Extracto
El reforzador de la proteína Zeste 2 (EZH2) ha informado de estimular el crecimiento celular en algunos tipos de cáncer y por lo tanto se considera que representan una interesante nueva objetivo para la intervención terapéutica. A continuación, se investigó un posible papel de la EZH2 para el control del crecimiento de células de cáncer de colon. ARN de interferencia (RNAi) mediada por el agotamiento intracelular EZH2 dado lugar a la detención del ciclo celular de las células de carcinoma de colon en la transición G1 /S. Esto se asoció con una reducción del número de células después de la transfección transitoria de sintético
EZH2
-targeting siRNAs y con la inhibición de su capacidad de formación de colonias después de la expresión estable de siRNAs por vectores. Por otra parte, si la prueba EZH2 puede reprimir a la
p27
gen inhibidor del crecimiento, como se informó para el cáncer de páncreas. Sin embargo, la expresión de los análisis de las líneas celulares de cáncer de colon y biopsias de cáncer de colon no reveló una correlación consistente entre EZH2 y los niveles de p27. Por otra parte, el agotamiento de EZH2 no volver a inducir
p27
expresión en células de cáncer de colon, lo que indica que
p27
represión por parte de la EZH2 puede haber célula o tejido específico. Todo el transcriptoma genoma análisis de genes celulares identificados afectadas por el agotamiento de EZH2 en líneas celulares de cáncer de colon. Ellos incluyen varios genes asociados con el cáncer vinculados a la proliferación celular o invasión, como
DAG1
,
MageD1
,
SDC1
,
TIMP2
, y
Tob1
. En conclusión, nuestros resultados demuestran que los bloques de agotamiento EZH2 el crecimiento de células de cáncer de colon. Estos resultados podrían proporcionar beneficios para el tratamiento del cáncer de colon
Visto:. Fussbroich B, N Wagener, Macher-Goeppinger S, A Benner, Fälth M, Sültmann H, et al. (2011) EZH2 agotamiento Bloquea la proliferación de células de cáncer de colon. PLoS ONE 6 (7): e21651. doi: 10.1371 /journal.pone.0021651
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: February 2, 2011; Aceptado: 4 Junio 2011; Publicado: 13 Julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Fussbroich et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El reforzador de Zeste Homólogo de proteína 2 (EZH2) es un componente central de la Polycomb represivas Complex2 (PRC2) y modifica la transcripción a nivel epigenético al afectar histonas y la metilación del ADN [1]. EZH2 se sobreexpresa en varios tumores malignos, incluidos los principales cánceres humanos, tales como cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de cuello uterino o [2] - [6].
Hay evidencia experimental de que
EZH2
puede contribuir directamente a la carcinogénesis, actuando como un
de buena fe
oncogén. En concreto, para ciertas entidades de cáncer, se ha informado de que EZH2 estimula la proliferación celular, bloquea la apoptosis, promueve la invasión celular y la metástasis, se activa la angiogénesis tumoral, e induce tumores en modelos de ratón [2] - [11]. Estos hallazgos sugieren que la inhibición EZH2 puede representar una nueva estrategia atractiva para la terapia del cáncer epigenético [1], [12].
Más recientemente, sin embargo, también hay datos que sugieren que EZH2 podría actuar como una proteína supresora de tumores en ciertos tejidos [13]. inactivante homocigótica
se detectaron EZH2
mutaciones en una parte de las neoplasias mieloides [14], [15], aumentando la posibilidad de que EZH2 puede o bien ejercer actividades pro- o anti-oncogénicos, de una manera dependiente del tipo de célula [ ,,,0],dieciséis]. Otro nivel de complejidad se añade por la detección de heterocigotos
EZH2
mutaciones en una parte de los linfomas de origen del centro germinal [13]. En este caso, la proteína mutante parece aumentar el nivel de H3K27 metilación, un objetivo corriente abajo crítica de EZH2, al actuar conjuntamente con la proteína de tipo salvaje expresada a partir del alelo no mutado [17].
