Extracto
El estrés oxidativo, un factor importante en la modulación de la vía glucolítica y la inducción de estrés genes activados, es aumentada aún más debido a la reducción del sistema de defensa antioxidante, que promueve la progresión del cáncer a través de la inducción de la angiogénesis. La curcumina, un fitoquímico quimiopreventivo de origen natural, se informó de inhibir la carcinogénesis en varios modelos animales experimentales. Sin embargo, el mecanismo subyacente implicado en la acción anticancerígena de la curcumina debido a su efecto a largo plazo aún no se ha reportado debido a su rápido metabolismo, aunque metabolitos se acumulan en los tejidos y permanecen por más tiempo. Por lo tanto, el efecto a largo plazo de la curcumina necesita investigación a fondo. El presente estudio tuvo como objetivo analizar la acción anticancerígena de la curcumina en el hígado, incluso después de la retirada del tratamiento en ratones portadores de linfoma de Dalton. El estrés oxidativo observado durante la progresión del linfoma redujo actividades antioxidantes enzimáticos, y la angiogénesis inducida, así como la activación de genes de estrés activado temprana y vía glucolítica. La curcumina tratamiento resultó en la activación de la enzima antioxidante superóxido dismutasa y la regulación del nivel de ROS, así como la actividad de producción de ROS enzima NADPH abajo: oxidasa, la expresión de genes de estrés activado HIF-1α, cMyc y la actividad LDH hacia el nivel normal. Además, se conducen a una inhibición significativa de la angiogénesis, observado a través de la actividad de MMPs, PKCa y el nivel de VEGF, así como por el ensayo de tapón de Matrigel. Por lo tanto los resultados de este estudio concluyen que el efecto a largo plazo de la curcumina muestra el potencial anticancerígeno través de la inducción del sistema de defensa antioxidante y la inhibición de la angiogénesis a través de regulación a la baja de los genes de estrés activado y vía glucolítica en el hígado de ratones portadores de linfoma.
Visto : Das L, M Vinayak (2014) Efecto a largo plazo de la curcumina en el Reglamento de la vía glucolítica y la angiogénesis a través de la modulación de los genes de estrés activado en la prevención del cáncer. PLoS ONE 9 (6): e99583. doi: 10.1371 /journal.pone.0099583
Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Singapur, Singapur
Recibido: 25 Marzo, 2014; Aceptado: 15-may de 2014; Publicado: 16 Junio, 2014
Derechos de Autor © 2014 Das, Vinayak. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se incluyen dentro del papel
Financiación:. El trabajo fue apoyado por subvenciones del Departamento de Ciencia y Tecnología (Grant No.-SR /S0 /AS-97/2007), Gobierno de la India para MV . La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
especies reactivas elevados de oxígeno (ROS) tales como los radicales superóxido y H
2O función
2 como moléculas de señalización en varios aspectos de las respuestas mediada por el factor de crecimiento, incluyendo la angiogénesis durante la progresión del cáncer. La fuente principal de la producción de ROS se regula por la NADPH oxidasa. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un importante inductor de la angiogénesis, que estimula la proliferación, la migración y la formación de tubos de células endoteliales (EC) a través de la type2 receptor VEGF. la angiogénesis inducida por VEGF está mediada por la proteína quinasa C (PKC), como PKC está implicada en la vía de señalización del desarrollo del tumor mediada por VEGF y la angiogénesis [1]. PKCa promueve la actividad angiogénica de las células endoteliales a través de la inducción de VEGF y VEGF aumenta su propia expresión a través de mecanismo de retroalimentación positiva PKCa dependiente de [2]. Además, VEGF está regulada a nivel transcripcional por el factor 1-α inducible por hipoxia (HIF-1α) en respuesta a la hipoxia [3], [4]. HIF-1 no sólo regula el suministro de oxígeno (angiogénesis), pero el consumo de oxígeno (metabolismo glicolítico) también en el microambiente hipóxico del tumor [5]. La expresión de un número de genes que comienzan con oncogén mediada seguido de genes HIF-1 mediada están inducidas que promueven los cambios metabólicos durante la carcinogénesis. Es el resultado de la muy glicolítica fenotipo "Warburg" y la represión de la biogénesis mitocondrial [6]. La regulación