Extracto
potenciador de zeste homólogo 2 (EZH2), la histona metiltransferasa del complejo Polycomb represivas 2 catalizadora histonas H3 lisina 27 tri-metilación (H3K27me3), es con frecuencia hasta reguladas en los cánceres humanos. En este estudio, hemos identificado el gen supresor tumoral en el cáncer de hígado Suprimido 1 (DLC1) como blanco de la represión por parte de H3K27me3 mediada por la EZH2. DLC1 es una proteína GTPasa de la activación de las proteínas de la familia Rho. La inactivación de los resultados DLC1 en la señalización Rho /ROCK hiper-activado y está implicado en la reorganización del citoesqueleto de actina para promover la metástasis del cáncer. Por la cromatina immunoprecipitation ensayo, hemos demostrado que H3K27me3 fue significativamente enriquecido en la región promotora DLC1 de una línea celular HCC-DLC1 nonexpressing, MHCC97L. El agotamiento de EZH2 en MHCC97L por shRNA reduce el nivel H3K27me3 al promotor DLC1 e inducida gen DLC1 reexpresión. Por el contrario, la sobreexpresión transitoria de GFP-EZH2 en las células Huh7 DLC1 que expresan reduce el nivel de ARNm DLC1 con un enriquecimiento concomitante de EZH2 en DLC1 promotor. Se observó una relación inversa entre EZH2 y expresión DLC1 en el hígado, pulmón, mama, próstata y tejidos de cáncer de ovario. El tratamiento de las células cancerosas con el inhibidor molecular pequeño EZH2, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), restaurado expresión DLC1 en diferentes líneas celulares de cáncer, lo que indica que mediada por EZH2 H3K27me3 regulación epigenética de la DLC1 era un mecanismo común en cánceres humanos. Es importante destacar que, encontramos que el tratamiento DZNep inhibe la migración de células HCC a través de la interrupción de la red del citoesqueleto de actina, lo que sugiere el potencial terapéutico de DZNep en la orientación de la metástasis del cáncer. Tomados en conjunto, nuestro estudio ha arrojado visión mecanicista en EZH2-H3K27me3 represión epigenética de DLC1 y abogado por el significativo papel pro-metastásico de EZH2 a través de la represión de los supresores de tumores y metástasis
Visto:. Au SL-K, Wong CC- L, Lee JM-M, CM Wong, Ng IO-L (2013) EZH2 mediada por H3K27me3 está implicado en la represión de la epigenética en cáncer de hígado Suprimido 1 en los cánceres humanos. PLoS ONE 8 (6): e68226. doi: 10.1371 /journal.pone.0068226
Editor: William B. Coleman, Universidad de Carolina del Norte Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 05 marzo, 2013; Aceptado: 28-may de 2013; Publicado: 27 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Au et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por la Universidad de Programa SeedFunding Hong Kong para la Investigación básica (200811159061 y 201011159045 a CMW), becas de investigación del Fondo de Hong Kong Consejo general de Investigación (HKU 782411M a CMW) y Hong Kong Ayudas a la Investigación del Fondo de Investigación Cooperativa del Consejo (HKU 1 /06C y HKU 7 /CRG /09 a IN). IN es Loke Yew Profesor en Patología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores declaran que co-autor Chun-Ming Wong es un Consejo Editorial PLoS ONE miembro y esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Todos los demás autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Introducción
La desregulación de las proteínas reguladoras aguas arriba epigenéticos promueve alteraciones epigenéticas y contribuyó al silenciamiento aberrante de genes supresores de tumores en los cánceres humanos [1]. Potenciador de zeste homólogo 2 (EZH2), la subunidad catalítica de Polycomb represivas Complejo 2 (PRC2), es uno de los reguladores epigenéticos más comúnmente hasta reguladas en diferentes cánceres humanos [2-5]. EZH2 es una histona metiltransferasa que cataliza específicamente la histona H3 lisina 27 tri-metilación (H3K27me3), que a su vez actúa como una modificación de las histonas represivo para controlar epigenetically transcripción de genes [6,7]. Sobre regulación de EZH2 juega un papel crucial en la progresión maligna y fue implicada en la metástasis del cáncer [2]. funciones EZH2 como un oncogén en diferentes cánceres humanos, principalmente a través de silenciamiento epigenético de genes tumorales y supresor de la metástasis, incluyendo E-cadherina [8], RUNX3 [9], SLIT2 [10], DAB2IP [11], y KLF2 [12]. Recientemente, también hemos informado de que la EZH2 inactiva epigenetically expresiones de varios microRNAs tumoral y la metástasis supresores (miRNAs), como miR-125b, y miR-139 en el carcinoma hepatocelular humano (HCC), con lo que promueve HCC tumorigenicidad y metástasis [13]. La identificación de nuevas dianas que son silenciados por la EZH2 revelará mejor las funciones moleculares de EZH2 en la metástasis del cáncer que serán beneficiosos para el desarrollo de quimioterapias dirigidas EZH2.