El cáncer colorrectal es la cuarta forma de cáncer más común en los seres humanos. Cada año, más de 1.200.000 personas desarrollará la enfermedad y más de 600.000 morirán por su causa [18]. A pesar de la gran importancia biomédica de este tumor, las investigaciones de la situación EZH2 y la función de las células de cáncer de colon son escasos y en parte contradictorios. Por ejemplo, mientras que EZH2 se informó de forma consistente que se sobreexpresa en los cánceres de colon, EZH2 niveles de expresión de una correlación positiva [19], negativamente [20], [21], o nada en absoluto [22], con la supervivencia de pacientes con cáncer de colon. Por otra parte, hasta donde sabemos, sólo un estudio funcional investigó el papel de EZH2 para el crecimiento de células de cáncer de colon, pero no pudo ver un efecto sobre
EZH2
silenciamiento de los genes [22]. Este hallazgo está en fuerte contraste con el papel de promoción del crecimiento de EZH2 reportado para varias otras entidades de cáncer [2] - [6]. En el presente trabajo, hemos abordado este problema mediante el análisis de la expresión de EZH2 en las células de cáncer de colon
in vitro
y
in vivo
, y mediante la investigación de la contribución de la EZH2 para el crecimiento de líneas celulares de cáncer colorrectal .
resultados
Expresión de EZH2 en las células de cáncer de colon
in vitro
y ARN de interferencia mediada por
EZH2
represión
para investigar la expresión de EZH2 en células de cáncer de colon
in vitro
, se analizaron un grupo de doce de colon líneas celulares de cáncer derivadas de tumores por inmunotransferencia y QRT-PCR. Todas las líneas celulares ensayadas expresaron cantidades fácilmente detectables de proteína EZH2 (Figura 1A) y
EZH2
mRNA (Figura 1B). Para la posterior interferencia de ARN (ARNi) analiza, se generaron tres siRNAs sintéticos dirigidos a diferentes regiones del
EZH2 Versión taquigráfica. Los tres siRNAs bloqueados de manera eficiente la expresión de EZH2 (Figura 1C). Desde potenciales fuera de objetivo efectos de siRNAs individuales pueden reducirse mediante la puesta en común de siRNA [23], [24], también a prueba un grupo integrado por los tres
EZH2
-targeting siRNAs. Esta piscina siRNA también bloqueó eficazmente la expresión EZH2 (Figura 1C) y fue utilizado para los análisis funcionales adicionales.
Un análisis por inmunotransferencia de la expresión de la proteína EZH2. Tubulina, control de carga. analiza B QRT-PCR de
EZH2
la expresión del ARNm. Los datos se presentan como diferencias de veces en la expresión de genes, normalizados con el índice del gen de mantenimiento. desviaciones estándar de dos réplicas de transcripción inversa se indican. C Modulación de la expresión de la proteína EZH2 por RNAi. expresión EZH2 se determinó mediante análisis de inmunotransferencia de 48 horas después de la transfección con
EZH2
-targeting siRNAs o siRNAs de control, como se indica. siEZH2pool: agruparon
EZH2
-targeting siRNAs. Tubulina, control de carga.
EZH2
resultados represión en la detención de G1 y la inhibición del crecimiento de células de cáncer de colon
A continuación, probamos el efecto de RNAi mediada
EZH2
represión sobre el crecimiento de células de cáncer colorrectal HCT116, LoVo, y DLD1. siRNA-tratamiento resultó en una fuerte reducción de los niveles de EZH2 en todas las líneas celulares de carcinoma de colon probado y, como se informó anteriormente para otras células [7], en una disminución concomitante de la expresión de ciclina D1 (Figura 2A).
A Inmunoblot análisis de, células DLD1, y LoVo HCT116 que muestra regulación a la baja eficiencia de la expresión de EZH2 por RNAi. los niveles de ciclina D1 se indican. Tubulina, control de carga. ciclo de la célula B se analizan por FACS. Las células fueron tratadas con dos siRNAs control o con el
EZH2
-targeting siRNAs. Los porcentajes de células en el G1, S, o G2 /M fases del ciclo celular se indican. C Compilación de los análisis del ciclo celular a partir de tres experimentos independientes. Las desviaciones estándar se indican. Los asteriscos iguales p = 0.05, dos asteriscos igual p≤0.01, N. S. no es significativo. analiza
ciclo celular de células activadas por fluorescencia (FACS) se llevaron a cabo en paralelo. Ellos revelaron un aumento estadísticamente significativo en las poblaciones G1 y la consecuente disminución de las poblaciones de fase S, al
EZH2
represión. curvas de FACS típicos se muestran en la Figura 2B, una recopilación de los resultados de tres experimentos independientes se representa en la Figura 2C. Estos resultados indican que
EZH2
represión induce la detención del ciclo celular en la transición G1 /S frontera y por lo tanto puede actuar antiproliferativo en células de cáncer de colon.
