HCT-shez-2 en comparación con las células parentales HCT116.
a pesar de que la función de la cofilina se ha descrito en la biología de las células tumorales, las redes de regulación que se integran factores epigenéticos, la desregulación de las vías de transducción de señales y la actividad de la cofilina están mal descritas. Aquí nos muestran que los controles de la histona metiltransferasa EZH2 cofilin fosforilación, y en consecuencia, la locomoción celular, a través de un novedoso camino que implica ITGα2 y su actividad de transducción de señales.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
Caco-2, DLD-1, HT-29, las líneas celulares HCT116 y RKO se mantuvieron en medio DMEM, que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina 1X, estreptomicina 1X, y 2 mM L-glutamina. Las células se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2 en atmósfera humidificada. Todas las líneas celulares utilizadas en el estudio han sido adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC). El procedimiento de clonación para la línea celular HCT-shez-2 se describe en Ferraro et. Alabama. [17].
blot y los anticuerpos Western
La proteína total se extrajo con 60 l de tampón de lisis RIPA y Western blotting se realizó de acuerdo con protocolos estándar. Las transferencias se incubaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios apropiados. Los anticuerpos utilizados: EZH2 BD Bioscience, EE.UU. código 612667; de Millipore, EE.UU. código H3K27me3 07-449; código de RAC-1 05-389; de Santa Cruz, Alemania: H3 total de códigos SC-8654; código tubulina sc-8035; ITGα2 código sc-74466; código RhoA sc-418; Rock1 código sc-17794; código Cdc42 sc-87; p-cofilina (serina 3) código sc-12912-R; cofilina sc-33779; código TESK1 sc-366681 (para aumentar la especificidad de anticuerpo TESK1 en ensayos de WB nitrocelulosa membranas blotting se corta horizontalmente entre ~ 60 y ~ 80 kDa). Los extractos de proteína se han preparado a partir de al menos dos experimentos independientes y borrones repetidas al menos dos veces.
microscopía confocal
Las células utilizadas para los ensayos de inmunofluorescencia se fijaron con solución de metanol /acetona (08:01), lavado, permeabilizaron con 0,3% Triton-X-100, y se bloquearon con 5% de BSA antes de la incubación con anticuerpos primarios o con Alexa Fluor 546 faloidina (Invitrogen EE.UU., código A22283). Los núcleos se counterstained con Hoechst.
Inhibidores y siRNA transfección
inhibidor de ROCK-1 (Y-27632 Sigma, EE.UU. código Y0503-1MG) se utilizó a una concentración final de 30 mM durante 24 horas . inhibidores de EZH2 (3-Deazaneplanocin A (DZNep) Santa Cruz, Alemania código SC-351856; GSK-343 Bioquímicos activos, Hong Kong código A-1416) se usaron a una concentración final de 1, 3 y 5 mM durante 48-72 horas . Para siITGα2 transfección, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se transfectaron con Lipofectamnine de 2000, siEZH2_4 y siEZH2_7 (Qiagen, códigos Alemania SI00063973, SI02665166) siITGα2 (Quiagen, códigos de Alemania SI02664081, SI02664088) y siRhoA (Dharmacon, EE.UU. código L-003860 -00 a 0005) se han utilizado a una concentración final de 50 micras, de conformidad con las instrucciones del fabricante.
cultivo tridimensional
para se utilizó en tres dimensiones la cultura Matrigel (BD, Bioscience) . cubreobjetos pre-revestidas con poli-lisina se pusieron en placas de 24 pocillos. Matrigel se diluyó con medio DMEM completo frío a una concentración final de 50%, 200 l se depositaron sobre cada cubreobjetos bien que contienen y la placa se incubó a 37 ° C durante 15 '. 0,5 × 10
3 se diluyeron las células en 100 l de DMEM frío y se mezclaron con 100 l de 100% de Matrigel. Los 200 l resultantes se añadieron a los pocillos con pre-calentado Matrigel. Placa se incubó en una atmósfera húmeda a 37 ° con 5% de CO
2 durante 3 días.