DLC1 fue identificado como un
de buena fe
gen supresor de tumor en una región cromosómica recurrentemente suprimido en el cromosoma 8p21 en HCC [14]. DLC1 es una proteína Rho GTPasa de la activación (RhoGAP) localizada en las adhesiones focales [15,16], y es específico para el control de la actividad de RhoA, B, C y CDC42 [17,18]. La actividad RhoGAP de DLC1 regula negativamente estas proteínas Rho mediante la estimulación de su actividad hidrolítica GTP intrínseca, lo que les convierte del estado unido a GTP activo al estado unida a GDP inactiva. La cascada de señalización Rho permite un control adecuado de muchos procesos biológicos tales como la proliferación celular [19] y el movimiento de células [20] en las células normales. Durante el desarrollo de tumores malignos, la vía DLC1 /Rho es de particular importancia debido a su regulación en el citoesqueleto de actina relacionadas con la metástasis del cáncer. Hemos demostrado que la pérdida de DLC1 en HCC activa RhoA, que posteriormente activa su efector aguas abajo Rho cinasa (ROCK) para remodelar la red del citoesqueleto de actina para la migración celular y la invasión [21,22]. Otros papeles supresores diversa tumorales de DLC1 incluyen la mediación de la apoptosis de la caspasa-3-dependiente en HCC modelo [23], la inhibición de la angiogénesis dependiente de VEGF en el modelo de cáncer de próstata [24], y la supresión de clonogenicidad en varios tipos de cáncer [25]. Down-regulación de DLC1 se muestra comúnmente en una amplia gama de tumores malignos humanos [26] y su pérdida de expresión se asocia clásicamente con deleción cromosómica o hipermetilación del promotor de ADN (Yuan et al 1998; Ng et al 2000; Wong et al 2003; Kim et al 2003). En el presente estudio, hemos proporcionado la primera evidencia de que DLC1 es una nueva diana de la represión por H3K27me3 mediada por la EZH2. Demostramos además inactivación de EZH2 en un 3-Deazaneplanocin A (DZNep) que re-expresado DLC1 y notablemente abolido la reorganización del citoesqueleto y la migración celular inhibida en las células cancerosas. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el silenciamiento epigenético de DLC1 está implicado en la función pro-metastásico de EZH2 en los cánceres humanos.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
SMMC-7721 línea celular (Shanghai Instituto de Biología celular) y la línea celular Eh 7 (Banco japonés de Investigación del cáncer) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) altas de glucosa. MHCC97L línea celular (regalo del Prof. Z.Y. Tang, de la Universidad de Fudan, Shanghai) [27] y la línea celular MIHA (Shanghai Instituto de Biología Celular) se mantuvieron en DMEM de alta glucosa suplementado con piruvato de sodio. línea de células HeLa (Colección de Cultivos Tipo Americana) se mantuvo en DMEM-glucosa baja. CNE2 (American Type Culture Collection) y HCT116 (regalo del Prof. B. Vogelstein, Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD) [28] líneas celulares se mantuvieron en Roswell Park Memorial Institute 1640. Todo medio fue suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 unidades /ml de penicilina y estreptomicina.
modificación con bisulfito y el análisis de metilación
modificación con bisulfito de ADN genómico extraído de líneas de células se realizó utilizando DNA EZ metilación directa Kit (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores usados para la amplificación del promotor DLC1 después de la modificación con bisulfito son: 5'-GTTTTTAGTTAGGATATGGT-3 '(hacia delante) y 5'-ACTTCTTTCTACACATCAAACAC-3' (inverso) para BS-1 región; y 5'-TAGAGTTATTAAGAAAAAGAAGGGA-3 '(hacia delante) y 5'-AAAACTAAAATATTTCCCCCAC-3' (inverso) para BS-2 región. El producto de PCR fue clonado en vector TOPO TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la secuenciación de clones individuales se realizó por secuenciación de Sanger.