Para seguir haciendo frente a este problema, los análisis de recuento de células de cáncer de colon se realizaron líneas celulares. RNAi mediada por la inhibición de la
EZH2
expresión dio lugar a una reducción significativa del número de células, que era claramente visible 48-72 horas después de la transfección de siRNAs sintéticos (Figura 3A), lo que indica que
EZH2
silenciamiento como resultado la inhibición del crecimiento de células de cáncer de colon.
a Los recuentos de células después de la transfección transitoria con el control de siRNA sintético (sicontr-1) o
EZH2
-targeting siRNAs (piscina siEZH2). Los gráficos representan el número de células relativos, en los puntos de tiempo indicados después de siRNA transfección. El número de células en la transfección (punto 0) el tiempo se establecieron como 1,0. Los experimentos se realizaron por triplicado, las desviaciones estándar se indican. Los asteriscos iguales p = 0.05, N. S. insignificante. ensayos de formación de colonias B. HCT116, LoVo, células DLD1, y RKO fueron transfectadas establemente con plásmidos que expresan shRNAs dos diferentes contra el
EZH2 gratis (pCEP-shEZH2-1, pCEP-shEZH2-2) o dos shRNA de control (pCEP-shLuc o pCEP- shcontr-1). Los experimentos se repitieron de forma independiente al menos tres veces, con resultados consistentes.
Para validar el efecto antiproliferativo de
EZH2
inhibición en células de cáncer de colon mediante un método independiente, hemos realizado ensayos de formación de colonias. Dos diferentes
EZH2
siRNAs -targeting se expresaron de manera estable a partir de vectores de expresión seleccionables en HCT116, las células LoVo, DLD1, y RKO, de 13 a 15 días. Tanto
EZH2
siRNAs -targeting condujo a una clara reducción de la capacidad de formación de colonias de todas las líneas celulares de cáncer de colon ensayados frente a las células tratadas con siRNA de control (Figura 3B). Aspectos morfológicos, perfiles de FACS, y la terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) análisis no proporcionó evidencia de aumento de la apoptosis de las células de cáncer de colon en RNAi mediada por
represión EZH2
(datos no mostrados).
en conjunto, estos resultados indican que el agotamiento de la EZH2 induce la detención del ciclo celular en la fase G1 e inhibe el crecimiento de células de cáncer de colon.
Tejido serie de análisis de expresión Micro EZH2 en los adenomas de colon y cánceres
estudios anteriores han demostrado que EZH2 se sobreexpresa significativamente en los cánceres de colon en comparación con tejido normal de colon [19] - [22]. Sin embargo, los datos que comparan la expresión EZH2 en los adenomas benignos de colon en comparación con el cáncer de colon es, hasta donde sabemos, aún no están disponibles. Para ello hemos realizado análisis de inmunohistoquímica empleando un microarray de tejido que abarca 24 adenomas, 25 carcinomas G1, G2, 24 carcinomas y 24 carcinomas G3. En comparación con los adenomas de colon, la expresión de EZH2 fue significativamente mayor en carcinomas de colon (Figs. 4A y 4B). Los análisis de los cánceres de colon que representan diferentes grados de desdiferenciación histológica (aumento de G1-G3) reveló una tendencia a un aumento adicional de la expresión de EZH2 para los cánceres menos diferenciados, los cuales, sin embargo, no fue estadísticamente significativa (Figura 4B).
Un análisis inmunohistoquímico de los adenomas de colon y biopsias de cáncer de colon que representan grados crecientes de desdiferenciación histológica (G1-G3). Las flechas negras: carcinoma; flechas blancas: el tejido conectivo. Las barras de escala, 50 m. parcela B Caja de expresión de la proteína EZH2. Los niveles de expresión de EZH2 se incrementaron significativamente en carcinomas en comparación con adenomas (p & lt; 0,001). Las diferencias de expresión entre EZH2 G1, G2, G3 y los carcinomas no fueron significativas (p = 0,185).
