Extracto
Los tumores deficientes en la expresión del transportador asociado con el procesamiento de antígenos (TAP) normalmente no inducen la inmunidad mediada por células T y son resistentes a la lisis de células T. Sin embargo, hemos encontrado que la introducción del gen B7.1 en TAP-negativo (TAP
-) o (TAP1
+) las células de carcinoma de pulmón de murino CMT.64 TAP1 transfectadas pueden aumentar la capacidad de las células para inducir una respuesta inmune protectora contra las células tumorales de tipo salvaje. No se observaron diferencias en la intensidad de las respuestas inmunes protectoras entre TAP
- y TAP1
+ B7.1 expresar CMT.64 células en función de las dosis de inmunización con células γ-irradiado. Mientras que los ratones inmunizados con dosis alta o baja de B7.1 expresan TAP1
+ células TAP rechazado
- tumores, la inmunización única dosis alta con TAP B7.1 expresan
- células como resultado el rechazo del tumor. La inmunidad protectora inducida era dependiente de células T como se demuestra por reducido drásticamente la inmunidad antitumoral en ratones con reducción de células CD8 o CD4. Aumento de las células T mediada respuesta inmune contra TAP
- las células tumorales también se observó en un sistema de células tumorales infectadas por virus. Cuando los ratones fueron inmunizados con una dosis alta de células CMT.64 gamma irradiados infectadas con virus vaccinia que llevan genes B7.1 y /o TAP1, se encontró que las células co-expresión de B7.1 y TAP1, pero no los que expresan B7. 1 sola, induce inmunidad protectora contra las células CMT.64. Además, la inoculación con células tumorales vivas transfectadas con varios gen (s) diferente reveló que las células solamente B7.1- y TAP1-coexpresan tumorales disminuyó significativamente la tumorigenicidad. Estos resultados indican que B7.1-provocado la inmunidad antitumoral contra TAP
- el cáncer se ve facilitada por TAP1-expresión, y por lo tanto ambos genes deben ser considerados para la terapia del cáncer en el futuro
Visto:. Li XL, Liu YY, Knight D, Odaka Y, Mathis JM, Shi R, et al. (2009) Efecto de la coestimulación B7.1 sobre la inmunidad de base de células T contra el cáncer de TAP-negativo puede ser facilitado por la Expresión TAP1. PLoS ONE 4 (7): e6385. doi: 10.1371 /journal.pone.0006385
Editor: Derya Unutmaz, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Marzo, 2009; Aceptado: 18 Junio 2009; Publicado: 24 Julio 2009
Derechos de Autor © 2009 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Junta de Regentes de Louisiana, Feist-Weiller Cancer Center Programa de Terapia génica del Estado de Louisiana y el Departamento de Biología celular & amp; Anatomía en LSU Health Sciences Center-Shreveport. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Qian Jin-Zhang posee acciones de TAPIMMUNE INC Xiao-Lin Li fue apoyada parcialmente su salario por TAPImmune Inc a través de la Universidad de la Columbia británica, Canadá hace cuatro o año en que trabajó en la Universidad de la Columbia británica, Canadá. El trabajo actual no tiene el apoyo de esta empresa.
Introducción
Una estrategia eficaz contra el cáncer es la inducción de inmunidad CD8
+ de células T [1]. Sin embargo, los tumores deficientes en la clase principal complejo de histocompatibilidad I (MHC-I) la presentación de antígenos a menudo evaden la destrucción inmunomediada [2], [3],. La deficiencia en la expresión de TAP se observa frecuentemente en el cáncer humano [2], [3]. TAP se compone de TAP1 y TAP2 subunidades cuya función es el transporte de péptidos generados citosólicas-en el lumen del retículo endoplásmico (ER) para MHC-I de unión, seguido por el transporte de los complejos MHC /péptido-I a la superficie celular. La falta de expresión de TAP (una o ambas subunidades) en las células tumorales generalmente inhibe la expresión de los antígenos de péptidos TAP-dependiente en la superficie celular, lo que resulta en un fracaso de CD8 reconocimiento
+ de células T.
