Extracto
Antecedentes
CD44 es un receptor celular importante para los ácidos hialurónico. La estructura del tallo de CD44 codificada por diez exones normales se puede ampliar por diez exones variantes (V1-V10) por corte y empalme alternativo. Hemos tenido éxito en la preparación de MV5 IgM completamente humanos y su anticuerpo cambio de clase GV5 IgG monoclonal (mAb) que reconoce el dominio extracelular de una isoforma de CD44R1 que contiene la región insertada codificado por la variante (v8, v9 y v10) exones y se expresa en la la superficie de diversas células cancerosas epiteliales humanas.
Métodos y Principales conclusiones
Hemos demostrado la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de cáncer humano por una IgG mAb GV5 reformados a partir de un MV5 IgM. El epítopo reconocido por MV5 y GV5 se identificó a una región v8 codificante por el análisis de unión a mAb diversas proteínas CD44 recombinantes mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. GV5 mostraron reactividad preferencial frente a diversas células humanas malignas frente a las células humanas normales evaluados por citometría de flujo y análisis inmunohistoquímico. Cuando las células de carcinoma de cuello uterino humano ME180 se inocularon por vía subcutánea a ratones atímicos con GV5, se observó una inhibición significativa de la formación de tumores. Además, inyecciones intraperitoneales de GV5markedly inhibieron el crecimiento de tumores establecidos visibles desde HSC-3 células de carcinoma de laringe humana que habían sido trasplantados por vía subcutánea una semana antes del primer tratamiento con GV5. A partir de
in vitro
experimentos, la citotoxicidad y la internalización de CD44R1 celular dependiente de anticuerpos parecía ser posibles mecanismos de
actividad antitumoral in vivo por GV5.
Conclusiones
CD44R1 es una excelente diana molecular para la terapia de mAb de cáncer, posiblemente superior a moléculas dirigidas por mAb terapéutico existente, tales como trastuzumab y cetuximab que reconocen familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico humano
Visto:. Masuko K, Okazaki S, Satoh H, Tanaka G, Ikeda T, Torii R, et al. (2012) Efecto antitumoral contra xenoinjertos de cáncer humano por un anticuerpo monoclonal totalmente humano a una variante de 8 epítopo de CD44R1 expresa en las células madre del cáncer. PLoS ONE 7 (1): e29728. doi: 10.1371 /journal.pone.0029728
Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur
Recibido: 15 de agosto de 2011; Aceptó 2 de diciembre de 2011; Publicado: 17 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Masuko et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Proyecto "Academic Frontier" de la Universidad de Kinki (2005-2007) y el Proyecto "Antiaging Center" de la Universidad de Kinki (2008-2012) para las Universidades privadas: búsqueda de subvenciones del fondo de MEXT (Ministerio de Educación, Cultura, Deportes , Ciencia y Tecnología), y también con el apoyo de la "A-PASO (Programa de Transferencia de Tecnología Adaptable y sin fisuras a través Investigación & amp; Desarrollo)" Proyecto (2009-2011): juego de subvención de fondos de la Agencia de Tecnología y Ciencia de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. En esta investigación, el autor correspondiente (TM) colaboró con Kohjin Bio Co., Ltd en el estudio de la ADCC, con Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd en el uso de ratones KM, y con Link Genomics, Inc. en el estudio de inmunohistoquímica. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
CD44 es una glicoproteína de superficie celular de tipo I, que funciona como la adhesión celular importante molécula de ácidos hialurónico [1] - [3]. CD44 Standard (CD44s) codificada por los diez exones normales (ex1-5 y ex16-20) puede ser agrandado por los insertos codificadas por diversas combinaciones de exones variantes (ex6-15 o V1-V10) de CD44 por splicing alternativo [3] , [4]. A pesar de la importancia fisiológica del splicing alternativo de CD44 no está claro, se reportaron algunos CD44 (CD44v) moléculas variantes que se sobre-expresado en diversos tumores malignos de los roedores y los sistemas humanos [5] - [8].