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayo
chip de ensayo se realizó utilizando kit EZ chip (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) como se describe anteriormente [13]. anticuerpo contra el chip-grado H3K9me3 (ab8898; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), H3K27me3 (07-449; Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) y EZH2, se utilizaron (# 3147 Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) en el ensayo. IgG de conejo (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) o si se usó IgG de ratón (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) como control negativo en el ensayo. Cebadores que abarcan -394nt a -325nt fueron utilizados aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción DLC1: 5'-CACCTC CGCCAAGTAAATGC-3 '(hacia delante) y 5'-CCGAAAAGTCGCCAACTATTG-3' (hacia atrás). La cuantificación de la región unida al anticuerpo hecho por qPCR realizado con ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.).
in vitro
tratamiento de fármacos epigenéticos
DZNep (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE.UU.) se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). 5-aza-DC (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) se disolvió en ácido acético al 50%. TSA (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) se disolvió en etanol. El disolvente de los productos químicos se utilizó como simulacro en el tratamiento correspondiente. Para el tratamiento DZNep, se añadió DZNep (1μM o 10μM) al medio de cultivo durante 48 o 72 horas. Para 5-aza-DC tratamiento, 5-aza-DC (10 mM) se repone diariamente durante 72 horas. Para el tratamiento de la TSA, la TSA (0,25 mg /ml), sólo se añadió a las células en las últimas 24 horas del experimento.
La migración de células de ensayo
Antes de la celda ensayo de migración, 2x10
5 células MHCC97L fueron tratados con 1μM DZNep durante 48 horas. células simuladas y tratados con DZNep (1x10
5) se sembraron las células en la cámara superior de tamaño de poro 8μm Transwell Insert (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). La cámara inferior contenía medio recogido de las células no tratadas MHCC97L para atraer la migración de células durante 18 horas acondicionado. Las células migradas se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta. Tres puntos de vista independientes de la membrana Transwell fueron fotografiados y se contó el número de células que migraron.
inmunofluorescencia (IF) de microscopía y microscopía electrónica de barrido (SEM)
Antes de la proyección de imagen SI, 2x10
5 células MHCC97L fueron tratados con 1μM DZNep durante 48 horas. Después del tratamiento, las células tratadas con simulacros y DZNep (1x10
5) las células se trataron con tripsina y se sembraron en cubreobjetos en medio de cultivo-DZNep por 24 horas. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% en PBS y se permeabilizaron con 0,2% Triton-X-100. adhesiones focales se tiñeron con anticuerpo anti-paxillin (05-417; Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). F-actina se visualizaron por tinción con faloidina conjugada con FITC (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Los núcleos se counterstained con DAPI (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.). Si las imágenes han sido vistas y capturaron con una Leica de fluorescencia Q550CW microscopio (Leica, Wetzler, Alemania). Para SEM, las células simuladas y tratados con DZNep se fijaron con 1% de tetróxido de osmio y 2,5% glutaraldehído, seguido de la deshidratación de etanol por etapas. Después de la etapa de punta seca crítico, los portaobjetos se montaron en pasta de plata. Las imágenes fueron escaneadas y capturados bajo × 2000 de ampliación mediante una Hitachi S-4800 FEG microscopio electrónico de barrido.
El análisis estadístico
Los datos no paramétricos y datos paramétricos continuas se analizaron mediante la prueba de Mann U y Whiteny
t
prueba, respectivamente, utilizando la versión 5.00 GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.). Las pruebas se consideraron significativas cuando el
P
valor era inferior a 0,05.