EZH2 y la expresión de p27 no se correlacionan en el cáncer de colon
El dependiente de ciclina p27 inhibidor de quinasa (también llamado Kip1) es una proteína inhibidora del crecimiento que bloquea la progresión del ciclo celular en la transición G1 /S [25]. En los cánceres de colon, los niveles de p27 son con frecuencia baja [26], [27]. Curiosamente, se informó recientemente de que el agotamiento de la EZH2 llevó a p27 re-expresión en células de cáncer de páncreas, lo que indica que la EZH2 puede contribuir a la proliferación de células tumorales mediante la represión de
p27
[4]. En vista de nuestros resultados que EZH2 promueve la proliferación celular y estimula G1 /S progresión del ciclo celular de las células de cáncer de colon, se abordó la cuestión de si
p27
es reprimida por la EZH2 en el cáncer de colon también.
inmunohistoquímico análisis revelaron que los cánceres de colon expuestas disminuyó significativamente p27 nuclear y una tendencia para los niveles de proteína citoplasmática de p27 reducidas (Figura 5A), en comparación con los adenomas de colon. Dentro del grupo de cáncer, cada vez mayores grados de desdiferenciación de las células cancerosas (G1-G3) mostraron una tendencia estadísticamente no significativa a una mayor disminución de la expresión de p27 (Figura 5A). En general, estos resultados son opuestos a los resultados obtenidos para la expresión EZH2 (Figura 4B), aumentando la posibilidad de que los niveles de EZH2 pueden correlacionarse negativamente con los niveles de p27. Sin embargo, EZH2 y los niveles de p27 no se correlacionaron significativamente en los cánceres individuales (n = 68) en una base por paciente, es decir en los tumores derivados del mismo paciente (Figura 5B). Esta falta de asociación aplicado para el análisis de la EZH2 asciende en relación tanto con los niveles de expresión de p27 nucleares o citoplasmáticas (correlación de rangos de Spearman r = 0,187, p = 0,572 y r = -0.0623, p = 0,613, respectivamente).
a Box parcelas de expresión de la proteína p27 nuclear y citoplasmática en los adenomas y carcinomas de colon (G1-G3). Los niveles de expresión de p27 nuclear fueron significativamente inferiores en carcinomas que en adenomas (p = 0,026), los niveles de p27 citoplasmáticos mostraron una tendencia similar, lo que, sin embargo, no fue estadísticamente significativa (p = 0,173). Las diferencias de expresión de p27 entre G1, G2, G3 y los carcinomas no fueron significativas. B La tinción inmunohistoquímica de muestras pareadas de los cánceres de colon no reveló una correlación significativa entre la EZH2 y los niveles de expresión de p27. Ejemplos de 4 cánceres diferentes (I-IV) teñidas para EZH2 (paneles superiores) y p27 (paneles inferiores), respectivamente. Las barras de escala, 50 micras.
En línea con estos
hallazgos in vivo, los niveles basales de expresión de la proteína EZH2 no se correlacionó con las concentraciones de proteína p27 o mRNA en células de cáncer de colon líneas
in vitro gratis (Figura 6A y 6B). También se investigó si los niveles de expresión de p27 se ven afectados por el agotamiento de EZH2 en HCT116, LoVo, y las células de cáncer de colon DLD1. Si EZH2 expresión de p27 bloques, el silenciamiento de
EZH2
debe estar vinculado a un re-aumento de la expresión de p27, como se ha observado en las células de cáncer de páncreas [4]. En contraste, sin embargo, la inhibición eficaz de la expresión de EZH2 no se asoció con un aumento sustancial de la expresión de p27, ni en la proteína (Figura 6C), ni en el nivel de mRNA (Figura 6D), en células de cáncer de colon. estudios de fraccionamiento celular revelaron que p27 está prácticamente localizada exclusivamente en el citoplasma, en HCT116, células LoVo, y DLD1. Esta distribución subcelular también no se alteró de forma detectable por el agotamiento de la EZH2 (Figura S1).