por incremento de la lactato deshidrogenasa A (LDH-A) es un mediador molecular importante de efecto Warburg, que se produce incluso en condiciones aeróbicas como consecuencia de microambiente del tumor hipóxico y alteraciones en ciertos oncogenes o genes supresores de tumores [7]. Además, la sobreexpresión de LDH-A está regulada por HIF-1 cooperación con desregulado c-Myc. Se ha observado que la activación oncogénica través de la expresión desregulada de c-Myc contribuye a la tumorigénesis en diversos tejidos en ratones transgénicos y muchos tipos de cánceres humanos incluyendo linfomas [8]. De este modo, la desregulación de la expresión de oncogenes, genes supresores de tumores y estabilidad de los genes están involucrados en la carcinogénesis, que se traducen en un menor nivel de defensa antioxidante en el microambiente del tumor y las células del cáncer [9]. Además, la metaloproteinasa de matriz (MMPs) son enzimas dependientes de zinc proteolíticas, matriz extracelular Cleave, así como sustratos no de la matriz (factores de crecimiento, receptores de superficie celular, etc) y regular las vías que controlan el crecimiento celular, la inflamación, la angiogénesis o de señalización. Actúa como modulador del microambiente del tumor y puede incluso trabajar de una manera no proteolıtica. La desregulación de MMPs está implicada en muchas enfermedades, tales como metástasis de tumores, artritis reumatoide, y la enfermedad periodontal [10], [11]. Además, las MMP reactivar la actividad angiogénica de VEGF por la degradación selectiva de factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), como una de las isoformas de VEGF se une CTGF y la actividad angiogénica de VEGF se inhibe en el VEGF-CTGF complejo [12]. Así, la inhibición de las actividades angiogénicas a través de la modulación de la vía glicolítica, la activación del sistema de defensa antioxidante endógeno y la inhibición de la formación de ROS podría ser un paso para prevenir la carcinogénesis. Durante la progresión del linfoma de Dalton (a murino transplantable linfoma no Hodgkin de células T de), las diferentes partes se ven afectados incluyendo el hígado y la médula ósea más allá del sistema linfático. siendo el mayor metabolismo y desintoxicación de los órganos del cuerpo de hígado se ve afectado en gran medida durante la progresión del linfoma. Además, la metástasis y los tumores malignos se ha confirmado anteriormente en el hígado de rodamiento linfoma de Dalton (DL) de los ratones, que son características de linfoma no Hodgkin de [13], [14].
Amplia gama de fitoquímicos presentes en la naturaleza puede conferir beneficios óptimos para la salud de los seres humanos. El uso de extracto total o constituyente aislado simple o un metabolito de un componente aislado de lograr beneficios para la salud deseables ha sido un tema de los últimos años. La curcumina, un fitoquímico quimiopreventivo de origen natural derivado de la cúrcuma (
Curcuma longa
), se informó de inhibir la carcinogénesis inducida químicamente en múltiples sitios de órganos en diversos modelos animales experimentales. La curcumina suprime la activación de varios factores de transcripción que están implicados en las actividades oncogénicas, transformación de los bloques, la proliferación y la invasión, así como induce la apoptosis en las células tumorales. Por lo tanto la curcumina muestra grandes promesas para el tratamiento del cáncer [15]. Sin embargo, aún no se informó de si la acción anticancerígena de la curcumina es debido al efecto acumulativo de sus metabolitos o debido a la curcumina en sí, como el metabolismo de la curcumina es muy rápido pero metabolitos permanecen durante más tiempo en diferentes tejidos [16]. Además, las evidencias sugieren que acumulan el consumo de extractos de alimentos enteros o parcialmente purificados es más beneficioso sobre constituyente aislado solo debido a la existencia de interacciones sinérgicas entre los fitoquímicos en los alimentos enteros [17], [18]. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para investigar el mecanismo implicado en la acción anticancerígena de la curcumina incluso después de la retirada de la administración. El estudio se centra en la vía glucolítica y la angiogénesis, en cooperación regulada por c-Myc y HIF-1 bajo microambiente tumoral oxidativo en el hígado metastásico de ratones con linfoma.