Aunque la presentación de antígenos de péptido TAP-dependiente es limitada, las células deficientes en TAP son capaces de presentar antígenos TAP-independiente. Por ejemplo, ratón T-linfoma de células RMA-S que expresan sólo TAP1 [6] y células humanas T2 T e híbridos B que carecen tanto TAP1 y genes TAP2 [7] puede presentar algunos MHC-I Restringido antígenos TAP independiente derivados de proteínas ubicada dentro o fuera de la luz del RE [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Diferentes capacidades para la presentación de antígenos también se observan entre las células tumorales TAP-negativos y positivos TAP1. Gabathuler, R et al. informar de que la introducción del gen TAP1 en las células tumorales en TAP negativo cambia el modo de presentación de antígenos para asemejarse a la de las células RMA-S TAP1-positiva, como se indica por el hecho de que un antígeno viral derivado de se puede presentar de manera eficiente en la superficie de las células tumorales TAP1-possitive pero no TAP-negativas [14]. A pesar de que los antígenos de TAP-independiente pueden ser presentados por las células tumorales TAP1-positivos o TAP-negativas, el fracaso de las células para inducir de manera eficiente una gran población de antígeno específico de tumor CD8
efectores + de células T pueden ser una razón importante que limita la eficacia de la inmunidad antitumoral. Tal inmunidad antitumoral se puede aumentar mediante la introducción de un gen B7.1 en las células tumorales deficientes en TAP como informes indicado [13], [15].
B7.1 es una molécula coestimuladora que interactúa con CD28 en los linfocitos T y desempeña un papel importante en la inducción inmune. Los tumores transducidas con B7.1 pueden provocar CD8 dependientes respuestas antitumorales
+ de células T [16], [17], [18]. En particular, B7.1 transfectadas TAP1 células que expresan RMA-S se puede obtener clones de células T que reaccionan con TAP1 o células tumorales deficientes en TAP2, pero no con células tumorales en TAP competente [13]. Uno de tales clones de células T reconoce un antígeno-Lass5-proteína derivados de ER-localizada que se presenta exclusivamente por otras células deficientes TAP1 o TAP2 RMA-S y y protege a los ratones de desafío RMA-S tumor [13]. Estos estudios proporcionan información útil sobre la imprimación de la inmunidad basada en células T contra variantes de escape inmunitario tumorales en la inmunoterapia del cáncer. Sin embargo, en muchos casos, el cáncer humano exhibe un fenotipo TAP-negativo, y por lo tanto todavía no está claro si la expresión de B7.1 en estas células tumorales pueden provocar la inmunidad de células T de protección o si la expresión de ambos genes B7.1 y TAP1 es necesaria para generar dicha inmunidad.
En este estudio, hemos utilizado un carcinoma de pulmón línea celular murina CMT.64 como un sistema celular modelo para abordar esta cuestión. Las células CMT.64 son defectuosos tanto en TAP1 y TAP2 en los niveles de transcripción y traducción y expresan niveles bajos de moléculas de MHC-I [14], [19]. Nos transfectadas las células con el gen o bien CMT.64 B7.1 B7.1 solo o junto con genes TAP1 ratón, y se encontró que los transfectantes indujeron diferentes respuestas inmunitarias antitumorales. B7.1 y TAP1 co-expresión en células tumorales disminuye significativamente su tumorigenicidad mientras que la expresión B7.1 solo en las células no tiene ningún cambio. Sin embargo, tanto las células co-expresión de B7.1 que expresan y B7.1 y TAP1 aumentaron drásticamente la capacidad para la generación de la inmunidad de protección por la alta dosis de inmunización tumor. En la baja dosis de inmunización tumor, sólo las células co-expresión de B7.1 y TAP1 proporcionan inmunidad protectora. Estos resultados sugieren que B7.1 y TAP1 co-expresión en células tumorales es importante para el cebado de células T.
Resultados
B7.1 y expresión TAP1 disminuye tumorigenicidad de CMT deficiente en TAP. 64 células sólo en las células T de ratones competentes
Para evaluar los efectos de la expresión B7.1 sobre las células tumorales TAP1-positivas y negativas-TAP sobre la inmunidad antitumoral, primero analiza la expresión de los genes introducidos en CMT.64 transfectantes. CMT.64 /pp, células CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p, CMT.TAP1 /B7.1 y cl.21 CMT.TAP1,2 fueron transfectadas con dos vectores vacíos, B7.1 + vector vacío , TAP1 + vector vacío, TAP1 + B7.1 o TAP1 + TAP2, respectivamente (ver material y Métodos para más detalles). Después de la selección de medicamentos, los transfectantes expresan el gen correspondiente (s), a excepción de un transfectante /pp CMT.64 que no mostró TAP1, TAP2 o expresión B7.1 (figura 1A y 1B). La expresión génica se mantuvo estable durante el tiempo del estudio. K
B y D
b expresión en la mayoría de los transfectantes fue similar a las células CMT.64 de tipo salvaje, a excepción de las células que expresaban cl.21 CMT.TAP1,2 K
B y D
b moléculas en niveles más altos que la expresada en los otros (Fig. 1C).