Un EZH2 y expresión de la proteína p27 en líneas celulares de cáncer de colon, evaluada mediante análisis de inmunotransferencia. Tubulina, control de carga. B
expresión de p27 mRNA, medido por QRT-PCR análisis. Los datos se presentan como las veces las diferencias en la expresión génica, normalizados con el índice del gen de mantenimiento. desviaciones estándar de dos réplicas de transcripción inversa se indican. C inmunotransferencia analiza después de EZH2 agotamiento de RNAi. los niveles de EZH2 y p27 se indican. Tubulina, control de carga. D analiza QRT-PCR después de EZH2 agotamiento de RNAi.
p27
y
EZH2
niveles de mRNA se indican en relación con las células sicontr-1-tratado (arbitrariamente fijado en 1.0). Las desviaciones estándar de tres experimentos independientes se indican.
Los análisis Transcriptome de células de cáncer de colon sobre el agotamiento de la EZH2
Con el fin de identificar posibles genes diana afectados por el agotamiento de EZH2 en las células de cáncer de colon, transcriptoma se realizaron análisis. Con este fin, se trataron las células LoVo y DLD1 ya sea con el siRNA piscina silenciamiento
EZH2
expresión o con el control de siRNA. Los cambios en los niveles de expresión de genes celulares se evaluaron mediante el uso de un microarray de todo el genoma de aproximadamente 25.000 genes. Hemos observado cambios significativos de 2.235 genes en DLD1 (1.095 upregulated, 1.140 downregulated) (Tabla S1) y de 379 genes en LoVo (280 upregulated, 99 downregulated) (Tabla S2). La superposición consistió de 139 genes que se vieron afectados por el agotamiento de EZH2 en ambas líneas celulares de cáncer de colon (100 Upregulated, 39 downregulated). Un mapa de calor visualizar estos 139 genes regulados diferencialmente se proporciona en la figura 7A, que indica una alta concordancia entre las réplicas biológicas. Una lista detallada de estos genes se proporciona en la Tabla S3.
A-Venn Diagrama y mapas de calor de 139 genes que se vieron afectados de manera significativa en el nivel de transcripción por el agotamiento de EZH2 en las células LoVo y DLD1. Mapas de calor se generaron utilizando la agrupación jerárquica. Las células fueron tratadas ya sea con o siEZH2pool sicontr-2. Cuatro repeticiones biológica se analizaron para cada muestra. genes significativamente upregulated genes se indican en amarillo, downregulated significativamente en azul. B QRT-PCR análisis para evaluar la expresión de cinco genes que se vieron afectados por el agotamiento de EZH2 en el análisis del transcriptoma (ver arriba). Se indican los resultados de tres experimentos independientes llevados a cabo en células DLD1. los niveles de ARNm se muestran respecto a las células sicontr-2-tratado (arbitrariamente fijado en 1.0). Las desviaciones estándar se indican. Los asteriscos iguales p = 0.05, dobles asteriscos igual p≤0.01.
anotación funcional de los 139 genes de Ingenuity Pathway Analysis reveló que 37 productos de los genes se han asociado con el cáncer (Tabla 1). Con respecto de las funciones moleculares y celulares, se encontró que el agotamiento de EZH2 afectar a varios genes implicados en el control del desarrollo celular, el control del crecimiento, movimiento celular, y la señalización (Tabla 1).
Para validar la matriz de datos, se analizó la expresión de 5 genes asociados con el cáncer, que fueron inducidos por el agotamiento de EZH2 en el transcriptoma análisis, por QRT-PCR: (i)
DAG1 gratis (Dystroglycan 1) que codifica una molécula de adhesión, que se underexpressed frecuentemente en cáncer de colon [28], (ii)
MageD1
(familia antígeno de proteína-D1 asociado al melanoma) que codifica un inhibidor de la proliferación y la invasión de células tumorales [29], (iii)
SDC1
(sindecano 1), que codifica un proteoglicano de superficie celular que inhibe la invasión de células [30], (iv)
TIMP2
(TIMP metalopeptidasa inhibidor 2), que codifica un inhibidor de metaloproteinasas de la matriz cuya regulación a la baja se correlaciona con la invasivo potencial de las células de cáncer de colon LoVo [31], y (v)
Tob1
(transductor de erbB2), que codifican una proteína antiproliferativa con supresor tumoral potencial [32]. Como se observa para el microarray, los 5 genes también fueron significativamente inducida por el agotamiento de EZH2 en el análisis de QRT-PCR (Figura 7B), lo que corrobora aún más los datos del transcriptoma.