Materiales y Métodos
Todos los productos químicos fueron de grado analítico y la biología molecular, así como libre y se usó sin purificación adicional endotoxina. La curcumina, reactivos para el aislamiento de ARN y Taq polimerasa, no fluorescente 2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína (H2DCFDA) y HRP conjugado anti-actina β se adquirieron de Sigma Aldrich. La transcriptasa inversa, ribonucleasa inhibidor, cebadores aleatorios y 100 pb Plus DNA Ladder desde Fermentase Ciencias de la Vida y los cebadores específicos de genes para la RT-PCR se sintetizaron a partir Metabion. Anti-ratón PKCa y VEGF-A de anticuerpos fueron adquiridos de Santacruz biotecnología y Biolegend respectivamente. HRP conjugado de cabra anti-conejo y anticuerpo secundario de conejo anti-rata de Bangalore Genei. matriz de la membrana basal Matrigel de BD Biosciences, gelatina de Amresco y ECL (Kit de señal súper) se adquirió de Pierce Biotechnology.
Animales y la inducción de células T linfoma (linfoma de Dalton)
Ratones (AKR cepa) fueron criados y mantenidos bajo condiciones estándar de laboratorio con el cuidado humano adecuado, de acuerdo con las directrices del comité de ética de los animales institucional, a 25 ± 2 ° C en un 12 h luz /12 h oscuridad calendario proporcionado con los ratones de alimentación estándar y agua potable
ad libitum
. Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Ético de Animales Institucional de la Universidad Hindú de Benarés. ratones machos adultos sanos (16-20 semanas de edad y 30 ± 2 g) fueron utilizados en el trabajo experimental. linfoma de Dalton (linfoma transplantable no Hodgkin de células T) células ascitis se trasplantaron a ratones macho adulto a través intraperitoneal (ip) el trasplante en serie de aproximadamente 1 × 10
6 células tumorales de ascitis viables en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por ratón como se describe anteriormente [19]. ascitis células de linfoma de Dalton fueron dotados por el profesor Ajit Sodhi, Escuela de Biotecnología de la Universidad Hindú de Benarés, Varanasi, India. linfoma de Dalton es un linfoma de células T murino trasplantables se originó en el timo de un ratón DBA /2 en el Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD, en 1947. [20].
Desarrollo de DL fue confirmada por hinchazón abdominal anormal y aumento del peso corporal, que eran visibles claramente en 10-11 días post trasplante ratones y DL sobrevivieron durante 20 ± 2 días. Los primeros 7-9 días a partir de día siguiente del trasplante de DL, el crecimiento del linfoma de Dalton no mostraron ningún cambio importante en el peso corporal y la acumulación de líquido de ascitis. Así primeros 7-9 días se pueden comparar con la fase preparatoria de retardo de fase /de curva sigmoidea para el crecimiento población de células de ascitis. Por lo tanto, se seleccionó programa del tratamiento de curcumina a ratones DL en consecuencia durante 9 días a partir del día siguiente después de DL trasplante y los ratones fueron sacrificados en el día 18 después del transplante DL (antes de los ratones DL muere en forma natural) para obtener el efecto a largo plazo de la curcumina, como curcumina debe estar completamente metabolizado en sus metabolitos antes de los 9 días desde el último día de tratamiento. Por lo tanto, el efecto no sería debido al efecto directo de la curcumina, pero podría ser debido a los metabolitos de la curcumina.
Lista de tratamiento de curcumina a ratones DL y la recogida de tejidos
Un grupo de la normalidad ratones se utilizó como control, sin ningún tratamiento (N). ratones DL se dividieron al azar en cinco grupos con 6 ratones en cada grupo (n = 6). Tres grupos fueron tratados con diferentes dosis de curcumina: 1,5 mg [linfoma de Dalton ratones tratados con 50 mg de curcumina /kg de peso corporal (DLT50) teniendo], 3 mg [linfoma de Dalton ratones tratados con 100 mg de curcumina de peso corporal /kg de bolas (DLT100) ], y 4,5 mg [linfoma de Dalton ratones tratados con 150 mg de curcumina /kg de peso corporal (DLT150)] que lleva, se disolvió en 50 l de DMSO a cada ratón por día a través de IP durante 9 días consecutivos, a partir del día siguiente, después de trasplante de DL. Un grupo de ratones recibió DL 50 l DMSO como vehículo (DL + DMSO) de manera similar y otro grupo de ratones DL se utilizaron sin ningún tratamiento (DL). Todos los ratones de cada grupo se sacrificaron en el día 18 del trasplante poste DL por dislocación cervical. Hígado fue eliminado inmediatamente después de sacrificar el animal y se lavó en solución salina normal enfriada. De hígado de todos los animales (n = 6) de un grupo se reunió y se mezcló cortando asépticamente a 4 ° C para el resultado promedio. Se utilizó tejido recogido inmediatamente o se conservó a -80 ° C para su posterior estudio.