Entre muchos CD44v, CD44R1 [7], [8] que tiene una región insertada codificada por v8 (EX13), v9 (EX14) y exones (EX15) V10 se expresa selectivamente en diversos cánceres epiteliales humanos. Por ejemplo, CD44R1 mRNA es elevada en colon, vejiga, pulmón, laringe y de mama humanos [8], y el análisis inmunohistoquímico (IHA) también reveló que la proteína CD44R1 se-expresó sobre en muestras pleurales de pulmón en comparación con la de los tejidos normales adyacentes, el uso de anticuerpos de conejo policlonales contra la proteína CD44 recombinante [8]. Además, hemos demostrado recientemente que homólogo de ratón de CD44R1 humano se expresa en regiones precancerosas, que posiblemente contiene células madre del cáncer (CSC) o células iniciadoras del tumor, durante la carcinogénesis gástrica de ratón [9], [10].
sin embargo, ya que los anticuerpos específicos completamente humanos monoclonales (mAb) que reconocen el dominio extracelular de CD44R1 humano expresado en células tumorales viviendo no han estado disponibles hasta ahora, sigue siendo llevarse a cabo la evaluación precisa del efecto terapéutico de anti-CD44R1 mAb en tumores malignos humanos. En este estudio, se presenta la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de cáncer humano en ratones atímicos por mAb completamente humanos administrada localmente o sistémicamente reconocer CD44R1, y se discute la especificidad, los mecanismos antitumorales y la utilidad de la lucha contra CD44R1 mAb completamente humanos en la terapia del cáncer.
resultados y Discusión
CD44, que se une hialuronatos, es una molécula creíble marcador de células madre cancerosas [11] - [16], y está implicado de manera significativa en la metástasis de las células tumorales [16] - [ ,,,0],19]. Por lo tanto, CD44 se considera que es una diana molecular prometedora para la terapia del cáncer usando mAb. Desde CD44s se expresa en varios tejidos normales [20], nos hemos centrado en las proteínas CD44v empalme de la variante-selectiva del tumor. Entre más de 1000 teóricamente posibles proteínas de empalme variante CD44v [21], habiendo CD44R1 el inserto codificado por v8, v9 y v10 exones se expresa selectivamente en varias células cancerosas epiteliales [8].
Hemos preparado recientemente cinco contra CD44 humana- mAb completamente humanos IgM (MV1 contra CD44s, y MV2, MV3, MV4 y MV5 contra CD44R1) a partir de la fusión de células entre las células de mieloma de ratón y células de bazo de Kirin-Medarex (KM) ratones [22] inmunizados contra las proteínas CD44 humano recombinante producido en
Escherichia coli
. En este trabajo, se presenta la preparación de cambio de clase anti-IgG humana CD44R1 MAB (GV5), especificidad de MV1, MV5 y GV5, y
in vivo
y
in vitro anti
efecto del tumor de GV5.
IgM e IgG mAb completamente humanos contra las proteínas CD44 humanos se produjeron
Cinco CD44 anti-humano plenamente humano IgM mAb (MV1, MV2, MV3, MV4 y MV5) eran producido contra un CD44 recombinante (R1a; Δex5-v8-V9-V10-Δex16) proteína producida en
Escherichia coli
[8]. MV1 hizo reaccionar con células de hepatoma de rata RH7777 que expresan CD44s o CD44R1, y MV2, MV3, MV4 y MV5 reaccionado específicamente con las células RH7777 que expresan CD44R1 (datos no mostrados). Para evaluar la reactividad de mAb humano con
in vivo
tumores, se realizó IHA (Fig. 1). MV1 y MV5 definitivamente tiñeron las membranas celulares de los
in vivo
tumor uterino humano ME180 cáncer de cuello uterino desarrollado en ratones atímicos, y CD44R1 se expresó de forma heterogénea en xenoinjertos de cáncer humano, aunque MV2, MV3 y MV4 mostraron reacciones relativamente débiles en comparación con MV5 (Fig. 1). Por lo tanto, hemos reformado (clase conmutados) MV5 IgM humana para GV5 IgG humana. Reactividad de GV5 con
in vivo
tumores de ME180 también fue positiva en la membrana celular de estas células tumorales (Fig. 2), y CD44R1 se expresó de forma heterogénea en el tumor como en el caso de la tinción de la ME180 tumor por MV5. En contraste, la expresión de HER2 reconocida con Trastuzumab era relativamente uniforme en el tumor ME180, y la expresión de CD20 reconocido por Rituximab fue completamente negativo.