Resultados
nivel H3K27me3 se enriquece en forma diferencial promotor DLC1 en hepatocitos normales inmortalizadas y líneas celulares de HCC
Para entender el papel de la desregulación epigenética y la inactivación DLC1 en el CHC, comenzamos con el análisis de metilación del promotor de estado DLC1 mediante secuenciación de bisulfito en la línea celular de hepatocitos normales inmortalizadas MIHA y dos líneas celulares de HCC-7721 y SMMC MHCC97L. promotor DLC1 era completamente no metilado en MIHA, heterogénea y parcialmente metilado en MHCC97L, y completamente metilado en SMMC-7721 (Figura 1A). El estado de metilación de DLC1 en MIHA y SMMC-7721 correlaciona bien con su nivel transcripcional DLC1. Pero en MHCC97L, de los cuales el promotor DLC1 fue metilado sólo parcialmente, el silenciamiento completo de DLC1 sugirió que otras regulaciones epigenéticos pueden estar implicados (Figura 1B). Por lo tanto, la hipótesis de que la metilación de histonas aberrante podría contribuir al silenciamiento DLC1 en MHCC97L. inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) ensayo se realizó para evaluar el enriquecimiento de transcripcional modificaciones de las histonas represivas, H3K9me3 y H3K27me3, en el promotor DLC1 (Figura 1C). Demostramos que H3K9me3 y H3K27me3 no eran detectables en MIHA y esto fue coherente con el estado transcripcionalmente activa del gen DLC1 en esta línea celular. Por el contrario, el enriquecimiento de ambos transcripcional represor H3K27me3 y H3K9me3 se detectó en el promotor de DLC1 SMMC-7721 y las células MHCC97L. Curiosamente, H3K27me3 se enriqueció más abundantemente en MHCC97L, en comparación con SMMC-7721. Esta observación indica que, además de la metilación del ADN parcial, H3K27me3 también participó en el silenciamiento epigenético para inactivar el gen transcripcionalmente por completo DLC1 en MHCC97L
.
Promotor metilación del ADN y la modificación de las histonas de DLC1 en líneas celulares de HCC.
(a) diagrama esquemático que muestra la isla CpG ubicada en DLC1 locus. estado de metilación de ADN de 45 dinucleótidos CpG (BS-1 región incluye 35 dinulceotides CpG y BS-2 región incluyó 10 dinucleótidos CpG) fueron sometidos a análisis de secuenciación de bisulfito. MIHA mostró no metilación completa, MHCC97L mostró metilación parcial y SMMC-7721 mostró metilación completa. círculo abierto representa dinucleótidos CpG no metilados y el círculo cerrado representa dinucleótidos CpG metilados. Cada columna representa un único clon se secuenció. (B) RT-PCR (panel superior) y QRT-PCR (panel inferior) muestra la expresión de ARNm DLC1 detectable en MIHA, pero no en MHCC97L y SMMC-7721 células. (C) La cromatina immunoprecipitation (CHIP) ensayo acoplado con el análisis qPCR (qChIP) reveló el enriquecimiento relativo de H3K9me3 y H3K27me3 en DLC1 región promotora en MIHA, MHCC97L y células SMMC-7721. Pliegue de enriquecimiento de chip de ensayo se calculó con referencia al control de IgG después normalizaron con el ADN de entrada. Los datos se representan como la media ± SEM de tres experimentos independientes.