se determinó
TAP, B7.1, K
B y D
b expresión en transfectantes CMT.64. A) se detectaron proteínas TAP1 y TAP2 en transfectantes CMT.64 y control de las células RMA mediante transferencias Western utilizando anti-TAP1 y TAP2 anticuerpos policlonales respectivamente (ver Material y Métodos). Se detectaron niveles de expresión de proteína de GAPDH en cada muestra como el control de carga. B) la expresión B7.1 en CMT.B7.1 /py células /B7.1 CMT.TAP1 se detectó mediante ensayos FACS utilizando conjugado con FITC-B7.1 mAb específico 16-10A1. El control es CMT.64 células teñidas con mAb 16-10A1. C) K
B o D
b expresión se detectó mediante ensayos FACS utilizando mAb primaria Y-3 en contra H-2K
bo 28-14-8S contra H-2D
b seguido de tinción con una cabra conjugado con FITC anti-IgG de ratón Ab secundario. células CMT.64 teñidas con un mAb primario 15-5-5S (contra H-2D
k) seguido de tinción con un Ab secundario de cabra conjugado con FITC anti-ratón IgG se utilizaron como control negativo. A: control negativo; b: CMT.64; c: CMT.64 /pp; d: CMT.B7.1 /p; e: CMT.TAP1 /p; f: CMT.TAP1 /B7.1; y g:. CMT.TAP1,2 cl.21
Para evaluar si la expresión de B7.1 en las células tumorales podría disminuir la tumorigenicidad, C57BL /6 ratones fueron inyectados con células vivas o transfectantes CMT.64 y las tasas de supervivencia y /o tiempos se registraron. Los resultados se muestran en la Fig. 2A. Todos los ratones inyectados i.p. con CMT.64 o células /pp CMT.64 (2 grupos de control) murieron antes del día 27 después de la inoculación de las células tumorales. En contraste con dos controles, los ratones CMT.TAP1 /B7.1 portadores mostraron una tasa de supervivencia muy significativa (P«0.05), incluso en comparación con todos los otros grupos de ratones (P«0.05). En el día 100, el 30% de los ratones estaban vivos. Sin embargo, los ratones CMT.B7.1 /P-cojinete no mostraron diferencias significativas, en comparación con dos grupos de control (P & gt; 0,05). CMT.TAP1 ratones /P-cojinete mostró el tiempo de supervivencia significativa en comparación con los dos controles (P & lt; 0,05) pero no hay diferencia de los ratones CMT.B7.1 /P-cojinete (P & gt; 0,05). Los resultados de este experimento demuestran que una disminución sustancial en la tumorigenicidad mediada por la expresión de B7.1 junto con las moléculas de TAP1 en las células tumorales CMT.64.
El tiempo de morbilidad se registró para ratones (cada grupo, n = 10) inoculados con células tumorales vivas o inmunizado con células gamma irradiados y seguido de reto con células CMT.64. Estadísticas para la supervivencia del ratón se obtuvieron mediante la prueba de log rank de supervivencia de Kaplan-Meier y se consideraron significativas a P & lt diferencias; 0,05. A) tumorigenicidad se detectó mediante la inyección de ratones C57BL /6 por vía i.p. CMT.64 con células vivas o sus transfectantes (5 × 10
4 células por ratón). B) Los ratones desnudos fueron utilizados para la determinación de la tumorigenicidad de las condiciones de la inyección del tumor mismo, como se muestra en A), P & gt; 0,05 para todas las comparaciones. C) ratones C57BL /6 se inmunizaron i.p. con diferentes células tumorales gamma-irradiado o PBS a una alta dosis (a la izquierda, 5 × 10
6 células por ratón) o una dosis baja (a la derecha, 5 × 10
5 células por ratón). Después de una inmunización de 20 días, los ratones se estimularon i.p. con células tumorales CMT.64 vivos (2,5 × 10
5 células por ratón). Se observaron diferentes tasas de supervivencia y /o tiempos.
Para determinar si la disminución de la tumorigenicidad de las células /B7.1 CMT.TAP1 estaba mediada por las células T, los ratones desnudos fueron inoculados con células CMT.64 o transfectantes , se determinó y la supervivencia. La Figura 2B muestra que todos los ratones murieron en 25-27 días, lo que sugiere que las células T juegan un papel esencial en la respuesta inmune contra las células CMT.TAP1 /B7.1, lo que resulta en una disminución de la tumorigenicidad.