Migración de ensayo
Las células se trataron con tripsina, se lavaron con medio que contenía FBS al 1%, y se contaron . 10
5 células se sembraron en la cámara superior de un niño de 8 micras de poro del filtro Transwell (Corning), montado en una placa de 24 pocillos que contenía 10% de medio FBS. Los filtros se pre-recubiertas con fibronectina. Las células se dejaron migrar a 37 ° C, 5% de CO
2 de 36 a 40 h, se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,1% w /v de cristal violeta. Se observó cara inferior de los filtros con 40X se determinaron las células objetivas y migran en cada pocillo. Los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron dos veces. Para el ensayo de migración junto con siITGα2 transfección, las células se trataron con tripsina 24 horas después de la transfección, se siembran en transwell y se incubaron a 37 ° C durante otras 24 horas. Para el ensayo de migración, junto con inhibidor de Rock1, las células fueron sembradas en transwell en presencia del inhibidor y se incubaron a 37 ° C durante otras 24 horas.
globular (G) y el filamento (F-) ensayo de actina
80-85% confluente células se lavaron directamente en placas de petri de 15 cm dos veces con PBS a temperatura ambiente, por raspado en PBS y se sedimentaron. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 800 l de 37 ° tampón de lisis C (mM ATP 1, 50 TUBOS mM, pH 6,9, NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, EGTA 5 mM, 5% vol /glicerol vol y 0,1% vol /vol para: Nonidet P-40, Tween 20, y Triton X-100) suplementado con inhibidores de proteasa. Las células se homogeneizaron suavemente pipeteando 10 veces arriba y abajo y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Las muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 75 minutos a 22-25 ° C. Se retiraron los sobrenadantes para la determinación de G-actina. Pellets que contienen F-actina se mezclaron con 800 l de tampón RIPA y se sonicó en hielo durante 5 min (30 seg. ON /OFF 30 seg, potencia máxima) usando Bioruptor ultrasonicador (Diagenode, Bélgica) para disolverlos. Veinte microlitros de cada fracción se mezclaron con tampón de SDS-carga, se desnaturalizaron durante 8 minutos a 95 ° C y se cargaron en gel de poliacrilamida. detección de actina se realizó usando un anticuerpo monoclonal anti-actina (código sc-8432) adquirido de Santa Cruz, Alemania.
Extracción de ARN /transcripción inversa y Time-PCR real
Total de aislamiento de ARN a partir de células cultivadas se realizó utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). La transcripción inversa se llevó a cabo a partir de 3,0 g de ARN purificado utilizando el superíndice transcriptasa inversa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
cuantificación en tiempo real en el nivel de mRNA se llevó a cabo en 96 pocillos PCR placas usando un iCycler de Bio-Rad y el sistema de detección iQ5 Multicolor real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules CA, EE.UU.). Cada reacción contenía 1 × iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules CA, EE.UU.) y 150 nmol /L de cada cebador. Todos los genes se ensayaron por triplicado. Los resultados fueron analizados en el software iCycler. Los valores se normalizaron a GAPDH. Los cebadores usados fueron los siguientes: deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH): GAAGGTGAAGGTCGGAGT (Fw) y CATGGGTGGAATCATATTGGAA (Rv); TESK1:. GCCCTGACACACAATCAG (Fw) y AAGAGGTCTGACCGGCTTC (Rv)
GST pull-down ensayo
Para Rac1-GTP y desplegable ensayo CDC42 GTP-GST, las células fueron cultivadas en 10 cm de Petri platos y los lisados celulares se prepararon con tampón de lisis usado para el Western Blot. 50 g de extracto de proteína idéntica se incubaron con GST-PAK (quinasa activada por p21) a perlas de agarosa de glutatión durante 1 hora mediante la rotación a 4 ° C y perlas se lavaron 4 veces en tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7,4 ), NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, 1% (v /v) de Triton X-100, ditiotreitol 1 mM (DTT), 10 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina y PMSF 0,2 mM).