represión de EZH2 reexpresión DLC1 inducida en diferentes líneas celulares de cáncer humano
Para proporcionar más pruebas de que mediada por la EZH2 H3K27me3 regula directamente DLC1, se investigó si la expresión DLC1 podría ser restaurado a la caída de la EZH2. líneas celulares de HCC que expresan de forma estable el control no objetivo (NTC) o EZH2 orientación shRNA (shEZH2) se establecieron en nuestro estudio anterior [13]. Tras la caída estable de EZH2, DLC1 se indujo transcripcionalmente en MHCC97L (Figura 2A). Se observó pérdida de H3K27me3 sobre el promotor DLC1 en células MHCC97L shEZH2 (Figura 2B), lo que indica que mediada por EZH2 H3K27me3 contribuye a la supresión de DLC1 en MHCC97L. En las células Huh7 que expresaban DLC1, la sobreexpresión transitoria de GFP-EZH2 transcripcionalmente reprimida DLC1 y se detectó un enriquecimiento concomitante de EZH2 en el promotor DLC1 (Figura 2C y D Figura complementario S1). En línea con el modelo de caída EZH2, puso de manifiesto, además, que el tratamiento de 3-Deazaneplanocin A (DZNep), un inhibidor de molécula pequeña EZH2 [29,30], redujo significativamente el nivel de EZH2 proteína y el nivel H3K27me3 e inducida DLC1 re-expresión en MHCC97L las células (Figura 2E). Más importante aún, se encontró que mediada por la EZH2 silenciamiento epigenético DLC1 no se limitaba a HCC. Re-expresión de DLC1 tras el tratamiento DZNep también se observó en diferentes líneas celulares de cáncer, incluyendo la línea celular de carcinoma nasofaríngeo CNE2, línea celular de carcinoma colorrectal HCT116 y la línea celular de adenocarcinoma cervical HeLa (Figura 2F). Los hallazgos anteriores indican que el silenciamiento epigenético de DLC1 por H3K27me3 mediada por EZH2 es un mecanismo común compartida por diferentes cánceres humanos.
EZH2 mediada H3K27me3 estuvo implicado en la represión epigenética de DLC1 en HCC y múltiples otros cánceres humanos.
(a) DLC1 se indujo transcripcionalmente en caída estable de EZH2 en las células MHCC97L. análisis (B) qChIP confirmó el agotamiento de H3K27me3 enriquecimiento en promotor DLC1 sobre EZH2 caída en células MHCC97L. Los datos se representan como media ± SEM de tres experimentos independientes. (C) DLC1 fue reprimida transcripcionalmente en células Huh7 después de la sobreexpresión transitoria de GFP-EZH2. análisis (D) qChIP reveló un enriquecimiento concomitante de EZH2 en el promotor del locus DLC1 sobre GFP-EZH2 sobreexpresión en células Huh7. Los datos se representan como media ± SEM de tres experimentos independientes. (E) EZH2 y expresión H3K27me3 se redujo tras el tratamiento 1μM DZNep durante 48 horas en las células MHCC97L (panel izquierdo). DMSO se utilizó como tratamiento simulado. Pan H3 y α-tubulina estaban cargando el control de la inmunotransferencia. DZNep tratamiento indujo la expresión transcripcional en DLC1 MHCC97L como se indica por el análisis qPCR (panel derecho). (F) Las diferentes células cancerosas humanas, incluyendo la línea de carcinoma nasofaríngeo celular CNE2, la línea celular de carcinoma colorrectal HCT116 y la línea celular de adenocarcinoma cervical HeLa fueron examinados para DLC1 reexpresión tras el tratamiento DZNep. El tratamiento de células con 10μM DZNep reactivado expresión DLC1.
P
-valores obtenidos a partir de
t-test
.
EZH2 y DLC1 niveles de expresión se correlacionan inversamente en los tejidos de cáncer humano
Para proporcionar relevancia clínica de los
in vitro
observaciones, se examinó la expresión de ARNm DLC1 en 25 muestras apareadas HCC primarios y correlacionada con el nivel de expresión de nuestros anteriores datos de expresión de mRNA de la EZH2 [31]. En esta cohorte de muestras, EZH2 se upregulated significativamente mientras DLC1 se downregulated significativamente en los tejidos tumorales que los tejidos no tumorales (Figura 3A). Curiosamente, se observó una correlación inversa significativa entre EZH2 y DLC1 en un subconjunto de muestras de HCC, en el que el promotor DLC1 no estaba silenciado por metilación del ADN [17] (Figura 3B). También se amplió el análisis a otros cánceres humanos mediante la recuperación de los datos de microarrays de expresión génica de pulmón [32], de mama [33], de próstata [34], y de ovario [35] cánceres de Oncomine (www.oncomine.org) (Figura 3C ). Consistente con los hallazgos de HCC humano, DLC1 concomitante baja regulación y EZH2 se observó sobre regulación en estos tumores malignos, lo que sugiere las implicaciones de EZH2 sobre regulación en silenciar la expresión DLC1 en diferentes cánceres humanos.
correlación inversa entre EZH2 y expresiones DLC1 en los cánceres humanos.