Las secciones de tejido de tumores ME180 humanos desarrollados en ratones atímicos se fijaron con PFA , y se incubaron secuencialmente con mAb humano, específico de la especie biotinilado de IgG + IgM (H + L), el reactivo ABC anti-humana y la solución de sustrato que contiene DAB y H
2O
2. Los núcleos se tiñeron con hematoxilina.
Las secciones de tejido de tumores ME180 humanos desarrollados en ratones atímicos se fijaron con acetona fría, y se incubaron secuencialmente con mAb primario, específico de la especie biotinilado anti-humano IgG Fc gamma, ABC de reactivos y soluciones de sustrato que contiene DAB y H
2O
2. Los núcleos se tiñeron con hematoxilina. Superior o paneles inferiores muestran, respectivamente, baja o alta magnificación de los tejidos teñidos.
Se determinaron
La especificidad y el epítopo de MV1 y totalmente humano MV5 IgM, IgG y GV5 mAb contra CD44 con cambio de clase
Especificidades de MV1, MV5 y GV5 se compararon para la reactividad con células embrionarias humanas de riñón HEK293F que expresan CD44R1 o CD44s (Fig. 3A), como se describe en otra parte [10], [23]. MV5 y GV5 reaccionaron específicamente con la proteína fluorescente CD44R1-verde (GFP) células que expresan de manera GFP-expresión dependiente; sin embargo, estos mAb no reaccionó con las células que expresan CD44s-GFP, demostrando que GV5 mantiene la especificidad de MV5 y específicamente reconoce una proteína CD44R1 humana mediante citometría de flujo (FCM). Por el contrario, MV1 hace reaccionar con células HEK293F que expresa CD44s-GFP o CD44R1-GFP. La especificidad de mAb humano también se fundamenta en el análisis FCM usando células de rata RH7777 transfectadas con cDNA de CD44s humanos o CD44R1 (datos no mostrados). A continuación, MV1, MV5 y GV5 se evaluaron para la reactividad con varias proteínas CD44 humanos recombinantes fusionadas a la glutatión S-transferasa (GST) (Fig. 3B). R1a es un inmunógeno para la producción de anti-CD44 mAb humano, y R1b contiene polipéptidos más cortos en regiones eX5 y V8 que R1a. El epítopo definido con mAb completamente humano se localizó en una región ex5 codificante para MV1, y una región codificante para v8 MV5 y GV5 por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). El epítopo péptido definido con MV5 o GV5 parecía estar expuesta en las células humanas debido a que estos mAb reaccionaron definitivamente y específicamente con células HEK293F que expresa CD44R1, aunque CD44R1 está fuertemente glicosilada y la expresión de estos epítopos puede ser afectada por la glicosilación varían entre tipos de células o condiciones de las celdas.
(a) MV1 (izquierda), MV5 (centro) y GV5 (derecha) se compararon para la reactividad con las células que expresan HEK293F humana CD44R1-GFP (superior) o CD44s-GFP humanos (inferior) por FCM. (B) la reactividad de anticuerpos contra diversas proteínas CD44 recombinantes GST-fusionado (R1a y R1b; Δex5-V8-v9-v10-Δex16, V8, V9, V10 y ex5) fusionado a GST se determinó por ELISA. Diferencia en la longitud de Δex5 y Δex16 entre R1a y R1b proteínas recombinantes se describe en "Materiales y Métodos".