En vivo
ensayo de angiogénesis
se tomaron Otro conjunto de seis grupos con tres ratones por grupos para estudiar
in vivo
angiogénesis. Todos los tratamientos fueron los mismos que anteriormente, excepto que, en el momento del trasplante de DL, cada uno de los ratones de todos los grupos se les inyectaron por vía subcutánea con 500 l de matriz de membrana basal Matrigel BD (enchufe Matrigel). Justo después de sacrificar, se retiraron los tapones de Matrigel. Tapones fueron fotografiados y se pesaron inmediatamente. Para cuantificar la vascularización de la clavija, se midió la cantidad de hemoglobina (Hb) acumulada en el tapón usando Hemocor-D kit (cresta Biosystems, Tulip Group, India) siguiendo el protocolo y la absorbancia de las muestras del fabricante se midieron a 540 nm.
RT-PCR
el ARN total fue aislado utilizando el reactivo TRI (Sigma-Aldrich) de acuerdo con su manual de usuario. tratamiento con DNasa se llevó a cabo en el ARN total usando TURBO-DNA libre Kit ™ I para eliminar cualquier contaminación de ADN genómico. RNA se cuantificó a 260 nm y la integridad se comprobó mediante electroforesis en gel de formaldehído de agarosa al 1%. El ADNc se sintetizó a partir de RNA total aislado utilizando una mezcla estándar que contiene cada uno de los dNTP, hexámero aleatorio, M-MuLV transcriptasa inversa, inhibidor de RNasa y tampón de reacción de acuerdo con el protocolo estándar de Fermentas Ciencias de la Vida, y cDNA se utilizó inmediatamente o se almacenó a -80 DO. La expresión de las isoenzimas de SOD y NOX, HIF-1α, cMyc, LDH-A, PKCa, VEGF-A y MMP 9 & amp; 2 genes fueron estudiados por semi-cuantitativos RT-PCR usando ADNc sintetizado. Taq polimerasa y pares de cebadores apropiados (Tabla-1) se utilizaron para reacciones de PCR utilizando ciclador térmico (Applied Biosystem). PCR se inició con 3 min a 95 ° C para la desnaturalización seguido de tres pasos ciclo de temperatura (Tabla-1). Un paso de extensión final a 72 ° C durante 7 min se incluyó después del ciclo final para completar la polimerización. Número de ciclos fue optimizado dentro de la fase exponencial de amplificación. El tamaño de los productos amplificados se comprobó por electroforesis en gel de agarosa usando 100 escalera pb. La intensidad de las bandas de los productos amplificados en el gel de agarosa se visualizó, fotografió y analizó mediante el uso del sistema Gel Doc (Alpha Innotech
CE). Además, la intensidad de banda se normalizó con el correspondiente carril de la β-actina como control interno.
PAGE no desnaturalizante y la actividad específica de tinción
gel de ensayos de actividad se utilizaron para medir la actividad enzimática e isoenzimas patrón de enzima SOD antioxidante, así como NOX y LDH. Como alteraciones de la actividad enzimática se asocia con cambios en el metabolismo, el análisis PAGE no desnaturalizante y ensayo de actividad de gel se prefiere sobre la inmunodetección, porque, el método utiliza la detección basada en la especificidad de sustrato de sólo una parte activa de la proteína. Por lo tanto, se considera altamente relevante para correlacionar un cambio en el nivel de una isoenzima específica con la de alteraciones metabólicas a nivel celular.
superóxido dismutasa (SOD)
El ensayo de actividad de gel de SOD se llevó a cabo mediante PAGE no desnaturalizante, seguido de tinción con actividad como por el método de Beauchamp y Fridovich [21]. La misma cantidad de proteína de cada muestra se separó mediante PAGE no desnaturalizante al 10% a 4 ° C. Después de la electroforesis, el gel se sumerge en una solución de NBT 1,23 mM durante 20 min en oscuridad. El gel se lavó brevemente en agua destilada y se incubó durante 15 a 20 minutos bajo oscuridad en tampón fosfato 100 mM (pH-7,0) que contiene TEMED mM 28 mM y 0,28 riboflavina. A continuación, el gel se expone a una luz fluorescente hasta la aparición de zonas claras de bandas de actividad aromáticos con fondo azul. La intensidad de las bandas se analizó por densitometría usando un Sistema Analizador de Imagen Alfa (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.)