(a) Veinticinco pares de HCC-muestras se examinaron para la expresión de ARNm EZH2 y DLC1 por qPCR. EZH2 fue significativamente hasta reguladas en HCC tejidos tumorales (T) que los tejidos no tumorales (NT) (panel izquierdo). En la misma cohorte muestra, DLC1 fue significativamente baja regulado en HCC en comparación con los tejidos NT (panel derecho).
P
los valores de la prueba de Wilcoxon par. se observó (B) una correlación inversa entre EZH2 y expresión DLC1 en un subconjunto de muestras de HCC sin promotor DLC1 metilación. El nivel de expresión de EZH2 y DLC1 en muestras pareadas-HCC fue representado por ΔΔCt (T
(HPRT Ct Ct -Gene de interés) -NT
(HPRT Ct - gen de interés Ct)). El análisis de regresión lineal se realizó utilizando GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, EE.UU.). (C) EZH2 upregulation (panel izquierdo) y regulación a la baja DLC1 concomitante (panel derecho) se observó consistentemente en los tejidos tumorales de diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón [32], de mama [33], de próstata [34] y de ovario [35] cánceres. Los datos de expresión y
P
valores de DLC1 y EZH2 en múltiples tipos de cáncer se obtuvo de la base de datos de microarrays Oncomine. bares flotantes se muestran para ilustrar el mínimo, medio y máximo de unidades de expresión normalizada en tejidos no tumorales (NT) y tumorales (T).
DLC1 se sinérgicamente silenciada por H3K27me3 sólo cuando su ADN promotor es parcialmente metilado
Desde múltiples mecanismos represivos epigenéticos están íntimamente ligadas a establecer un ambiente de cromatina menos permisivo para suprimir la transcripción de genes [36,37], hemos tratado de demostrar el efecto combinatorio de diferentes mecanismos epigenéticos en el control de la expresión DLC1. MHCC97L y células SMMC-7721 fueron tratados con DZNep junto con 5-Aza-2'deoxycytidine (5-Aza-dC) y tricostatina A (TSA), que son bien inhibidores de la metilación del ADN y la acetilación de histonas caracterizados, respectivamente. Mientras que el tratamiento de DZNep, 5-Aza-dC y TSA elevado individualmente expresión DLC1, el tratamiento combinado de tres medicamentos restaurado sinérgicamente expresión DLC1 en MHCC97L células (Figura 4A). Sin embargo, el co-tratamiento en las células SMMC-7721 no mostró un mayor aumento en la expresión DLC1 en comparación con 5-aza-DC sola (Figura 4B), lo que implica que la metilación del ADN es un mecanismo epigenético predominante para silenciar DLC1 en esta línea celular.
expresión DLC1 se restauró de forma sinérgica sobre DZNep, 5-aza-dC células y tratamiento TSA en MHCC97L pero no SMMC-7721.
(a) tratamiento con fármacos epigenéticos en las células combinacional MHCC97L con 10 mM 5-aza-dC, 0,25 mg /ml TSA y 10μM DZNep indujo la DLC1 más robusto reexpresión que cualquier tratamiento de fármacos epigenéticos simple o doble. DZNep y tratamiento con 5-Aza-dC se realizaron durante 72 horas. TSA se añadió a las células ya sea solo o con otros medicamentos durante las últimas 24 horas de tratamiento. Los datos se representan como media ± SEM de tres experimentos independientes. células (B) Adición de DZNep en SMMC-7721 no indujo más DLC1 reexpresión en comparación con 5-Aza-dC y TSA tratamiento dual. Los datos se representan como la media ± SEM de tres experimentos independientes.