CMT. B7.1 /p de la inmunización a una dosis alta induce una respuesta inmune tan eficiente como CMTTAP1 /B7.1 de la inmunización, pero es menos eficaz a un bajo dosis
respuestas inmunes antitumorales se pueden aumentar por B7.1- expresando la inmunización de las células tumorales [16], [17], [18]. Para evaluar si la inmunidad protectora contra las células tumorales en TAP negativo puede ser generado por la inmunización con células CMT.TAP1 /B7.1 TAP1 que expresan o células CMT.B7.1 /p TAP-negativas, ratones C57BL /6 se inmunizaron con diferente cantidades de células gamma irradiados seguido de reto con células CMT.64. Los ratones de control se inmunizaron con células /pp CMT.64 gamma irradiados. Los resultados indican una protección dependiente de la dosis. En la alta dosis de inmunización (5 × 10
6 células por ratón), tanto CMT.TAP1 /B7.1-inmunizados y los ratones CMT.B7.1 /P-inmunizados estaban bien protegidos de los ataques del tumor en vivo (Fig. 2C panel izquierdo). Los dos grupos de ratones mostraron una tasa de supervivencia muy significativa (100% de supervivientes), en comparación con el grupo CMT.TAP1 /p inmunizados ratón (60% de supervivientes, p & lt; 0,05). El último grupo mostró una tasa de supervivencia significativamente mayor que el grupo control inmunizado con células CMT.64 /pp TAP-negativas (P«0.05). Sin embargo, en la baja dosis de inmunización (5 × 10
5 células por ratón), los ratones CMT.TAP1 /B7.1 inmunizados tenían una tasa de supervivencia más alta que CMT.B7.1 ratones inmunizados /P (Fig. 2C derecha del panel, P & lt; 0,05). No se observó ninguna diferencia en la tasa de supervivencia entre los ratones CMT.B7.1 /p-inmunizado y CMT.TAP1 /P-inmunizado (P & gt; 0,05). Los resultados sugieren que a la dosis alta de vacunación, B7.1 y TAP1 co-expresión o expresión B7.1 solo hace que las células tumorales potentes inmunógenos, mientras que a baja dosis de inmunización, potente inmunogenicidad requiere células tumorales co-expresan tanto TAP1 y B7.1 moléculas.
CD8
+ células T juegan un papel importante en la protección del ratón
Para determinar si el aumento de la protección después de la inmunización que expresan B7.1 tumor estaba mediada por una célula T basada respuesta inmune, se utilizaron anticuerpos monoclonales para agotar CD8
+ o CD4
+ células T en ratones C57BL /6 antes de la prueba de la inmunización y tumor de células. Los ratones inyectados i.p. con mAb relevante cada dos días durante la primera semana se analizaron mediante ensayos FACS para CD8
+ o CD4
+ población de células T en la sangre. Los resultados mostraron que el tratamiento redujo drásticamente el CD8
+ de células T o CD4
+ población de células T (Fig. 3A). tratamiento con mAb específico anti-CD8 reduce células CD8
+ T de 17,66% a 0,65%, y anti-CD4 tratamiento mAb específico reduce CD4
+ células T de 19,22% a 0,11%. agotado ratones subpoblaciones de células T fueron inyectados con transfectantes CMT.64 gamma irradiados, seguido de reto con células CMT.64 vivo. Los resultados de supervivencia se muestran en la Fig. 3B. El tratamiento con mAb específico anti-CD8 disminuyó significativamente la supervivencia de ratones portadores de tumores. No hubo diferencias biológicamente significativa entre cada grupo de prueba y el grupo control (ratones inmunizados-pp CMT.64 /). Además, el tratamiento con mAb específico anti-CD4 disminuyó parcialmente supervivencia de cada grupo de prueba, en comparación con el grupo control (P«0.05). Los resultados sugieren que la protección de los ratones de la exposición al tumor completamente dependía de CD8 células
+ T y parcialmente dependía de CD4 + células T
.
ratones (cada grupo, n = 10) se inyectaron i.p. con mAb GK1.5 de CD4
+ células T CD8 o 2,43 por
+ células T (0,1 ml por ratón) cada dos días durante la primera semana y una vez por semana después de agotar las células T subpoblación relevante . A) antes de la inmunización de células tumorales γ-irradiado, el agotamiento de CD8
+ o CD4
+ subconjuntos de células T se evaluó en sangre mediante ensayos de FACS utilizando conjugado con FITC anti-ratón CD8a (5H1-1) o conjugado con FITC anti-ratón CD4 (RM4-4) junto con PE /Cy5 conjugado con anti-CD3 de ratón (145-2C11). Las frecuencias de CD8
+ o CD4 se detectaron
+ células T antes del tratamiento MAB (indicados como normal) y después de la primera semana de tratamiento del AM y antes de la inmunización de células tumorales γ-irradiado (indicado como MAB-tratamiento). B) Después de una inmunización de 20 días con células tumorales irradiadas gamma (5 × 10 i.p.