Resultados
Cofilin fosforilación aumenta al silenciamiento genético y la inhibición farmacológica de EZH2 en líneas celulares de CRC
previamente transfectaron células de carcinoma de colon HCT116 con un corto horquilla RNA (shRNA) vector que lleva un tallo de bucle oligonucleótido contra EZH2 mRNA. Los clones estables shEZH2 pantalla (HCTshEZ-2) muy baja cantidad de proteína EZH2, así como bajo trimethylation en la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3), el sustrato-EZH2 específica (Fig. 1A). Hemos informado de que HCTshEZ-2 células presentan una reducida capacidad migratoria e invasiva en comparación con las células (HCTshpSUP) HCT116 transfectadas parentales y simulacros [17]. Para identificar los factores potenciales que podrían controlar la locomoción celular de las células HCTshEZ-2, el análisis de la expresión de proteínas de factores que intervienen en la regulación de la dinámica del citoesqueleto como RhoA, CDC42, Rock1, RAC1, Cofilin y p-cofilina (efectores de la vía Rho GTPasa) han sido analizados por Western blot (WB). Como se informó en la Fig. 1B, el silenciamiento de EZH2 no afectó los niveles de expresión de proteínas de ninguno de los factores de actina-modulación analizados. Por el contrario, se detectó una notable hiper-fosforilación en la serina 3 de la pequeña cofilina proteína de unión a actina (Fig. 1B). Por otra parte, en HCTshEZ-2 células de silenciamiento de EZH2 no cambiaron la actividad GTPasa de CDC42 y RAC1 que fue evaluada utilizando GST-PAK tire hacia abajo de ensayo (S1 Fig.). También se investigó indirectamente la activación de RhoA potencial en HCTshEZ-2 células. Al silenciar RhoA con la tecnología siRNA se encontró que el nivel de p-cofilina se mantuvo igual en todas las líneas celulares (HCT116, HCTshpSUP y HCTshEZ-2). Por lo tanto, el agotamiento de expresión EZH2 no afectó a la actividad de RhoA y, por consiguiente fosforilación de la cofilina (S2A Fig.). Para demostrar que la hiperfosforilación observada de la cofilina no es un efecto fuera del objetivo del procedimiento de clonación, EZH2 se agotó transitoriamente con dos oligonucleótidos diferentes siRNAs en células HCT116 y RKO y 48 h después fueron analizados por WB niveles de p-cofilina. Como se muestra en la Fig. 1C para HCT116 y en S2B Fig. para RKO, transitoria silenciamiento EZH2 dio como resultado un significativo aumento de p-cofilina, así como de los niveles de ITGα2 en ambas líneas celulares.
A. Expresión de proteínas y la actividad metiltransferasa mundial de EZH2 en HCT116 y en HCTshEZ-2 clones estables, así como en las células de control HCTshpSUP mock analizados por WB. B. Análisis de la expresión de proteínas de la familia Rho GTPasa componentes y ITGα2 en HCT116, las células HCTshEZ-2 y HCTshSUP. C. agotamiento transitoria de EZH2 con dos oligos siRNA diferentes aumenta la fosforilación de manera similar a la cofilina silenciamiento estable. D. Fase de microscopía de contraste de imágenes HCT116, HCTshEZ-2 y HCTshSUP celulares fenotipos, barra de escala de 150 micras. E. imágenes representativas de microscopio confocal de fluorescencia en HCT116 y HCTshEZ-2 células, donde fue manchado p-cofilina (verde). Los núcleos han sido contrastados con Hoechst (azul). La barra de escala de tamaño de 150 micras. los niveles de proteína F. EZH2 se comparan con los niveles cofilin y p-cofilin en 7 líneas celulares de CRC. Números por debajo de manchas indican cuantificación banda que se realizó con un software dedicado y la expresión de tubulina como control de carga de referencia. Todos los experimentos WB se han repetido al menos tres veces, se presentan manchas representativos y cuantificaciones.
El efecto de la inactivación cofilina en las propiedades fenotípicas y el crecimiento de HCTshEZ-2 células es bien evidente en estándar de dos dimensiones cultura. De hecho, en HCTshEZ-2 células el número de protuberancias de la membrana celular es pobre, menos prominente y se pierde la forma alargada de las células HCT116 de control, siendo HCTshEZ-2 células más redondo y plano (Fig. 1D). Usando microscopía confocal y inmunoensayo fluorescente para mancha p-cofilina, confirmamos que inactiva p-cofilina se incrementa en las células HCTshEZ-2 en comparación con las células HCT116 parentales y que p-cofilina se localiza principalmente en el núcleo de HCT116, mientras que en HCTshEZ- 2 células p-cofilina se localiza tanto en el núcleo y en el citoplasma (Fig. 1E).