DZNep tratamiento interrumpe citoesqueleto de actina para inhibir la migración de células HCC
DLC1 /Rho /vía roca es crucial para la regulación de la remodelación del citoesqueleto adecuada y la motilidad celular. Nuestros hallazgos sugieren que los precedentes EZH2 está implicado en la represión de DLC1, por lo tanto, a prueba aún más si el tratamiento podría suprimir DZNep
in vitro
HCC migración. tratamiento DZNep a 1μM durante 48 horas, que mostró un efecto mínimo citotóxica (Figura S2), efectivamente inhibe la migración celular en las células MHCC97L como se demuestra por ensayo de migración Transwell (Figura 5A). células tratadas DZNep también mostraron supresión de la red del citoesqueleto de actina adecuada cuando se examina bajo el microscopio electrónico de barrido (Figura 5B) y la tinción de inmunofluorescencia (Figura 5C). Estas alteraciones morfológicas celulares inducidos por el tratamiento con DZNep altamente parecían a las del colapso del citoesqueleto celular DLC1 inducida y la contracción celular [21], lo que implica que DZNep puede inhibir la migración de células a través de interferir vía DLC1 /ROCK y causaron sustancial desorganización del citoesqueleto de actina.
El tratamiento de DZNep inhibe la migración de células HCC través de la interrupción del citoesqueleto de actina.
(A) tratamiento DZNep abolió celular MHCC97L capacidad migratoria. Antes de ensayo de migración de células, las células se trataron con 1μM DZNep durante 48 horas. células simuladas y tratados con DZNep fueron luego sometidos a ensayo de migración celular usando un aparato Transwell. Se muestran imágenes representativos de tres experimentos independientes.
P
-valores obtenidos a partir de
t-test
. tratamiento (B) DZNep suprime la formación de filopodios (flechas rojas) y lamelipodia (flechas azules) como se ilustra mediante microscopía electrónica de barrido. Imágenes (2000x aumentos) fueron capturados utilizando un Hitachi S-4800 FEG microscopio electrónico de barrido. tratamiento (C) DZNep afectada citoesqueleto de actina y causó la contracción celular en las células MHCC97L. de fibras de estrés se tiñó con faloidina conjugada con FITC y adhesiones focales se tiñeron con anticuerpo anti-paxillin. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. modelo de las células tratadas mostraron haces organizados de fibras de estrés y paxillin así adjunto. las células tratadas con DZNep se contrajeron y perdieron la red del citoesqueleto de actina adecuada. Imágenes (100 aumentos) fueron capturados por un microscopio de fluorescencia Leica Q550CW (Leica, Wetzler, Alemania).
Discusión
Una de las funciones pro-metastásico importante de EZH2 en el cáncer es a través de epigenética silenciamiento de genes supresores de tumores y metástasis [8-12]. H3K27me3 es la mejor modificación de las histonas EZH2 mediada caracterizado en el sistema epigenético de mamífero. En el presente estudio, aportar pruebas de que mediada por la EZH2 H3K27me3 está implicado en la represión de la epigenética DLC1 durante el desarrollo de HCC. Curiosamente, varios de los datos publicados en todo el genoma de grupo Polycomb (PcG) mapeo de genes diana en células madre embrionarias humanas (HES), también notamos que DLC1 es un gen regulado por PcG candidato en la etapa temprana de desarrollo (Figura S3). En HES células, el promotor DLC1 está ocupado por SUZ12, que se asocia con EZH2 para formar el PRC2 en la mediación de la transcripción y H3K27me3 represión [38]. Además, el promotor DLC1 también está marcado con H3K27me3 [39] y H3K4me3 [40], que constituyen la firma de la cromatina bivalente de objetivos PcG [41]. Esta firma de la cromatina bivalente, que implica la H3K27me3-silenciamiento y H3K4me3 activadores modificaciones de las histonas, permite que los genes de importancia en el desarrollo y los genes necesarios para el mantenimiento stemness a estar a punto en un estado listo para transcribir hasta la diferenciación [41,42]. DLC1 es esencial para el desarrollo embrionario [43] y, posiblemente, tiene un papel en la especificación de linaje [44]. los ratones knockout DLC1 es letal embrionaria [43]. Sin embargo, DLC1 se transcribe de forma ubicua en tejidos adultos [14], lo que implica que PcG efecto silenciador se ha liberado en las células somáticas diferenciadas. Tras la oncogénesis, es posible que DLC1 recupera su PcG embrionario marcado como resultado de EZH2 regulación. A nivel molecular, hemos demostrado que DLC1 fue co-regulados por mediada por EZH2 H3K27me3, la metilación del ADN y la desacetilación de histonas en células de HCC. Sin embargo, la co-regulación entre los tres mecanismos epigenéticos en DLC1 sólo se observó cuando su promotor fue metilado parcialmente (como en las células MHCC97L). Una vez promotor DLC1 fue metilado densamente (como en las células SMMC-7721), H3K27me3 estaba ausente y la metilación del ADN era el mecanismo represivo clave con la modesta participación de la desacetilación de histonas. Esta observación puede reflejar la diafonía de EZH2 silenciamiento y la metilación del ADN en una etapa anterior de la represión epigenética de genes supresores de tumores antes de la eventual sustitución de H3K27me3 silenciamiento por la maquinaria de metilación del ADN estable [45,46]. De hecho, nuestros hallazgos que DLC1 es un objetivo regulado PcG y su posterior silenciamiento epigenético durante la progresión del tumor maligno también están en línea con el modelo propuesto recientemente sobre PCG marcado de genes en células madre embrionarias están predispuestos a
de novo
específico de cáncer metilación del ADN [45,46].