Anti-CD44R1 GV5 totalmente humano reacciona selectivamente con líneas celulares de carcinoma humano, pero no con varios las células humanas normales
Algunos de los mAb terapéuticos existentes están orientados al receptor de crecimiento epidérmico humano (HER) de la familia [24] - [27]. Se comparó la reactividad de GV5, Cetuximab (anti-HER1) y Trastuzumab (anti-HER2) con células HCT116 de cáncer de colon humano, queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (Fig. 4A, C) . GV5, cetuximab y trastuzumab fueron definitivamente reactivo con células de cáncer humano HCT116. GV5 reaccionó débilmente con NHEK, aunque Cetuximab fuertemente y Trastuzumab reaccionaron moderadamente con NHEK. Además, GV5 era casi no reactivo con HUVEC, a pesar de Cetuximab y Trastuzumab hacen reaccionar sustancialmente con HUVEC. A continuación, se analizó la reactividad de GV5 contra varias líneas celulares humanas adicionales (Fig. 4B). GV5 definitivamente hace reaccionar con varios tipos de cáncer epiteliales humanas cultivadas (BT20 de mama, KATOIII estómago, LS-174T de colon, cuello del útero ME180, KPK-1 de riñón y KU-1 de la vejiga), aunque este mAb no reaccionó o sólo débilmente hace reaccionar con Molt-4 T leucemia, SK-MEL-37 melanoma y las líneas celulares no cancerosas de la piel del adulto (EK325), intestino fetal (Int407) y de riñón embrionario (HEK293F). GV5 también reaccionó con MKN-7 estómago y líneas celulares de carcinoma de cuello uterino HeLa-S, pero no con U-2OS osteosarcoma, Jurkat, Daudi y líneas celulares de leucemia HL60 (Fig. 4C). Expresión de CD44R1 en muchas células de carcinoma fue heterogénea (Fig. 4B), como en los casos de xenoinjertos humanos en ratones atímicos (Fig. 1, Fig. 2). Además, GV5 no reaccionó con descansando linfocitos pequeños en absoluto; es también de interés que no reacciona con los linfocitos estimulados con interleuquina-2 recombinante humana (IL-2) durante 48 h o 12
O
-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), además de Ca ionóforo ( A23187) durante 24 h, lo que indica que activan los linfocitos T y B no son reactivos con GV5 (Fig. 4C). La especificidad de GV5 indica que CD44R1 es una molécula diana tumor-selectivo y superior en comparación con HER1 o HER2. De hecho, se observó toxicidad grave de la piel en el tratamiento de pacientes con cáncer de Cetuximab contra colon, probablemente a causa de la unión a HER1 en los queratinocitos de la piel. En el contexto de la expresión de HER2, GV5 reaccionó fuertemente con una línea triple negativo de células de cáncer de mama BT20 que no expresa los receptores de estrógeno y progesterona y HER2, aunque este mAb no reaccionó con HER2-sobre-expresión de SK-BR-3 línea celular de cáncer de mama (Fig. 4B, C). Por lo tanto, esperamos que el anti-CD44R1 mAb terapéutico podría compensar mAb anti-HER2 en la terapia de los cánceres de mama.
GV5, cetuximab y Trastuzumab se compararon para la reactividad con HUVEC, NHEK y HCT116 de FCM (histogramas ) con un flujo de Accuri C6 citómetro de (A). Reactividad de GV5 con varias células humanas se analizó mediante FCM, y representado como histogramas (B) utilizando un BD-LSR citómetro de flujo y como ΔMFI (C) utilizando un citómetro de flujo Accuri C6.
CD44R1 era detectado específicamente en tejidos de cáncer epiteliales humanas
en primer lugar, la distribución de CD44s y CD44R1 en los cánceres humanos se analizó con mAb de rata (RV7 y RV9) contra CD44 humano, ya que la inmunotinción de tejidos humanos con GV5 seguido de anti-humana inmunoglobulinas no resultaron en el resultado obvio (datos no mostrados). En IHA en los tejidos de mama y de colon humanos (Fig. 5), ambos CD44s y rv7 definidos RV9 definidos CD44R1 (v8) fueron definitivamente expresa en la membrana celular de células de mama y el cáncer de colon, aunque CD44s pero no CD44R1 también se expresó en las células en el estroma. La expresión de CD44R1 en las células epiteliales de mama normales era baja y fue negativo en las células epiteliales del colon. Además, CD44R1 se expresó de forma heterogénea en células de cáncer, como en el caso de la tinción de xenoinjertos de cáncer humano (Fig. 1 y Fig. 2) y las líneas celulares de cáncer (Fig. 4B) por GV5 anti-CD44R1 mAb humano. En IHA en amígdalas humanas, RV9 anti-CD44R1 (v8) débilmente mAb tiñó el epitelio, especialmente las células de la capa basal, pero no teñir las células linfoblastoides en el centro germinal del tejido de las amígdalas, aunque RV7 anti-CD44s mAb células definitivamente manchada en esta región, además de las células en todo el epitelio (datos no mostrados). Estos resultados coinciden bien con la no reactividad de GV5 con linfocitos humanos activados (Fig. 4C). Estos resultados de FCM y IHA han demostrado una excelente cáncer-especificidad de CD44R1, indudablemente superior a la de CD44s. A continuación examinó la reactividad de GV5 biotinilado con muestras de tejido humano. GV5 definitivamente hace reaccionar con carcinomas epidermoides de cuello uterino (cáncer primario), la piel (cáncer primario) y pulmón (cáncer metastásico a los tejidos blandos), adenocarcinomas de estómago y de colon, pero no con los nódulos linfáticos agregados de apéndice vermiforme (Fig. 6). Por lo tanto, la expresión de CD44R1 se limita a cánceres epiteliales, y no está elevada en el proceso de activación de linfocitos
o in vitro
in vivo
, aunque la expresión de una oncoproteína intrínseca dada en linfocitos a menudo se regula en marcha por diversos estímulos de activación [28], [29].