Para verificar si la relación entre EZH2 y p-cofilina es una característica general de las líneas celulares de CRC, se analizaron cofilina , los niveles de p-cofilin y expresión EZH2 en 7 líneas celulares de CRC. En estas 7 líneas celulares de CRC una comparación previa entre la proteína EZH2 y los niveles globales de su sustrato H3K27me3 mostró que las células que sobre-expresan EZH2 (HCT116, RKO y SW620) también presentan altos niveles de H3K27me3 (datos no mostrados, véase la ref. [17] ). Curiosamente, las líneas celulares con altos niveles de proteína EZH2 han demostrado casi indetectable (HCT116) o baja (SW620 y RKO) p-cofilina en comparación con las otras líneas celulares estudiadas, con la excepción de Caco-2 línea celular de adenoma intermedio (Fig. 1F ). Por el contrario, los niveles de la proteína cofilina (Total-cofilina) fueron sustancialmente los mismos a través de las líneas celulares estudiadas 7. Con el fin de cuantificar la correlación entre la expresión y la fosforilación de la cofilina EZH2 en todas las líneas celulares de CRC, con la excepción de Caco2, la intensidad absoluta de bandas EZH2 WB de la Fig. 1F se ha trazado frente a la intensidad absoluta de p-cofilina bandas WB utilizando un gráfico de dispersión. Un coeficiente de correlación negativa significativa (
R
= -0.7532) de la recta obtenida con los puntos de datos indica que los niveles de p-cofilin están inversamente correlacionados con respecto a los niveles de EZH2 en 6 de los 7 líneas celulares de CRC ( S3 Fig.).
a fin de validar Western blot datos p-cofilina y confirme que el p-cofilina no contribuye a la migración celular cuando está localizado en el núcleo, HCT116, HCTsh-EZ-2, HT29 (la más alta WB nivel de p-cofilina) y líneas de células RKO (bajo nivel de WB p-cofilina) se analizaron con microscopio confocal por la co-tinción p-cofilina con G-actina y por separado con Total-cofilina. Higo. 2A muestra que en las células HT29 tinción p-cofilina es alta en comparación con HCT116, HCT-shez-2 y RKO, confirmando los datos de balance de blancos. Por otra parte, el p-cofilina en las células HT29 se detectó exclusivamente en el citoplasma a diferencia HCT116, HCTshEZ-2 y células RKO líneas. En HT29, el mismo patrón citoplasmático se detectó también para el total-cofilina (foto HT29 solo plano en la Fig. 2B). Curiosamente, en HCT116, HCT-shez-2 y células RKO cofilina total se localiza principalmente en el citoplasma a diferencia de p-cofilina (Figs. 1E y 2B). En cuanto a G-actina, los experimentos de co-tinción señalaron que G-actina se localiza en el citoplasma así como en el núcleo de todas las líneas celulares. Hemos observado que el p-cofilina nuclear rara vez se co-localizar con G-actina en las células HCT116 y RKO, lo que demuestra que el p-cofilina no es capaz de unirse G-actina en el núcleo. Por otra parte, aunque las células HCT-2-shez deriva de HCT116 muestran p-cofilina también en el citoplasma de manera similar a las células HT29 caracterizadas por una baja capacidad migratoria (Fig. 2A).