6 células por ratón) los ratones fueron desafiados con células tumorales CMT.64 vivos (2,5 × 10
5 células por ratón). Se registró el tiempo de la morbilidad.
Presentación del antígeno Lass5 TAP-independiente por parte de las células tumorales deficientes en TAP
El hecho de que las células tumorales que expresan B7.1-deficientes en TAP puede generar un CD8
+ de células T respuesta inmune mediada contra las células tumorales en TAP negativo sugiere que el antígeno células tumorales presente TAP-independiente (s) para el cebado de células T. Para determinar si esto es cierto, nos centramos en la D
b-restringido Lass5 epítopo MCLRMTAVM, un antígeno presentado por muchas células deficientes en TAP [13]. células cl.21 CMT.64 y CMT.TAP1,2 expresan el gen Lass5 como se indica por PCR en tiempo real (Fig. 4A izquierda). Sin embargo, las células transfectadas CMT.64 TAP1 TAP-negativo y aunque no TAP-competente células CMT.TAP1,2 cl.21 murieron por una población de células T generada por la inmunización con el péptido Lass5 pulsadas RMA-S células /B7.1 según lo determinado por una prolongada (12-16 h)
ensayo de liberación de 51Cr (Fig. 4A derecha). Las células cl.21 CMT.TAP1,2 TAP competente sólo murieron cuando fueron pulsadas con péptido Lass5 (Fig. 4A derecha), lo que sugiere que las células no se presentan de manera eficiente este epítopo.
A) Izquierda : RT-PCR se realizó para detectar dos empalmados (largo y corto) transcripciones de genes Lass5 [13] en CMT.64, CMT.TAP1,2, CL.2 y las células RMA-S. Sólo el largo transcripción codifica un epítopo Lass5 [13]. A) Derecho: Lass5 presentación de epítopos de células CMT.64 deficientes en TAP y TAP-competente fue detectado por 12-16 h
ensayos de liberación de 51Cr. Las células T específicas Lass5 fueron generados por la inmunización intraperitonealmente con células B7.1 gamma-irradiado RMA-S /pulsadas con péptido 5 mM Lass5. Los esplenocitos inmunizados se volvieron a estimular
in vitro con células B7.1
gamma-irradiado RMA-S /péptido-pulsado Lass5 durante 5 días. Se muestra uno de tres experimentos. B) A la izquierda: 12-16 h
ensayos de liberación de 51Cr se llevaron a cabo para confirmar que un
366-374 población de células T específicas eptitope PN generada por la inmunización con gamma-irradiado RMA-S /células B7.1 pulsaba con 5 M NP
366-374 péptido no contenía células T subpoblaciones que reconocen epítopos en TAP independiente presentados por CMT.64 y sus transfectantes. Los objetivos
labled con 51Cr se muestran en la figura 4B. B) A la derecha: Estándar
se llevaron a cabo ensayos de liberación de 51Cr para confirmar que los transfectantes CMT.64 deficientes en TAP TAP no presentaron dependientes de NP
366-374 epítopo cuando las células se infectaron durante la noche con VV llevar NP
366-374 minigén en multiplicidad de infección (MOI) de 3. Los objetivos
labled con 51Cr se muestra en la figura 4B. El NP
366-374 epítopo de células T específicas se generaron mediante la inmunización con células RMA-S-gamma irradiado /B7.1 pulsadas con 5 M NP
366-374 péptido y re-estimuladas con 5 M NP
366-374 péptido in vitro. ensayo c) un ELISPOT se realizó para detectar Lass5 precursores específicos IFN-gamma secretoras. Se inmunizaron ratones con γ-irradiado CMT.64 /pp, CMT.TAP1,2, CMT.B7.1 /p y células /tumorales B7.1 CMT.TAP1. Los esplenocitos inmunizados se estimularon con o sin péptido Lass5. Se determinó el número de Lass5, IFN- secretoras de precursores específicos de antígeno. frecuencia del precursor se reporta como IFN-γ secretora de células por 10
6 esplenocitos (IFN-γ-SC /10
6 esplenocitos).