La reactividad de CD44s anti-humanos o CD44R1 (v8) mAb de rata anti-humano con secciones de mama y de colon tejidos humanos a partir de muestras quirúrgicas era analizado con tinción con inmunoperoxidasa ABC. Secciones de PFA-fijo y tejidos de mama y de colon humanos incluidos en parafina fueron tratados con microondas en tampón de citrato para la recuperación de antígenos, y se incubaron con mAb o RV7 RV9 rata. Después de ser enjuagados en PBS, las secciones de tejido se incubaron secuencialmente con IgG de burro biotinilado específico de la especie anti-rata (H + L), el reactivo ABC y la solución de sustrato que contiene DAB y H
2O
2. Los núcleos se tiñeron con hematoxilina. tejidos que no tienen cáncer o cáncer significan muestras de un paciente idénticos.
Las secciones de PFA-fijo y tejidos humanos incluidos en parafina fueron tratados con microondas en tampón de citrato para la recuperación de antígenos, y se incubaron con biotina GV5. Después de enjuagar en PBS, las secciones de tejido se incubaron con solución de reactivos y el sustrato que contiene ABC DAB y H
2O
2. Los núcleos se tiñeron con hematoxilina.
Anti-CD44R1 humana mAb GV5 exhibió
in vivo
efecto terapéutico en los carcinomas humanos en modelos de xenoinjerto
GV5 se evaluó la lucha contra la efecto tumor contra tumores humanos en ratones atímicos. El tamaño de cada tumor formado se mide periódicamente, como se describe en otra parte [30] - [32]. En primer lugar, GV5 se examinó el efecto sobre la formación de tumores por células de cáncer de cuello uterino humano ME180 en un modelo de tumor de neutralización [33]. Este modelo para evaluar el efecto local de los anticuerpos contra el crecimiento del tumor históricamente originó a partir de la prueba de Winn [34] destinados a la evaluación del efecto anti-tumor de los linfocitos T citotóxicos. Las células cancerosas se inocularon por vía subcutánea a ratones atímicos con o sin GV5 (50 g /sitio), y el crecimiento tumoral en GV5 treatedmice fue significativamente inhibido en comparación con la de los ratones de control (Fig. 7). A continuación, se examinó GV5 para el efecto anti-tumor contra un cáncer de laringe humana HSC-3 en un modelo de tumor establecido [35]. En esta administración sistémica de mAb a ratones portadores de tumores, adoptamos deliberadamente intraperitoneal, pero no la inyección intravenosa para la administración de una cantidad exacta de mAb a cada ratón. Siete días después de HSC-3 células se inocularon por vía subcutánea a ratones atímicos y se confirmó un tumor visible en cada ratón, el control del vehículo GV5or se inyectó por vía intraperitoneal dos veces en un intervalo de una semana. En este modelo experimental, el crecimiento tumoral en GV5 treatedmice fue de nuevo inhibió significativamente en comparación con la de los ratones de control (Fig. 8).
se adoptó modelo de tumor de neutralización. Las células tumorales humanas ME180 (1,0 × 10
6) con o sin mAb (50 mg /sitio) en 200 l de PBS se inoculó por vía subcutánea en el flanco dorsal derecha de cada animal. El tamaño de cada tumor formado se mide periódicamente, y el volumen del tumor (mm
3) se calculó por la fórmula 0,4 x (longitud) x (anchura)
2. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas.
modelo de tumor establecido fue adoptada. Siete días después de las células tumorales HSC-3 derivadas de carcinoma de laringe humana (1.0 × 10
6) en 200 l de PBS se inocularon por vía subcutánea a ratones atímicos y tumor visible en cada ratón fue confirmada, 500 l de PBS con o sin GV5 (100 mg) se inoculó por vía intraperitoneal en el día 7 y el día 14 (flechas verticales). El tamaño de cada tumor formado se mide periódicamente, y el volumen del tumor (mm
3) se calculó por la fórmula 0,4 x (longitud) x (anchura)
2. Los resultados se analizaron estadísticamente por
t de Student pruebas
de dos caras (superior), y mediante pruebas de ANOVA de dos vías con medidas repetidas (inferior). Las barras verticales indican las desviaciones estándar.