orientación farmacológica de las proteínas epigenéticos desregulados emerge como un enfoque atractivo en la terapia del cáncer [47,48]. DZNep se ha demostrado que la erradicación de células de HCC iniciadoras del tumor en ratones desnudos implantados con HCC [49], inducir la apoptosis en células de cáncer de mama [29] y el objetivo de la leucemia mieloide aguda humana en el modelo de ratones cuando se utiliza en combinación con panobinostat [50]. Sin embargo, el efecto supresor de la metástasis DZNep nunca ha sido evaluada. Nuestros resultados indican que DZNep inhibir la expresión EZH2 y puede funcionar además como un inhibidor de la metástasis potente a través de la interrupción de la organización del citoesqueleto de actina. Una caracterización farmacológica detallada de DZNep para suprimir el crecimiento y la progresión del tumor in vivo HCC todavía se justifica para investigar el potencial terapéutico de DZNep como régimen de tratamiento del cáncer.
previamente han demostrado que promueve EHZ2 HCC metástasis en parte a través de la represión epigenética de múltiples miRNAs señalización de metas de Rho /ROCK [13]. Por ejemplo, el miR-139 que se dirige a ROCK2 [22] era con frecuencia el regulado en humanos HCC por H3K27me3 mediada por la EZH2 [13]. En este estudio, hemos demostrado que, además, DLC1, el regulador clave de aguas arriba de la vía Rho /ROCK, también es silenciada por EZH2. En conjunto, nuestros resultados desentrañar una regulación estricta y de múltiples capas de la señalización DLC1 /Rho /ROCK por EZH2, que puede sostener un acontecimiento impulsado epigenética crítico en la promoción de la metástasis del cáncer.
Apoyo a la Información
Figura S1.
sobreexpresión transitoria de GFP-EZH2, según lo confirmado por inmunotransferencia (a la izquierda del panal) y qPCR (panal derecha), aumenta los niveles de EZH2 y H3K27me3 en células Huh-7. anticuerpo anti-EZH2 (# 3147, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) detecta tanto la endógena y la proteína de fusión GFP-EZH2 en el inmunoblot. Las proteínas y ARN se recogieron seis días después de la transfección
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068226.s001 gratis (TIF)
figura S2. células
MHCC97L tratados con 1μM DZNep durante 48 horas se examinaron para su viabilidad mediante tinción con azul de tripano antes de ensayo de migración celular. células tratadas simuladas y DZNep fueron igualmente viable
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068226.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
se analizó la base de datos públicamente disponibles chip-secuenciación y Chip-a-chip para proporcionar pistas de estado DLC1 la cromatina en células madre embrionarias humanas. Se encontró locus DLC1 estar marcada por H3K27me3 (Zhao et al., 2007) y H3K4me3 (Pan et al., 2007) en estudios independientes. Por otra parte, también se encontró promotor DLC1 estar obligado por SUZ12, que es un componente básico de los complejos Polycomb represivas 2.
doi (Lee et al., 2006): 10.1371 /journal.pone.0068226.s003
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