Desde que se generó la población de células T por RMA-S /B7.1 células pulsadas con péptido Lass5, no podemos excluir la posibilidad de que la población de células T contiene subpoblaciones de otras células T específicos de epítopo que destruyen las células tumorales deficientes en TAP. Esto es porque las células RMA-S /B7.1 utilizados para la inmunización se ha informado que ser capaz de generar muchos diferentes K
b y D
b clones de células T restringidas [13]. Para eliminar esta posibilidad, hemos generado un D
b-restringida población de células T específicas de la influenza NP
366-374 (ASNENMDTM) epítopo por inmunización con RMA-S /B7.1 células pulsadas con NP
366 -374 péptido utilizando condiciones similares a las de la generación de células T específica Lass5. Las células tumorales no expresan la influenza NP
366-374 epítopo y por lo tanto NP
366-374 epítopo de células T específicas no deben reconocer las células tumorales. Si la población de células T contiene células NP
366-374 epítopos T irrelevantes, tal población de células T puede o bien eliminar las células tumorales deficientes en TAP o no matar a las células. Si las células T destruyen las células tumorales sugiere que este epítopo específico las células T en TAP independiente, distintos de NP
366-374 epítopo, pueden co-generado por inmunización con RMA-S /células B7.1 pulsaron con el PN
366-374 péptido. Si las células T no matan a las células tumorales Esto sugiere que el péptido-pulsado RMA-S /células B7.1 generan una población de células T que contiene las células T que reconocen preferencialmente el epítopo péptido utilizado para la inmunización. Los resultados muestran que las células T generadas no pueden matar a las células tumorales ya sea deficiente en TAP TAP o competente, excepto para CMT.64 células pulsadas con NP
366-374 péptido (Fig. 4B izquierda). Por lo tanto, nuestros resultados confirman que las células tumorales deficientes en TAP presente epítopo Lass5 para el reconocimiento de células T. En contraste con TAP independiente-presentación de epítopos Lass5, las células tumorales deficientes en TAP no fueron capaces de presentar el TAP-dependiente y D
b-restringido NP
366-374 epítopo cuando las células se infectaron con VV que lleva la NP
366-374 minigén (Figura 4 B derecho).
Para determinar si CMT.TAP1 /B7.1, CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /py células /pp CMT.64 son capaces de provocar células T específicas Lass5, se inyectaron las células ip en ratones C57BL /6, y IFN-γ esplenocitos secretan se cuantificaron usando un ensayo ELISPOT. Como se muestra en la Fig. 4C, un gran aumento en el número de Lass5 específico IFN-gamma de esplenocitos secretan se observó en ratones inmunizados con CMT.TAP1 /B7.1 o células /p CMT.B7.1 comparación con los ratones inmunizados con CMT.TAP1 /p o CMT.64 células /pp. Estos resultados indican que las células tumorales TAP-negativos y TAP1 expresan pueden presentar antígenos en TAP independiente, incluyendo antígeno Lass5 y que la expresión B7.1 en las células tumorales proporciona un mejor cebado de células T.
inmunización con CMT. 64 células infectadas con VV-tanto B7.1 y VV-TAP1 aumenta la protección de ratones de la exposición al tumor
un método potencial para la inmunoterapia del cáncer más fiable es el uso de un vector que lleva el gen basado en viral para infectar las células de inmunización. Desde la inmunización con una dosis alta de B7.1 o B7.1 + células transfectadas TAP1 dramáticamente ratones protegidos de reto del tumor (Fig. 2C izquierda), se determinó si la inmunización de ratones con células CMT.64 gamma irradiado infectadas con VV-B7 0.1 + VV-CR19 (virus de tipo salvaje) o VV-B7.1 + VV-TAP1 tienen una protección similar a los ratones inmunizados con células tumorales transfectadas con genes. Se analizaron primera B7.1 y la expresión en células TAP1 CMT.64 infectadas durante la noche con VV-B7.1 + VV-CR19 o VV-B7.1 + VV-TAP1. Hemos observado que la B7.1 y TAP1 fueron altamente expresado en las células infectadas con VV relevantes (Fig. 5A).