Discusión
En el presente estudio , se muestra que el agotamiento de EZH2 en células de cáncer de colon (i) reduce la progresión del ciclo celular en la transición G1 /S límite, (ii) disminuye el número de células en los ensayos de crecimiento a corto plazo, y (iii) bloquea el crecimiento celular en ensayos de formación de colonias a largo plazo . Estos resultados son consistentes con un papel de promoción del crecimiento de EZH2 en el cáncer de colon y están en contraste con un informe reciente que indica que el crecimiento de células de cáncer de colon no se ve afectada por el agotamiento de EZH2 siRNA mediada [22].
Una posible explicación de esta discrepancia puede estar relacionada con los ensayos utilizados para medir el crecimiento celular. El estudio anterior se basó en el ensayo MTT que mide una actividad metabólica (reducción de MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio a formazán) [22]. Este ensayo puede verse afectada por muchas condiciones, por ejemplo, cambios metabólicos, y pueden conducir a la subestimación de los efectos inhibidores del crecimiento [33] - [35]. por el contrario, en el presente estudio, los efectos antiproliferativos siguientes
EZH2
silenciamiento se observó consistentemente en tres ensayos independientes. Nuestros hallazgos indican que tanto la EZH2 estimula la proliferación de células de cáncer de colon, como ha sido reportado por varias otras entidades de cáncer [2] -. [9], [11]
los mecanismos moleculares exactos de cómo EZH2 estimula la proliferación celular aún no se conocen. Como un componente crucial del complejo PRC2 represor transcripcional, EZH2 puede conducir a la represión de los genes antiproliferativos. un interesante estudio reciente demostró que la EZH2 conduce a la represión del inhibidor del crecimiento
p27
gen regulador del ciclo celular en células de cáncer de páncreas [4]. Puesto que los actos de p27 en la transición G1 /S - que nos pareció verse afectada por
EZH2
silenciamiento en células de cáncer de colon - y puesto que los niveles de p27 son con frecuencia baja en los cánceres de colon [26], [27], hemos probado una posible correlación entre los niveles de p27 EZH2 y
in vivo
y
in vitro
.
sin embargo, los análisis comparativos de EZH2 y la expresión de p27 no mostró en un estadísticamente relevante positivo o negativo la vinculación de los cánceres de colon
in vivo
, en función de cada paciente. Por otra parte, EZH2 agotamiento no dio lugar a un re-expresión de p27 en líneas celulares de cáncer de colon
in vitro
, en puntos de tiempo en el que resultó en gran aumento de la expresión de p27 en líneas celulares de cáncer de páncreas [4]. Estos hallazgos indican que - en contraste con la situación en las células de cáncer de páncreas - los niveles de p27 no están regulados críticamente por EZH2 en células de cáncer de colon. Por lo tanto, el espectro de EZH2 genes diana puede variar de una manera tejido o específico de la célula
.
Con el fin de conseguir la penetración en el espectro de genes, que son afectados por el agotamiento de EZH2 en células de cáncer de colon, se realizó analiza toda transcriptoma genoma en células DLD1 y LoVo. Entre los 139 genes, que se vieron afectados significativamente en ambas líneas celulares, más de un cuarto es conocido por ser asociada a cáncer. El espectro de genes afectados es consistente con la hipótesis de que EZH2 es un factor importante para el desarrollo, control de la proliferación, la señalización, y el movimiento /invasión [1], [36]. Se requiere trabajo adicional para analizar los mecanismos exactos por los que EZH2 puede alterar la expresión de estos genes y estudiar en detalle su posible contribución a la desregulación crecimiento de las células de cáncer de colon. Hemos corroborado los datos de la matriz de análisis de la expresión de 5 genes de QRT-PCR:
DAG1
,
MageD1
,
SDC1
,
TIMP2
, y
Tob1
. De acuerdo con el análisis del transcriptoma,
EZH2
silenciamiento aumentó la expresión de genes en los 5 QRT-PCR análisis también. Estos hallazgos sugieren que EZH2 puede reprimir estos genes, ya sea directa o indirectamente, en células de cáncer de colon. Todos los 5 genes son reportados a exhibir antiproliferativo y /o potencial antiinvasive [28] - [32] y su regulación a la baja tanto, sería consistente con un posible efecto oncogénico de EZH2 en el cáncer de colon
Debido al crecimiento de la promoción. papel de EZH2 en varios tipos de cáncer, la inhibición de EZH2 está actualmente discutido como una nueva estrategia atractiva para la terapia del cáncer [1], [12]. De hecho,
EZH2
inhibición por siRNAs, o el agotamiento de componentes PRC2 por el fármaco 3-deazaneplanocin A (DZNep), ejerce efectos antioncogénico, mediante el bloqueo de la proliferación celular y /o la inducción de apoptosis [2] - [7], [11], [37], [38], al contrarrestar la invasión y la metástasis [9], [10], y mediante la inhibición de la angiogénesis tumoral [8].