GV5 inducida por la internalización de CD44R1 y ADCC
in vitro
Para analizar los mecanismos de la
in vivo
efecto anti-tumor de GV5 contra xenoinjertos de cáncer humano en ratones atímicos, internalizaciones de CD44R1, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y dependiente de anticuerpos citotoxicidad celular (ADCC) por GV5 fueron examinados. Dado que la disfunción de CD44R1 por mAb podría conducir a la inhibición del crecimiento o la muerte celular de las células cancerosas a través de una falta de señal de un sustrato de adherencia, se examinó el efecto de GV5 en la distribución de las proteínas CD44 de la superficie celular. Mediante la adición de GV5 a la cultura de HSC-3 células durante 12 h, aproximadamente el 50% de las proteínas CD44R1 desapareció de la superficie celular (Fig. 9A). CDC utilizando GV5 combinado con el ratón, conejo o suero humano no resultó en la muerte de células tumorales (Fig. 9B). En ADCC, los esplenocitos de ratones atímicos fueron pre-cultivadas con IL-2 durante 12 h para mejorar la actividad de eliminación de las células efectoras. Por el uso de células efectoras tratados con IL-2, GV5clearly aumentada la citotoxicidad contra las células tumorales HSC-3 en ADCC (Fig. 9C, D).
(A) las células HSC3 se cultivaron con o sin GV5 ( 10 mg /ml) durante 12 h, y se inmunotiñeron con GV5 seguido de burro conjugado con FITC IgG anti-humana (h + L). proteínas CD44R1 la superficie celular en estas células se detectaron por FCM. Los experimentos se repitieron tres veces, y se obtuvieron resultados similares. (B) Después de HSC-3 células y sueros para el complemento y mAb se mezclaron y se incubó en cada pocillo de fondo en U de placa de 96 pocillos durante 1 h, se añadió DAPI a cada pocillo. Los porcentajes de células teñidas con DAPI (células muertas) se calcularon por FCM. Los experimentos se repitieron tres veces, y se obtuvieron resultados similares. (C) HSC-3 células (1,5 × 10
5) se mezclaron con las células efectoras de esplenocitos (3 × 10
6 o 9 × 10
6) de ratones desnudos KNS, que eran pre-cultivadas durante la noche con IL-2, con o sin mAb, en cada pocillo de fondo en u de placa de 96 pocillos durante 5 h, y PI se añadió a cada pocillo. La citotoxicidad se analizó utilizando un citómetro de flujo Accuri. células diana humana R1, HSC3; R2, las células efectoras de ratón; R3, PI-tiñe las células muertas en R1; R4, PI-sin teñir las células vivas en R1. (D) La muerte celular (%) de HSC-3 células por las células efectoras de ratón (E /T = 0, 20 o 60) con o sin GV5 se representó gráficamente. E /T significa efector a diana relación.
GV5 inducida ADCC eficaz con células efectoras humanas
Desde que confirmó la actividad ADCC de GV5 con células efectoras del ratón, el próximo examinado la actividad ADCC de GV5 con células efectoras humanas. GV5 mostró actividad ADCC significativa contra HSC-3 células tumorales con linfocitos estimulados con IL-2 humanos de sangre periférica (PBL) como células efectoras, incluso a un efector bajo /diana (E /T) proporción de 2,5 (Fig. 10A). En una relación de T de 10 E /, GV5 mostró aumentada citotoxicidad contra HCS 3-células en comparación con las células efectoras humanas por sí solos, en todos los puntos de tiempo entre 2 h y 7 h (Fig. 10B).
HSC-3 Las células fueron marcadas con calceína-AM, y células (2 × 10
5) se mezclaron con células efectoras de PBL humanos (5 × 10
5 o 2 × 10
6), que fueron pre-cultivadas durante la noche con IL-2 con o sin mAb en cada pocillo de fondo en u de placa de 96 pocillos durante 7 h. La citotoxicidad fue evaluada por la liberación de calceína-AM por células muertas del tumor en el medio, y los resultados se registraron automáticamente utilizando un microfluorocytometer VP Terascan en intervalos de 1 h durante 7 h. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas (A) y de Student bilateral
t
pruebas (A y B). Los puntos y las barras verticales muestran, respectivamente, los medios y los errores estándar.