A. HCT116, RKO, HCT-shez-2 y HT29 han sido co-teñidas con p-cofilina (verde) y G-actina (rojo) con el fin de estudiar la localización intracelular de ambas proteínas. Los núcleos se counterstained con Hoechst (azul). También se muestra una combinación de los tres colores (fusionar). Escala de barras de 10 micras. B. Cofilin (verde) en la tinción de las células CRC. Sólo las células HT29 presentan casi exclusiva localización citoplasmática como se muestra por un solo plano de la imagen confocal. Escala de barras de 50 micras. C. interrupción farmacológica de la proteína EZH2 por DZNep en CRC líneas celulares con expresión de la proteína EZH2 alta. D. La inhibición farmacológica de la actividad enzimática EZH2 por GSK343. Los bajos niveles de H3K27me3 en las células tratadas indican que la actividad GSK343 bloquea eficazmente EZH2. proteína de E. TESK1 (arriba) y la expresión del ARNm (abajo) análisis de las células con alta CRC (HCT116 y HCT-shpSUP) y silenciadas (b HCTsh-EZ-2A /) los niveles de proteína EZH2. F. siRNAs frente ITGα2 mRNA se han utilizado para reducir la expresión de la proteína ITGα2. Los efectos de silenciamiento ITGα2 en cofilina y p-cofilina se analizaron mediante WB. Números por debajo de manchas indican cuantificación banda que se realizó con un software dedicado y la expresión de tubulina como control de carga de referencia. Para la cuantificación p-cofilina en HCT116 y HCT-shez-2 células todos los valores se han normalizado con respecto al valor de p-cofilina de HCT116 no transfectadas. Todos los experimentos WB se han repetido al menos dos veces y se muestra manchas representativas.
La relación entre EZH2 y p-cofilina también se estudió mediante el bloqueo de la actividad de metil-transferasa de EZH2 con dos inhibidores de la EZH2 3 -Deazaneplanocin a (DZNep) y GSK-343 [26], [27] en las líneas celulares donde EZH2 es altamente expresado: HCT116, SW620 y RKO. DZNep tratamiento interrumpido proteína EZH2 en todas las líneas celulares resultantes de la subasta p-cofilina sin afectar a la expresión total de la cofilina (Fig. 2C). Se obtuvieron resultados similares con el tratamiento GSK-343, que bloquearon con eficacia la función enzimática de EZH2, ya que se observó una notable reducción global de marca H3K27me3 en las células tratadas, sin afectar EZH2 y expresión cofilina niveles, a pesar de cofilina fosforilación (Fig. 2D).
Los ITGα2-meta-gen EZH2 en parte controla cofilin fosforilación /de-fosforilación en líneas celulares de CRC
Por la cromatina inmunoprecipitación (Chip) hemos demostrado anteriormente [17] que hiper EZH2 methylates la lisina 27 de la histona H3 en el promotor del gen que causa ITGα2 epigenética de genes de la represión (fig. 1B). Curiosamente, TESK1, una quinasa capaz de fosforilar la cofilina en la serina 3 y por lo tanto capaz de regular su actividad, puede ser activado por la señalización mediada por la integrina [8], [28], que propone vía ITGα2 como candidato para análisis adicionales. La actividad de señalización de-reprimido de ITGα2 través TESK1 puede ser responsable, al menos en parte, para la mejora de p-cofilina en células EZH2-silenciada. Para verificar esta hipótesis, primero Real-Time PCR y análisis WB se realizaron para verificar la expresión de TESK1 en el sistema de línea de células de CRC utilizado para el estudio. Se muestra (Fig. 2E) que TESK1 se expresó en células HCT116 y que el silenciamiento de EZH2 no afectó a su expresión ya que no se han detectado cambios TESK1 mRNA y los niveles de proteína entre células control y EZH2-silinced. A continuación, para abordar el papel de ITGα2 sobre la vía cofilina, se utilizaron pequeñas oligos de ARN de interferencia frente a ITGα2 (siITGα2) para reducir ITGα2 expresión en células HCTshEZ-2 y de control de HCT116. Curiosamente, la reducción del nivel de proteína ITGα2 afectada negativamente p-cofilina principalmente en HCTshEZ-2 células (Fig. 2E). Se obtuvieron resultados comparables también después del tratamiento de las células DLD1 con siITGα2. DLD1 expresan altos niveles de proteína en comparación con ITGα2 HCT116 (Fig. 2E) [17].