tinción de actividad de la NADPH:. Oxidasa
El nivel de actividad enzimática de NOX se identificaron isoenzimas en PAGE no desnaturalizante, seguido de la actividad de la tinción por el método de reducción de NBT descrito por Sagi y Fluhr [22]. La misma cantidad de proteína de cada muestra se separó mediante PAGE no desnaturalizante al 10% a 4 ° C. Después de la electroforesis el gel se tiñó en 50 mM Tris-Cl (pH-7,4) NBT 0,2 mM, MgCl2 0,1 mM, CaCl2 1 mM y, en la oscuridad durante 20 min. Entonces mM NADPH 0,2 se añadió a la solución de tinción y se observó la aparición de bandas de formazán de color azul. La reacción se detuvo por inmersión de los geles en agua destilada. La intensidad de las bandas se analizó por densitometría usando un Sistema Analizador de Imagen Alfa (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.).
tinción de actividad de lactato deshidrogenasa (LDH)
En enzimática en gel ensayo de actividad de lactato deshidrogenasa se realizó por PAGE no desnaturalizante seguido de tinción actividad específica como se describe por Dietz y Lubrano [23]. La misma cantidad de proteína de cada muestra se separó mediante PAGE no desnaturalizante 8% a 4 ° C. Después de la electroforesis el gel se sometió a LDH tinción actividad específica en la solución de tinción que contiene 125 mM de Tris-Cl (pH-7,4), cloruro de magnesio 0,5 mM, 0,1 mM de litio-lactato, 1 mg /ml de NAD, NaCl 10 mM, 0,25 mg /ml de NBT y 0,025 mg /ml de PMS con agitación suave durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, después del desarrollo de las bandas de LDH se lavó el gel. La intensidad de las bandas se analizó por densitometría usando un Sistema Analizador de Imagen Alfa (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.).
ensayo de peróxido de hidrógeno
nivel de peróxido de hidrógeno en el tejido hepático era medido espectrofotométricamente mediante la adopción de la absorbancia a 570 nm como se describe anteriormente [24]. La concentración de H
2O
2 en cada muestra se determinó utilizando la curva estándar, generada mediante la adopción de cantidades conocidas de H
2O
2, y se expresa en mol /mg de proteína.
ROS Ensayo
nivel total de ROS se determinó mediante la conversión oxidativa de no fluorescente 2 ', 7'-diacetato diclorofluoresceno (H2DCFDA) a muy fluorescente 2', 7'-diclorofluoresceno (DCF) como se ha descrito anteriormente [25 ]. extractos de hígado de cantidad de 100 l se incubaron a 37 ° C durante 60 min con 100 l de H2DCFDA 2 mM (Invitrogen) en PBS. La fluorescencia se registró a 485 nm (excitación) y 527 nm (emisión) con HITACHI F-3000 espectrofotómetro de fluorescencia. El nivel de ROS en cada muestra se determinó mediante la observación de la fluorescencia (absorbancia) /mg de proteína.