En este estudio, hemos producido con éxito mAb GV5 completamente humano que reconoce específicamente CD44R1, y demostró la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de cáncer humano en ratones atímicos por GV5 . En cuanto a los mecanismos antitumorales contra xenoinjertos humanos por GV5 en ratones sin timo, nos proponemos tentativamente la contribución de la internalización inducida por CD44R1 GV5 y la citotoxicidad aumentada en ADCC por las células efectoras del ratón con GV5. También esperamos que GV5can mostrar un efecto terapéutico ADCC mediada por tumores malignos humanos, ya que GV5has mostraron actividad ADCC con PBL humanos como células efectoras. Efectos de la anti-CD44R1 mAb sobre la incorporación de hialuronato son ahora bajo investigación; Sin embargo, ya hemos confirmado que GV5 podría inducir la internalización de CD44R1 de la superficie celular, lo que sugiere posibles efectos sobre la incorporación de hialuronato y efecto anti-tumoral aumentada de este mAb, además de la actividad ADCC.
Recientemente, mAb quimérico o humanizado específica contra los dominios extracelulares de HER2 [24], [25], HER1 [26], [27] y CD20 [36] - [38] se han introducido para el tratamiento de cáncer de mama, cáncer colorrectal o B tumores malignos de células, respectivamente. Aunque recientemente se han realizado ensayos clínicos de fase I con anti-CD44v6 mAb quimérico contra carcinomas de células escamosas [39] - [41], se observó una toxicidad grave de la piel probablemente debido a la unión a CD44v6 en los queratinocitos de la piel [39], [40]. En este contexto, la reactividad de GV5 con queratinocitos de la piel humanos normales fue negativo o insignificante (Fig. 3A), lo que sugiere baja toxicidad de nuestra anti-CD44R1 (v8) mAb completamente humanos de la piel.
La evidencia acumulada ha demostrado que CD44 se expresa característicamente en células madre cancerosas de orígenes diversos tejidos [11] - [16]. Ahora nos centramos nuestra atención en CD44v (CD44R1) pero no CD44s expresa en la superficie de las células madre cancerosas en la región precancerosa de los adenocarcinomas gástricos de
K19-Wnt1 /C2mE
ratones transgénicos [9], [10]. Reactividad de GV5 con ME180 o HSC-3 parecía relativamente heterogénea; sin embargo, la formación de tumores o el crecimiento del tumor fue casi completamente inhibida por GV5, lo que sugiere que los CAC se componen principalmente de GV5 reactivos CD44R1
pilas de gran pero no de GV5-no reactivos CD44R1
células bajos. En este contexto, nuestros datos recientes han proporcionado pruebas de que la expresión de CD44R1 y su asociación con xCT detoxificador cisteína-glutamato, una subunidad de la cadena ligera de CD98 oncogénica [10], [23], [30] - [32], [42 ], [43], bloquear la especie de oxígeno reactivo (ROS) inducida por la señalización que da como resultado la detención del crecimiento, la diferenciación celular y la senescencia, y de ese modo promover la proliferación de células de cáncer y la formación de tumores gastrointestinales letales [44] estrés. Dado que las CSC CD44R1 expresan juegan un papel central en la resistencia a la terapia del cáncer, hay que postula que mAb terapéutico podría apuntar al CD44R1
población celular elevada en el cáncer.
análisis Nuestro presente fuertemente indican que la terapia del cáncer con anti-CD44R1 mAb completamente humanos es prometedor, especialmente contra varios cánceres epiteliales humanos, tales como adenocarcinomas de mama, estómago y colon, carcinoma de células transicionales de la vejiga y carcinoma renal, además de los carcinomas de células escamosas de varias regiones del cuerpo.