Célula de tratamiento con los inhibidores de la EZH2 también presentó pruebas de la novela propuesto mecanismo epigenético de la regulación p-cofilina. Como se muestra en la Fig. 2C y 2D, DZNep y GSK-343 tratamientos eficiente de-reprimidos gen ITGα2 en HCT116, RKO y las células SW620, que se caracterizan por la expresión ITGα2 baja [17]. De hecho, EZH2 inhibidores de tratamientos como resultado un notable incremento de p-cofilina en células HCT116 y SW620, y tenían menos, pero todavía considerable efecto sobre los niveles de p-cofilin en células RKO.
organización del citoesqueleto tridimensional y la migración la capacidad de las líneas celulares de CRC son controlados por la fosforilación de la cofilina
Los cambios morfológicos que se producen cuando HCTshEZ-2 células se siembran en matrigel (cultivo tridimensional, 3D) indican que la vía cofilina también puede ser responsable de las propiedades de adhesión cruciales para la diseminación metastásica de células. células HCT116 y HCTshEZ-2 cultivadas en 3D han sido teñidas con faloidina, que se une F-actina, conjugado con un compuesto químico fluorescente y se analizaron con microscopía confocal de fluorescencia (Fig. 3A). En HCTshEZ-2 células inactivo p-cofilina estabiliza las estructuras de actina necesarias para la interacción con el ECM. De hecho, después de 3 días en matrigel, HCTshEZ-2 células mostraron una célula-cuerpo plano, los núcleos claramente visibles y, más importante, una sola monocapa de células con los filamentos de actina bien visibles (flechas en la Fig. 3A). En contraste, las células HCT116 no mostraron altos niveles de F-actina y las células fueron capaces de crecer como una esfera del tumor.
A. F-actina se tiñó con phalloin conjugado con un fluoróforo (rojo) en las células HCT116 y HCTshEZ-2 cultivadas en Matrigel. Representativos imágenes de microscopía de contraste de fases de las mismas culturas también se presentan para cada línea celular. Las flechas indican las moléculas de actina F largos. La barra de escala 20 micras. B. Análisis de la cantidad relativa de F y G-actina en las células de CRC con elevada (HCT116 y HCT-shpSUP) y silenciadas (b HCTsh-EZ-2A /) los niveles de proteína EZH2. La intensidad de las bandas de BM se ha cuantificado y la proporción se calcula en unidades arbitrarias. blot Representante de F y G-actina también se muestra para cada línea celular. se utilizó la t de Student para evaluar la significación estadística (*** = p-valor & lt; 0,01) entre las células /b HCTsh-EZ-2a y células HCT116. C. Migración capacidad de las líneas celulares transfectadas con CRC siITGα2. D. Análisis de los niveles de WB p-cofilin en células CRC con elevada (HCT116 y HCT-shpSUP) y silenciado proteína (HCTsh-EZ-2) EZH2 tratados con inhibidor Rock1 (Y27632) en comparación con las células no tratadas. E. Migración capacidad de las líneas celulares de CRC tratados con inhibidor Rock1 (Y27632) en comparación con las células no tratadas.
Para verificar mejor la redistribución de los filamentos de actina en células HCTshEZ-2, G-actina y F- actina fueron diferencialmente aislado de HCTshEZ-2 células, así como de las células de control cultivadas en cultivo 2D estándar. Como se muestra claramente en la figura. 3B niveles de F-actina en HCTshEZ-2 células eran mucho más abundantes que en las células HCT116 de control. De hecho, el /relación de G-actina medio F-actina fue de aproximadamente 3,5 veces mayor en HCTshEZ-2 células en comparación con los controles. Por último, para demostrar que la inactivación aberrante de los ejes ITGα2-cofilin, mediada por la EZH2, aumenta la migración de células tumorales se midió la capacidad migratoria de HCT116, HCTshSUP, HCTshEZ-2 y células DLD1 después ITGα2 silenciamiento. Como ya se ha mostrado en la fig. 2D y se discutió anteriormente, siITGα2 redujeron de manera eficiente la expresión de ITGα2 en todas las líneas celulares analizadas con la consiguiente reducción de la fosforilación de la cofilina que exacerba la facturación F-actina /G-actina. Cabe destacar que, principalmente en siITGα2 HCTshEZ-2 y células DLD1 aumento de la capacidad de migración en aproximadamente un 25% y 12%, respectivamente, confirmando que el eje ITGα2-cofilina EZH2-silenciado es importante para la locomoción celular de cáncer (Fig. 3C). Resultados comparables se han obtenido también con el ensayo de curación de heridas (S4 Fig.).