el hallazgo en nuestro estudio que contribuye a la EZH2 la proliferación de células de cáncer de colon se extiende el espectro de entidades tumorales que pueden beneficiarse de la inhibición terapéuticamente EZH2 al cáncer de colon. Teniendo en cuenta EZH2 como una diana terapéutica potencial, sin embargo, debe tener en cuenta que EZH2 también se expresa en tejidos normales, incluyendo la capa de células de proliferación de las criptas del colon [22]. Es importante destacar que, EZH2 se ha encontrado para ejercer funciones reguladoras importantes en varios tejidos, tales como el control de la diferenciación de progenitor específico de tejido y células madre [39] - [42]. Además, la reciente observación de que EZH2 puede actuar como un supresor de tumores en ciertos trastornos hematológicos [14], [15], [16] sugiere que la inhibición EZH2 podría incluso promover la tumorigénesis, en algunos tejidos. Por lo tanto, interferir con la función EZH2 como una estrategia terapéutica asume el riesgo de inducir efectos secundarios no deseados y es probable que requiera la entrega altamente específico de los inhibidores de la EZH2 a sus células diana.
Materiales y Métodos
Las células y transfecciones
HCT116, DLD1, LoVo, WiDr, SW620, HCT15, RKO, T84, líneas de células de carcinoma de colon Caco-2, y COLO205 fueron una especie de regalo del doctor M. von Knebel Doeberitz (Universidad de Heidelberg ), SW480 del Dr. S. Wiemann (Centro alemán de Investigación del cáncer, Heidelberg), y HT29 de la facilidad de la base de cultivo de células y tejidos del Centro alemán de Investigación Oncológica, de Heidelberg. Las células se mantuvieron en DMEM (pH 7,2), RPMI, o medio McCoys, suplementado con 10% de FCS, 50 unidades /ml de penicilina, y 50 g de sulfato de estreptomicina /ml.
Los plásmidos se transfectaron por coprecipitación con fosfato de calcio [43] en las células HCT116 o por Fugene HD (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) en DLD1, LoVo, y las células RKO. siRNAs sintéticos fueron transfectadas con Dharmafect (Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En breve, las células se sembraron en placas de 6 cm en 15% a 25% de confluencia. Dharmafect 4 y siRNAs (concentración final de 100 nM) fueron ambos diluidos en Opti-MEM reduje medio con suero (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se mezclaron en un volumen de 400 l solución de transfección.
Los plásmidos y siRNAs sintéticos
siRNAs eran o sintetizarse químicamente (Dharmacon) o expresan como shRNAs de pCEPsh, tal como se describe anteriormente [44]. Los siguientes
se utilizaron EZH2
siRNAs -targeting: siEZH2-1 5'-GAAUGGAAACAGCGAAGGA-3 '(siRNA prediseñado de Dharmacon), siEZH2-2 5'-GACUCUGAAUGCAGUUGCU-3' [7], y siEZH2-3 5'-GCUGAAGCCUCAAUGUUUA-3 '(siRNA prediseñado de Dharmacon). El siEZH2pool consistía en los tres siRNAs mezclados en concentraciones equimolares. Se utilizaron los siguientes ARNip de control: sicontr-1 5'-CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 '[45], sicontr 2-5'-UAGCGACUAAACACAUCAA-3' (siRNA prediseñado de Dharmacon, que contiene al menos cuatro desajustes de todos los genes humanos conocidos), y siLUC 5'-CAUCACGUACGCGGAAUAC-3 '(dirigido a
Photinus pyralis
luciferasa [46]).
La extracción de RNA, cuantitativa en tiempo real inversa-reacción en cadena de la polimerasa con transcripción (QRT-PCR), y proteínas los análisis
ARN se aisló como se describe anteriormente [47] y se resuspendió en agua libre de ARNasa. las concentraciones de ARN se midieron con NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE EE.UU.), a 260 nm. La transcripción inversa de ARN 1 mg se realizó usando el cebador oligo-dT y el kit de ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de expresión se determinaron mediante PCR en tiempo real con un detector de 7300 Sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.), utilizando el SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), suplementado con 500 nM de cada avance y retroceso cebador.