CMT.64 células fueron infectadas durante la noche con una combinación de dos VV a una MOI de 3 para cada VV . A) expresión B7.1 se detectó mediante un ensayo de FACS utilizando FITC-conjugado 16-10A1 mAb-B7.1 específico. células CMT.64 sin infección viral se utilizaron como un control negativo. expresión TAP1 se detectó por Western blot utilizando un TAP1 policlonal de cabra anti-ratón Ab. Se utilizaron células RMA-S como control. B) Estándar
ensayos de liberación de 51Cr se llevaron a cabo para detectar si las células tumorales infectadas por virus afectados presentación de antígenos tumorales endógenos. CMT.64 células tumorales se infectaron durante la noche con VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, o VV-B7.1 + VV-TAP1, y se utilizaron como células diana. líneas celulares de control fueron CMT.64, CMT.B7.1 /py CMT.TAP1 /B7.1. células T específicas de antígeno de tumores se generaron por inmunización con células CMT.B7.1 /p gamma-irradiado. relación de transmisión objetivo y el efector se utilizó en 1:100. R: CMT.64; b: CMT.B7.1 /p; c: CMT.TAP1 /B7.1; d: CMT.64 + VV-GFP + VV-GFP; e: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-GFP y f: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-TAP1. ** Indica significancia estadística (P«0.05) usando análisis de ANOVA.
VV infección de tipo salvaje puede inhibir la presentación de antígenos en las células dendríticas [20] y disminuir la viabilidad de las células infectadas. Para evitar estos efectos, se utilizó una VV-GFP recombinante para sustituir de tipo salvaje VV-CR19 para la infección de células basada en viral y la inmunización. Los ratones se inmunizaron i.p. CMT.64 con células (5 × 10
6 células /ratón) infectadas con VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, o VV-B7.1 + VV-TAP1, seguido de se determinó reto con células CMT.64 en vivo y las tasas de supervivencia. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los ratones inmunizados con VV-B7.1 + VV-TAP1 infectadas CMT.64 células mostraron una tasa de supervivencia significativamente mayor, en comparación con los ratones inmunizados con las células infectadas con VV-GFP + VV-GFP (ratones de control ; P & lt; 0,05), mientras que no se observó ninguna diferencia entre los ratones de control y ratones inmunizados con las células infectadas con VV-B7.1 + VV-GFP (P & gt; 0,05). Estos resultados indican que para la inmunización con un sistema de células infectadas por virus, co-expresión de B7.1 y TAP1 en las células es necesario para aumentar la inmunidad protectora antitumoral.
Desde la inmunización con células que expresan B7. 1 solo mostraron diferentes protectora mediada por células T respuestas inmunes entre un sistema de células infectadas por virus y un sistema de células de genes transfectados a una dosis de 5 × 10
6 células por inmunización del ratón, se especuló que los antígenos derivados de virus afectan a la presentación de TAP antígenos tumorales intrínsecos -independiente, disminuyendo de ese modo la capacidad de las células tumorales para el cebado de células T. Para evaluar esta posibilidad, sup
ensayos de liberación de 51Cr estándar se llevaron a cabo utilizando células T citolíticas generados por la inmunización con células CMT.B7.1 /p gamma irradiado (5 × 10
6 células /ratón). CMT.64 células infectadas con VV-B7.1 + VV-TAP1, VV-B7.1 + VV-GFP o VV-GFP + VV-GFP durante la noche fueron utilizados como objetivos y CMT.64 VV-no infectada, CMT.B7. se utilizaron /p y CMT.TAP1 /B7.1 celdas 1 como controles. Como se muestra en la Fig. 5B, el reconocimiento de las células infectadas por virus de las células T se redujo significativamente, en comparación con los controles pertinentes.
En conjunto, llegamos a la conclusión de que la vacunación efectiva con células TAP-negativas infectadas por virus requiere tanto B7.1 y TAP1 co expresión en las células tumorales.
Discusión
Este estudio demuestra que B7.1 y TAP1 co-expresión en células CMT.64 TAP-negativo hace que las células tumorales potentes inmunógenos capaces de inducir eficazmente un CD8
+ de células T mediada respuesta inmune contra los tumores TAP-negativas. Inducida CD8
+ células T reconocen antígenos probable TAP-independientes presentados por las células tumorales deficientes en TAP. Tres factores importantes, TAP1, B7.1 y la cantidad de antígeno (s) parecen contribuir a CMT.64 cebado de las células tumorales de las células T.