Gelatina Zymography
Actividad de MMPs en muestra de tejido se analizó para estudiar la actividad degradante de gelatina usando zimografía como se describe anteriormente [26]. La misma cantidad de proteína de cada muestra se mezcla con un volumen igual de tampón no reductor 2X (M Tris-Cl pH 6,8, 20% de glicerol, 4% de SDS, 0,003% de azul de bromofenol 0,125) se separó a 4 ° C por 8% resolver y 5% de apilamiento SDS-PAGE que contiene 0,1% de gelatina. Después de la electroforesis, el gel se lavó dos veces en 2,5% de Triton X-100 durante 20 min cada uno a fin de eliminar las enzimas de SDS y renaturalizar. El gel se incubó durante 20 horas a 37 ° C en el tampón que contiene 21 mM Tris-Cl (pH-7,6), CaCl2 10 mM, y 0,04% de NaN3. Entonces gel se lavó en agua destilada, se tiñeron con CBB y se destiñó en metanol y ácido acético. La actividad de proteasa se observó como una banda clara de gelatina digerida. La intensidad de las bandas se analizó por densitometría usando un Sistema Analizador de Imagen Alfa (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS utilizando uno -way ANOVA seguido por el test de Tucky. Los valores se expresan como media ± S.E.M. obtenido a partir de tres conjuntos diferentes de experimentos, p & lt; 0,05 se tomó como estadísticamente significativa (95% intervalo de confianza).#P & lt; 0,05 y ## & lt; 0,01 en comparación con N, * p & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0.01 en comparación grupo DL + DMSO respectivamente
Resultados
Expresión y actividad enzimática de SOD
se encontró que la expresión de SOD en el hígado de ratones DL y DL + DMSO para ser reguladas de manera significativa en comparación a la normalidad. Las expresiones de tanto Mn-SOD y Cu /Zn-SOD en ratones DL eran 75% y 78% de los ratones normales, respectivamente, y 82% y el 69% de lo normal, respectivamente, en DL + DMSO. Significativa hasta la regulación de la expresión tanto de las isoenzimas de la SOD se encuentra hacia el nivel normal mediante el tratamiento de cúrcuma; Mn-SOD se upregulated hasta 1,21 veces y 1,22 veces de ratones DL + DMSO con 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente, y Cu /Zn-SOD hasta 1,15 veces, 1,42 veces y 1,1 veces de DL + DMSO con 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 1 (A)]. Del mismo modo la actividad de la SOD también sigue la tendencia similar de variación en la expresión. Se encontró que la actividad de Mn-SOD en DL y ratones DL + DMSO a ser 65% y el 63% de los ratones normales, respectivamente. tratamiento curcumina elevó la actividad en función de la dosis, que era aproximadamente hasta 1,3 veces, 1,39 veces y 1,58 veces de DL + DMSO en 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal respectivamente. Del mismo modo, la actividad de la Cu /Zn-SOD se redujo en ratones DL y DL + DMSO hasta 61% y el 61,5% de los ratones normales, respectivamente. tratamiento curcumina era capaz de aumentar la actividad de la Cu /Zn-SOD en forma dependiente de la dosis similar, aproximadamente hasta 1,24 veces, 1,35 veces, 1,5 veces de ratones DL + DMSO con 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 1 (C)].
Efecto de la curcumina sobre la expresión de ARNm y la actividad enzimática de las isoenzimas de SOD en el hígado de ratones portadores de linfoma (A) RT-PCR de Mn-SOD, Cu /Zn-SOD y β-actina gen, (B) de escaneo densitométrico de Mn-SOD y genes Cu /Zn-SOD después de la normalización con β-actina, (C) la tinción específica que muestra la actividad de las isoenzimas de SOD, (D) de escaneo densitométrico de la banda de la actividad de las isoenzimas de SOD. Los hígados de los seis animales de cada grupo se agruparon por separado y utilizados para la extracción de ARN total y proteínas en la condición de no desnaturalización. Los datos representan la media ± S.E.M.#P & lt; 0,05 comparado con el grupo N y * p & lt; 0,05 comparado con el grupo DL + DMSO respectivamente. Cur es la curcumina, M es 100 pb y marcador de peso corporal es el peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 y DLT150 representa normales, el cojinete de linfoma de Dalton, el linfoma de Dalton ratones tratados con DMSO y de Dalton linfoma ratones tratados con 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal disueltos en DMSO, respectivamente, teniendo cojinete.
expresión y actividad enzimática de NOX
se observó la expresión de NOX1 y NOX2 ser upregulated significativamente en los ratones DL y DL + DMSO en comparación con ratones normales, que fue modulada hacia nivel normal mediante el tratamiento de cúrcuma [Fig. 2 (A)]. Se encontró que la expresión de NOX1 en aproximadamente 1,75 veces y 1,44 veces de ratones normales en el hígado de ratones DL y DL + DMSO respectivamente. tratamiento de cúrcuma redujo la expresión que fue de aproximadamente 83%, 86% y 72% de los ratones DL + DMSO con la dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal respectivamente. De manera similar en comparación a la normalidad, se encontró expresión de NOX2 para ser aproximadamente 2,7 veces y 2,38 veces en el hígado de ratones DL y DL + DMSO, respectivamente, que se regula hacia abajo después del tratamiento la curcumina tal como se observó en aproximadamente 60%, 86% y 87% de los ratones DL + DMSO con la dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal respectivamente. Del mismo modo se observó actividad de NOX a ser elevados como su expresión mRNA. NOX regula la formación de ROS; por lo tanto, la actividad de NOX se puede medir como un indicador de nivel de ROS. En comparación con los ratones normales, la actividad de NOX1 fue de aproximadamente 1,6 veces y 1,45 veces en la actividad de NOX2 era 1,37 veces y 1,3 veces en el hígado de ratones DL y DL + DMSO respectivamente. Diferentes dosis de tratamiento de cúrcuma modular significativamente la actividad hacia el nivel normal. Se encontró que la actividad de NOX1 en aproximadamente 86%, 70% y 80% de los ratones DL + DMSO, mientras que se encontró que la actividad de NOX2 en aproximadamente 78%, 84% y 84% de los ratones DL + DMSO con la dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 2 (C)].