El papel central de p-cofilina en la dinámica de actina y la migración de células se confirmó también por una inhibición farmacológica de la actividad Rock1, que no implica manipulación de la expresión ITGα2. Específicamente, se utilizó inhibidor Rock1 Y-27632 para bloquear la fosforilación de la cofilina [29]. Rock1 inhibidor redujo p-cofilina en HCT116, HCTshpSUP y líneas celulares HCTshEZ-2 (Fig. 3D). Reducción de p-cofilina mejora la fracción de la cofilina activa que se tradujo en una ganancia de capacidad de migración principalmente en HCTshEZ-2 (Fig. 3E). Estos resultados demuestran que en las células de CRC la relación de p-cofilina /cofilina es crucial para la propagación de células de cáncer y que ITGα2 puede regular la cofilina también a través de vías de señalización que implican Rock1.
Discusión
Diferentes mecanismos tienen ha descrito para explicar la actividad pro-metastásico de la histona metiltransferasa EZH2 en diversos tipos de cáncer [30] - [32], pero se sabe poco sobre su papel en relación con CRC. En el presente estudio, hemos investigado este problema utilizando un enfoque de pérdida de la función de evaluar el papel de la EZH2 modificador de la histona en la migración celular CRC. En concreto, nos aprovechamos de la posibilidad de caracterizar una línea celular de CRC (HCT-shez-2) donde EZH2 se silencia de forma permanente y de un nuevo compuesto capaz de inhibir específicamente la actividad metiltransferasa EZH2, llamado GSK-343, así como un compuesto capaz de perturbar el complejo PRC2, llamado DZNep. Se muestra que en esta línea celular EZH2 controla epigenetically locomoción celular, manteniendo la cofilina constantemente activo. De hecho, después de la inhibición genética y farmacológica de EZH2, se aumentó la fosforilación de la cofilina en la serina 3. La cofilina fosforilada-serina-3 está inactivo. Como consecuencia de la inactivación cofilina, invadopodios montaje en el borde delantero de la migración de células, así como el desmontaje en el del lado de la célula de nuevo, no puede ser modulada, lo que resulta en una reducción de la locomoción celular [3], [6]. Esto puede explicar la notable movilidad celda de reducción de HCT-shez-2 en comparación con las células HCT116 los padres [17]. Se excluyó la acción directa de silenciamiento EZH2 en los componentes en fases anteriores de la vía de la cofilina. De hecho, no hay cambios en la expresión de la proteína y la actividad se han detectado por WB, GST-PAK tire hacia abajo y ensayos de siRNA para, CDC42, RAC1, RhoA, Rock1, así como la cofilina totales en HCT-shez-2 células con respecto a las células control. Para confirmar la hipótesis de que la EZH2 regula la migración celular a través de un eje biológico alternativo y no mediante la represión de los componentes de la familia Rho GTPasa, tratamos de investigar sobre el papel del gen ITGα2. De hecho, ITGα2 está regulada directamente por la EZH2 [17] y, potencialmente, puede actuar sobre la vía cofilina. En consecuencia, los estudios anteriores han demostrado que TESK1 es capaz de fosforilar la cofilina en la serina 3 y, en particular TESK1 pueden ser activados por la señalización mediada por la integrina [8], [28]. PCR cuantitativa y análisis WB revelaron que TESK1 se expresa en la línea celular HCT116 y que el silenciamiento EZH2 no cambió TESK1 nivel de expresión. Se demuestra además que ITGα2 es el principal regulador de la fosforilación de la cofilina silenciando proteína ITGα2 en HCT116, HCT-shez-2 y en las células DLD1. De hecho, después de ITGα2 silenciamiento de los niveles de p-cofilin se reducen, lo que demuestra una relación directa entre ITGα2 y p-cofilina posiblemente mediado por TESK1, aunque no podemos excluir la participación de otras quinasas dirigidas por integrinas. [35].