Extracto
El tratamiento del cáncer de próstata refractario a las hormonas representa un reto importante en el tratamiento de este tumor, y la identificación de se necesitan nuevos antagonistas del receptor de andrógenos para hacer un tratamiento más eficaz. Se analizó la actividad de dos nuevos antagonistas del receptor de andrógenos, (
S
) -11 y (
R
) -9, en
in vitro e
in vivo y modelos experimentales de cáncer de próstata hormono-sensible o resistente a la castración (CRPC).
in vitro
experimentos se realizaron en LNCaP, LNCaP-AR, LNCaP-RBIC y las células de cáncer de próstata humano VCAP. La actividad citotóxica se evaluó mediante el SRB y la absorción de BrdU, la transactivación AR por ensayo de luciferasa reportero y PSA niveles por ensayos en tiempo real de RT-PCR y ELISA. marcadores relacionados con la progresión del ciclo celular se evaluaron por transferencia de Western.
in vivo se realizaron en
experimentos en ratones SCID transplantados con células con diferente sensibilidad al tratamiento hormonal. En las células LNCaP y LNCaP AR-sensibles a las hormonas, la última expresión de los niveles del receptor de andrógenos, (
R
) -9 y (
S
) -11 exhibieron un efecto citotóxico más alta en comparación con la del compuesto de referencia ((
R
) -bicalutamide), también en la presencia del andrógeno sintético R1881. Además, el efecto citotóxico producido por (
R
) -9 era mayor que la de (
S
) -11 en las dos células LNCaP-AR y VCAP resistentes a las hormonas. Se observó una reducción significativa en los niveles de PSA tras la exposición a ambas moléculas. Por otra parte, (
S
) -11 y (
R
) -9 inhibe la síntesis de ADN al bloquear el aumento inducido por andrógenos en los niveles de proteína ciclina D1.
in vivo
estudios sobre el perfil toxicológico de (
R
) -9 no revelaron la presencia de eventos adversos. Por otra parte, (
R
) -9 inhibe el crecimiento tumoral en varios
in vivo y modelos, especialmente xenoinjertos LNCaP-RBIC, representante de la enfermedad recurrente. Nuestros
in vitro
resultados ponen de manifiesto la actividad antitumoral de las dos nuevas moléculas (
R
) -9 y (
S
) -11, por lo que una opción potencialmente atractiva para el tratamiento de la CRPC
Visto:. Tesei A, C Leonetti, Di Donato M, Gabucci E, M Porru, Varchi G, et al. (2013) Efecto de pequeñas moléculas de modulación del receptor de andrógenos (SARM) en modelos de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 8 (5): e62657. doi: 10.1371 /journal.pone.0062657
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia |
Recibido: 12 Diciembre, 2012; Aceptado: March 25, 2013; Publicado: May 8, 2013
Derechos de Autor © 2013 Tesei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Gabriella Castoria y Marzia Di Donato recibió fondos de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC-IG11520) y el Ministero Italiano per la Ricerca Scientifica (PRIN 2010NFEB9L_002). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen el siguiente conflicto de declarar por Anna Tesei , Greta Varchi Guerrini y Andrea. Drs. Anna Tesei, Greta Varchi Guerrini y Andrea son inventores en la solicitud de patente (WO#/2010/092546) que se basa en los hallazgos descritos en este estudio. Actualmente no hay productos en desarrollo o comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de próstata es el segundo cáncer más frecuentemente diagnosticado y la sexta causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en todo el mundo [1]. En los países desarrollados, entre ellos Italia, es la neoplasia maligna más común en los hombres y en segundo lugar solamente al cáncer de pulmón en términos de mortalidad por cáncer [2], [3]. La cirugía, radioterapia y /o privación de andrógenos son las terapias clínicas más eficaces en las primeras etapas de la enfermedad. En particular, la terapia hormonal conduce a la remisión, que dura normalmente de 2 a 3 años. Sin embargo, el cáncer de próstata se metastatiza con frecuencia para los huesos y casi invariablemente progresa a un estado independiente de andrógenos, con un mal pronóstico y una supervivencia media de 10 a 20 meses [4]. Hasta la fecha, gran parte de la investigación sobre el cáncer de próstata se ha orientado hacia los andrógenos, centrándose principalmente en forma de disminución de los andrógenos circulantes y de la inhibición del receptor de andrógenos (AR) funcionalidad.