Efecto de la curcumina sobre la expresión de ARNm y la actividad enzimática de NOX isoenzimas en el hígado de ratones portadores de linfoma (A) RT-PCR de NOX2, NOX1 y genes beta-actina, (B) densitométrico de barrido de Nox2 y Nox1 genes después de la normalización con β-actina, (C) la tinción específica que muestra la actividad de las isoenzimas de NOX, (D) de escaneo densitométrico de la banda de la actividad de las isoenzimas de NOX. Los hígados de los seis animales de cada grupo se agruparon por separado y utilizados para la extracción de ARN total y proteínas en la condición de no desnaturalización. Los datos representan la media ± S.E.M.#P & lt; 0,05 y ## & lt; 0,01 comparado con el grupo N, * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 comparado con el grupo DL + DMSO respectivamente. Cur es la curcumina, M es 100 pb y marcador de peso corporal es el peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 y DLT150 representa normales, el cojinete de linfoma de Dalton, el linfoma de Dalton ratones tratados con DMSO y de Dalton linfoma ratones tratados con 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal disueltos en DMSO, respectivamente, teniendo cojinete.
nivel de H
2O
2 y ROS total en el tejido hepático
el nivel de H2O2, siendo un indicador de estrés oxidativo refleja el estado oxidativo del tejido. El nivel de peróxido de hidrógeno en el hígado de ratones DL y DL + DMSO fue significativamente elevado, hasta aproximadamente 1,47 veces y 1,39 veces de ratones normales, respectivamente. tratamiento curcumina redujo significativamente el nivel de hasta 82% de los ratones DL + DMSO con ratones 100 mg de curcumina /kg de peso corporal, y 96% y el 90% de los ratones DL + DMSO con 50 y 150 mg de curcumina ratones /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 3 (A)]. ROS sintetizada por NOX y de otros actos fuentes como una molécula de señalización importante en microambiente tumoral oxidativo para inducir la transformación oncogénica. ROS nivel total en términos de fluorescencia (absorbancia) /mg de proteína fue significativamente elevado en ratones DL y DL + DMSO hasta aproximadamente 2,59 veces y 2,64 veces mayor de los ratones normales. Tratamiento de la curcumina suprime nivel ROS significativamente, que se observó en aproximadamente 62%, 51% y 67% de los ratones DL + DMSO con la dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 3 (B)].
Efecto de la curcumina sobre el estrés oxidativo en términos de nivel de H2O2 total y nivel total de ROS en el hígado de ratones portadores de linfoma (A) Histograma muestra el nivel total de H2O2 en diferentes grupos, (B) Histograma muestra el nivel total de ROS en diferentes grupos. Los hígados de los seis animales de cada grupo se agruparon por separado y homogeneizado se preparó para la determinación de H2O2 y ROS nivel. Los datos representan la media ± S.E.M.#P & lt; 0,05 comparado con el grupo N, * p & lt; 0,05 comparado con el grupo DL + DMSO respectivamente. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 y DLT150 representa normales, el cojinete de linfoma de Dalton, el linfoma de Dalton ratones tratados con DMSO y de Dalton linfoma ratones tratados con 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal disueltos en DMSO, respectivamente, teniendo cojinete.