EZH2 gratis (NM_004456) expresión se determinó usando el cebador directo 5'-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3 'y el cebador inverso 5'-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3' [48]. Para la detección de
p27
Kip1
expresión (NM_004064) 'fue utilizado como hacia adelante y 5'-GAGGCCAGGCTTCTTGGGCG-3' 5 'GCCAGACGGGGTTAGCGGAG-3 como cebador inverso.
MageD1 gratis (NM_001005333) expresión se determinó con los cebadores 5'-GGCTGTCCTCTGGGAGGCACT-3 'y 5'-GGGTTGCTGTTGGGCACTCGT-3', expresión
TIMP2 gratis (NM_003255) con los cebadores 5'-3-TCTACACGGCCCCCTCCTCG 'y 5'-TGGGGCAGCGCGTGATCTTG-3',
SDC1 gratis (NM_001006946) expresión con los cebadores 5'-CGGCCCTGCCGCAAATTGTG-3 'y 5'-CCTCCAGGCCGGTGGGTTCT-3',
Tob1 gratis (NM_005749) la expresión con los cebadores 5'-TGCAGCCTATGGAGGCCTCAA-3 'y 5'-CCCCTTGGGCCCGTGCATTTT-3', y
DAG1 gratis (NM_001165928) de expresión con los cebadores 5'-GTCGTCGGGCGCTCATTTCGA-3 'y 5'-3-CCAGCCGTGTAGCGCTCACTG'. secuencias de los cebadores GAPDH y HPRT1 ciclismo y condiciones se han descrito anteriormente [49]. Los tamaños de los productos de PCR se verificaron inicialmente por electroforesis en gel de agarosa y posteriormente revisados por fusión de análisis de puntos después de cada reacción. cuantificación relativa se realizó mediante la comparativa Ct (2
-ΔΔCt) método [50]. Los datos se presentan como la diferencia veces en la expresión de genes normalizado a un índice de limpieza de genes (la media geométrica de
GAPDH
y
HPRT1
los niveles de expresión), y en relación con una muestra de calibrador. Los genes de la casa fueron elegidos entre varios genes de limpieza probados para la normalización de la expresión génica, ya que mostraron una eficiencia de amplificación como la igualdad de nuestros genes de interés. La significación estadística de las diferencias en las variables medidas entre los controles y los grupos tratados se determinó mediante una prueba t pareada de dos caras utilizando el software Sigma Plot (Systat Software Inc, San Jose, CA). Las diferencias se consideraron significativas con p = 0.05.
extractos de proteínas totales se prepararon 48 a 96 horas después de la transfección, tal como se describe anteriormente [51]. Para citosólica y la preparación del extracto nuclear, las células se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM, 0,5% Nonidet® P-40, pH 7,4) y se incubaron en hielo. núcleos intactos se sedimentaron por centrifugación y el extracto citosólico en el sobrenadante se transfirió. Los núcleos se lavaron dos veces con tampón de lisis que contiene 0,05% Nonidet® P-40 y se extrajeron las proteínas nucleares como se ha descrito para los extractos de proteína total. Para los análisis de Western blot, 20 a 30 g de extracto de proteína se separaron mediante 12,5% SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.), y se analizaron por un aumento de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido ). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-EZH2 anticuerpo (AC22, Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), anticuerpo anti-p27 (# 610242, BD Transducción Laboratories, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.), anticuerpo anti-ciclina D1 (DSC6 , Señalización celular), y anti-alfa-tubulina de anticuerpos (CP06, Calbiochem, Darmstadt, Alemania).
El recuento celular y el ciclo celular
análisis
Para los análisis de recuento de células, se determinaron los números de células totales 48-72 horas después de la transfección. Se midieron las células totales por mililitro, utilizando un Contador condesa celular (Invitrogen).
Para los análisis del ciclo celular, las células se trataron con tripsina 48 horas después de la transfección, se lavaron en solución salina enfriada con hielo tamponada con fosfato (PBS), y fijo en el 80% durante la noche etanol frío a -20 ° C.