Nuestros resultados indican que con una dosis baja de células γ-irradiado la inmunización, los co-expresión de células /B7.1 CMT.TAP1 TAP1 y B7.1 generan una respuesta inmune antitumoral mayor que la inducida por las células CMT.B7.1 /p expresar TAP-negativas y B7.1 (Fig. 2C derecho). Esto indica que la expresión TAP1 juega un papel crítico en la mejora de cebado de células T que sugiere que la expresión TAP1 puede facilitar la presentación eficaz de antígenos tumorales en TAP independiente. La posibilidad de presentación eficiente del antígeno (s) se apoya en la Fig. 5B (calles B y C) lo que demuestra que las células T CMT.B7.1 /P-inducida mataron objetivos CMT.TAP1 /B7.1 por encima de los requerimientos /p CMT.B7.1. Un posible mecanismo de aumento de la presentación de antígenos por TAP1 es que la presentación de algunos antígenos (distintos de los antígenos ER-lumen derivados que se pueden presentar tanto por las células TAP-negativos y TAP1-postive) que se expresan en la célula de su expresión "soportes ' superficie para el reconocimiento de células T y /o cebado de células T. Esta posibilidad es apoyada por la evidencia de que un epítopo de la estomatitis vesicular proteína de la nucleocápside del virus derivado de VSV-NP
52-59 que se genera en el citoplasma se pueden presentar por TAP1 expresar CMT.64 células más eficientemente que las células CMT.64 TAP-negativas [14]. Nuestros resultados ponen de relieve la multiplicidad de respuestas inmunes contra los tumores, que son incorporado en el sistema inmune celular. La importancia de estos hallazgos debe estudiarse más a fondo, sobre todo para la identificación de epítopos de TAP-independiente que están bien presentadas y de las características de las células T específicas de epítopo.
B7.1 expresión en las células tumorales puede desempeñar un papel en disminuir el umbral para el cebado de células T específicas de antígeno [21], [22], [23]. Esta posibilidad está apoyada por la observación de que las células T mediada por anti-CMT.64 inmunidad tumoral puede ser aumentada por células que expresan B7.1 tumorales en comparación con células tumorales negativas B7.1 (Fig. 2C izquierda). Los mecanismos involucrados en el cebado de las células T contra tumores CMT.64 por las células deficientes en TAP B7.1 expresando pueden ser preferentemente a través de tumor en lugar de cebado de células dendríticas (DC) cebado cruzado directo. Esto explica por qué la inmunización con B7.1 que expresan CMT.64 células inducidas un alto nivel de inmunidad anti-CMT.64-tumor, mientras que la inmunización con células CMT.64 B7.1-negativa proporcionado significativamente menos inmunidad. Cross-cebado requiere la presentación de antígeno profesional DCs para capturar proteínas antigénicas de células apoptóticas y para procesar y presentar los epítopos generados para el cebado de células T de una manera dependiente de TAP-[24]. Por lo tanto, los epítopos en TAP independiente que se expresan en las células CMT.64 no se pueden presentar en la superficie de la DC para el cebado de células T, ya que estos epítopos similares a los péptidos presentados en las células RMA-S deficientes en TAP [25] generalmente muestran baja capacidad para MHC-I de unión, y por lo tanto no puede competir con epítopos TAP-dependiente para la unión de MHC-I y la expresión de superficie de DC.
la cantidad de antígeno (s) usado para la inmunización afecta directamente a la fuerza de la inmunidad antitumoral generado como se confirma por nuestros resultados con respecto a la inmunización dependiente de la dosis con células gamma irradiados (Fig. 2C izquierda y derecha). Con una alta dosis de inmunización celular, inmunidades altamente protectores fueron generados por tanto CMT.TAP1 /B7.1 y las células CMT.B7.1 /p. Esto sugiere que ambas líneas celulares gamma irradiados suministran cantidades eficaces de antígenos en TAP independiente para la inducción de células T. Con una dosis baja de la inmunización, las células CMT.TAP1 /B7.1 TAP1-positivo estimularon el sistema inmune para generar inmunidad protectora mejor que las células CMT.B7.1 /p TAP-negativas. Esto sugiere que la co-expresión de células /B7.1 CMT.TAP1 TAP1 y B7.1 proporcionan antígenos TAP-independiente de cebado de células T más que la proporcionada por las células que expresan B7.1 /p CMT.B7.1.
Un reciente informe ilustra que la inmunización con células RMA-S TAP1 que expresan B7.1 transfectadas provocó inmunidad protectora a base de células T contra las células RMA-S [13]. Nuestros resultados muestran además que la inmunización con células tumorales que expresan TAP1 o TAP-negativas que expresan B7.1 puede provocar una de células T eficaz respuesta inmune contra el desafío del tumor TAP-negativa mediada. En dicha inmunidad protectora, las células CD8
+ T jugado un papel importante en la respuesta a TAP-negativos células tumorales, mientras que las células CD4
+ T tuvieron un papel importante también. Dado que las células CMT.64 no expresan moléculas MHC de clase II, una de las principales funciones de las células CD4
+ células T pueden ser apoyar CD8 respuestas
+ de células T a las células tumorales [26], [27], [28