La expresión de HIF-1α y cMyc
La expresión del ARNm de HIF-1α y cMyc se estudió como un gen de respuesta temprana y el estrés oncogén, respectivamente, en el microambiente del tumor hipóxico. La expresión tanto de HIF-1α y cMyc fue hasta regulado en ratones DL y DL + DMSO en comparación con ratones normales, que se redujo significativamente por el tratamiento curcumina [Fig. 4 (A)]. Se encontró que la expresión de HIF-1α en el hígado de los ratones DL y DL + DMSO para ser aproximadamente 1,85 veces y 1,51 veces mayor de los ratones normales, respectivamente. El nivel de expresión después del tratamiento curcumina fue de aproximadamente 93%, 91% y 78% de los ratones DL + DMSO con la dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal respectivamente. Del mismo modo, se encontró expresión de cMyc ser aproximadamente 2,03 veces y 1,45 veces de ratones normales en el hígado de ratones DL y DL + DMSO, respectivamente, y después del tratamiento curcumina la expresión se redujo a aproximadamente 95%, 83% y 78% de ratones DL + DMSO con la dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente.
Efecto de la curcumina en la expresión del ARNm del gen activado por el estrés HIF-1α y cMyc en el hígado de ratones portadores de linfoma (a) RT -PCR de HIF-1α, cMyc y genes beta-actina, (B) de escaneo densitométrico de HIF-1α y genes cmyc después de la normalización con β-actina. Los hígados de los seis animales de cada grupo se agruparon por separado y utilizados para la extracción de RNA total. Los datos representan la media ± S.E.M.#P & lt; 0,05 y ## & lt; 0,01 comparado con el grupo N, * p & lt; 0,05 comparado con el grupo DL + DMSO respectivamente. Cur es la curcumina, M es 100 pb y marcador de peso corporal es el peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 y DLT150 representa normales, el cojinete de linfoma de Dalton, el linfoma de Dalton ratones tratados con DMSO y de Dalton linfoma ratones tratados con 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal disueltos en DMSO, respectivamente, teniendo cojinete.
expresión y actividad enzimática de la LDH-a
La expresión del ARNm de la LDH-a en el hígado de los ratones DL y DL + DMSO se reguló hasta aproximadamente 1,4 veces y 1,4 pliegue de ratones normales, respectivamente. Todas las dosis de curcumina significativamente las reguladas la expresión. La expresión después de tratamiento de cúrcuma se encontró que era aproximadamente 90%, 79% y 80% de los ratones DL + DMSO con la dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 5 (A)]. El piruvato no puede ser metabolizado aeróbicamente pero se convierte en lactato por LDH-A en microambiente del tumor hipóxico. Por lo tanto, el metabolismo glicolítico puede monitorizarse en términos de la actividad de LDH-A. Se encontró que la actividad de la LDH-A para ser elevado hasta aproximadamente 1,76 veces y 1,64 veces de ratones normales en el hígado de ratones DL y DL + DMSO respectivamente. Tratamiento de la curcumina redujo significativamente la actividad de LDH-A, que fue de aproximadamente 75%, 67% y 85% de los ratones DL + DMSO con las dosis de 50, 100 y 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 5 (C)].
Efecto de la curcumina sobre la expresión de ARNm y la actividad enzimática de la LDH-A en el hígado de ratones portadores de linfoma (A) RT-PCR de la LDH-A y genes beta-actina, (B) barrido densitométrico de LDH-A después de la normalización con β-actina, (C) la tinción específica que muestra la actividad de LDH-A, (D) de escaneo densitométrico de la banda de la actividad de LDH-A. Los hígados de los seis animales de cada grupo se agruparon por separado y utilizados para la extracción de ARN total y proteínas totales en condición de no desnaturalización. Los datos representan la media ± S.E.M.#P & lt; 0,05 y ## & lt; 0,01 comparado con el grupo N, * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 comparado con el grupo DL + DMSO respectivamente. Cur es la curcumina, M es 100 pb y marcador de peso corporal es el peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 y DLT150 representa normales, el cojinete de linfoma de Dalton, el linfoma de Dalton ratones tratados con DMSO y de Dalton linfoma ratones tratados con 50, 100 y 150 mg de curcumina /kg de peso corporal disueltos en DMSO, respectivamente, teniendo cojinete.
expresión y el nivel de proteína de PKCa
se encontró que la expresión de ARNm de PKCa ser regulada hasta en ratones DL y DL + DMSO hasta aproximadamente 1,75 veces y 1,65 veces mayor de lo normal ratones. Todas las tres dosis de la curcumina redujo la expresión de PKCa significativamente.