Materiales y Métodos
células y condiciones de cultivo celular
Las líneas celulares de carcinoma de laringe humana (ca) (HSC-3), ca de mama (BT20, SK-BR-3) , CA gástrico (GAS-1, MKN-7, MKN-28, KATOIII), ca colorrectal (LS-174T, HCT116), cuello uterino ca (ME180, HeLa-S), ca renal (KPK-1, TOS-1 ), ca vejiga (KU-1), melanoma (SK-Mel-37), osteosarcoma (U-2OS), intestino fetal (Int407) y una línea celular de hepatoma de rata (RH7777;. generosamente proporcionado por Tanabe Mitsubishi Pharm) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), complementado con un 7% inactivado por calor suero bovino fetal (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, EE.UU.) en un incubador humidificado (5% de CO
2) a 37 ° DO. GAS-1, MKN-28 o TOS-1, respectivamente, se obtuvo a partir Kotanagi H (Universidad de Akita), Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (JCRB) Banco de Células o Satoh M (Universidad de Tohoku). leucemias de células T (Jurkat, Molt-4), leucemia de células B (Daudi), leucemia promielocítica (HL60) de origen humano, PBL humana con o sin interleucina humana recombinante 2 (IL-2, 100 IU; amp Shionogi &; Co . Ltd., Osaka, Japón) y de ratón esplenocitos con IL-2 (100 UI) de ADCC, mielomas de ratón (SP2, X63) y las células de hibridoma establecidas se cultivaron en medio RPMI 1640 (RPMI; Sigma-Aldrich), complementado con 7% inactivado por calor FBS en las condiciones mencionadas anteriormente. Para obtener linfocitos humanos activados por FCM, PBL también se cultivaron y se estimularon con IL-2 (100 UI) durante 48 h o 12-
O
-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA, 20 ng /ml; Sigma -Aldrich) más ionóforo de Ca (A23187, 0,3 M; Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU.) durante 24 horas en RPMI con FBS al 7%. HUVEC (Takara Bio Inc., Otsu, Japón) se mantuvieron en medio EGM-2 (Lonza, Walkersville, MO, EE.UU.) y se utiliza en tercero a quinto pasajes. NHEK (Takara Bio Inc.) se cultivaron en HuMedia-KG2 (Lonza) y se utiliza en la tercera a cuarta pasajes. células embrionarias humanas HEK293F renales (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y una línea celular de queratinocitos derivados epidérmico humano (EK325) establecidas por nosotros se cultivaron en FreeStyle293 medio de expresión (Invitrogen) en un incubador humidificado (5% de CO
2 ). GFP se fusionó genéticamente al extremo carboxilo terminal citoplasmática de CD44s humanos o CD44R1 en un vector de expresión pAcGFP (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA), y las células HEK293F y RH7777 fueron transfectadas, respectivamente, con estos plásmidos CD44-GFP por 293fectin (Invitrogen) o Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seleccionado utilizando medios de cultivo que contiene G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) se diluye a 400 mg /ml, y el clon-ordenados para fluorescencia verde celular utilizando un clasificador de células JSAN (Bay Bioscience, Kobe, Japón). Estas líneas de células HEK293F y RH7777 establecidos que expresan proteínas de CD44-GFP se mantuvieron en medio de expresión FreeStyle293 con G418 (400 mg /ml). Las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), a menos que se indique lo contrario. La mayoría de las líneas celulares que contienen HSC-3 fueron mencionados en otra parte [45].
existente anticuerpos monoclonales terapéuticos
Anti-HER1 quimérico Cetuximab (MerckSerono, Rockland, MA, EE.UU.), anti-HER2 humanizado trastuzumab y anti-CD20 quimérico Rituximab (Roche-Chugai, Tokio, Japón) fueron utilizados para la tinción de células o tejidos humanos.
Preparación de un recombinante totalmente humano IgG1 mAb que reconoce CD44R1
MV1, MV2, MV3, MV4 y MV5 completamente humano IgM mAb se prepararon a partir de la fusión celular entre células de bazo de-Medarex Kirin ratones (KM) (22) inmunizados contra a-v9-Δex5-V8-V10 Δex16 proteína recombinante (R1a) (8) fusionado a la glutatión S-transferasa (GST) y las células de mieloma de ratón SP2. Se realizó el procedimiento para la fusión celular y el establecimiento de hibridomas como se describe en la siguiente sección. En las proteínas recombinantes R1a, Δex5 o Δex16 corresponden, respectivamente, a un péptido corto parcial (Δex5, 19 aminoácidos; Δex16, 8 aminoácidos) adyacentes a V8 o V10. ADNc transcrito de forma inversa a partir de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras, que se clonaron a partir de ARN total de células de hibridoma que secretan un IgM (μ, κ mAb humano contra CD44R1 (MV5), se forma de nuevo genéticamente para ADNc de IgG1 humana (γ1, κ