Los antiandrógenos, clasificados como compuestos esteroides o no esteroides , inhibir la actividad de los andrógenos al bloquear competitivamente la interacción entre la testosterona y /o dihidrotestosterona (DHT) y AR. antiandrógenos esteroides, entre los que el acetato de ciproterona es el más representativo, han sido recientemente objeto de mucha discusión, debido a sus efectos secundarios, similares a las inducidas por la terapia de la castración [5]. También hay preocupación por su aparente hepatotoxicidad del uso a largo plazo y complicaciones tromboembólicas causadas por su potencial de acción con progestágenos [6].
antiandrógenos no esteroideos, como la bicalutamida (Casodex®), flutamida (Eulexin®) y nilutamida (Nilandron®) parece ser mejor tolerado que sus análogos de esteroides y son actualmente el único medio disponible para evitar la castración en el tratamiento endocrino del cáncer de próstata [5]. Estos compuestos se denominan a menudo como "antiandrógenos puros" ya que se unen exclusivamente a la AR. La bicalutamida es la mejor toleradas de estos fármacos, [7] - [9], pero, al igual que los otros dos, que actúa como un agonista cuando las mutaciones AR ocurren (W741C e H874Y) y /o en los casos de AR sobreexpresión, como ocurre en la hormona cáncer de próstata refractario. En la actualidad existe un consenso general sobre el papel clave de la AR en la etiología y progresión del cáncer de próstata (PC), incluso cuando se desarrolla a partir de andrógeno-sensibles a la enfermedad resistente a la castración (CRPC). Esto está apoyado por evidencia de que AR expresión se conserva en la mayoría de los especímenes de cáncer de próstata, independientemente de la etapa y el grado, y por el hecho de que sólo una pequeña proporción de pacientes CRCP experimentar pérdida de expresión de AR, presumiblemente a través de promotor AR metilación [10]. Además, los estudios sobre muestras tumorales de pacientes CRPC han revelado varios mecanismos utilizados por las células tumorales para reactivar la señalización AR,
por ejemplo
amplificación AR o mutación, los cambios en la expresión de enzimas implicadas en la esteroidogénesis, y la producción de andrógenos intracrina [11 ] - [25]. A pesar de los beneficios clínicos de ambas terapias hormonales de primera y de segunda línea, los antiandrógenos más utilizados, incluyendo la bicalutamida, tienen baja afinidad AR [26]. Estos hallazgos han conducido a la búsqueda de nuevas moléculas con mayor AR-afinidad con el fin de aumentar la eficacia clínica.
El estudio preclínico presente el objetivo de investigar la actividad y mecanismos de acción de nuevas moléculas orgánicas pequeñas capaces de funcionar como antagonistas de los receptores de andrógenos en células LNCaP, que albergan una mutación en el codón 877 del dominio de unión a ligando-AR [27], y en diferentes líneas celulares representativas de las condiciones CRPC.
Materiales y Métodos
drogas y productos químicos
Pure (
R
) -bicalutamide (el enantiómero activo del antiandrógeno no esteroideo, Casodex®) y compuestos (
S
) -11 y (
R
) -9 se rodeos sintetiza por procedimientos altamente diastereoselectivas (Solicitud de Patente no. WO2010 /116342A2 y no. WO2010 /092546A1 [28]), a partir de D) ácido málico,) -phenylglicine ((D y (D) fenilalanina, respectivamente. (
S
) -11 y (
R
) -9 se disolvieron en acetona y etanol (10 mM), respectivamente, mientras que el metiltrienolona andrógeno sintético R1881 (Chemos-GmbH, Regenstauf, Alemania ) se solubilizó en DMSO (35,2 mM) y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Casodex® se adquirió de Sigma-Aldrich (Milán, Italia).
Las construcciones
ADNc que codifica la de tipo salvaje hAR estaba en pSG5 [29]. El constructo de 3416, que contiene cuatro copias de la de tipo salvaje slp-HRE2 (59-TGGTCAgccAGTTCT-39), se clonó en el sitio NheI en pTKTATA-Luc [30].
Líneas celulares y cultivo
las líneas celulares de cáncer de próstata humano derivado de LNCaP y VCAP se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). La línea celular LNCaP-AR, derivado de LNCaP y ingeniería genética para expresar de forma estable altos niveles de AR, fue proporcionado amablemente por el Dr. Charles L. Sawyers (Instituto Médico Howard Hughes Investigador en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center de Nueva York, U.S.A.). El (
R)
subclón -bicalutamide resistentes de las células LNCaP (LNCaP-RBIC) se aisló en nuestro laboratorio mediante el cultivo de LNCaP línea celular parental de 50 semanas con 20 M de (
R
) - bicalutamida.
células VCAP se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Mascia Brunelli SpA, Milán, Italia). células LNCaP y LNCaP-AR se mantuvieron en medio RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de glutamina (Mascia Brunelli S.p.A., Milán, Italia). células LNCaP-RBIC se mantuvieron en la misma forma suplementado con (
R
) -bicalutamide. A menos que se indique lo contrario, se utilizaron las células en fase de crecimiento exponencial en todos los experimentos. Cos 7 células se hicieron crecer en DME suplementado con rojo de fenol, 5% de suero de ternera fetal (FCS), insulina (6 ng /ml), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 U /ml) e hidrocortisona (3,75 ng /ml). Las células se hicieron quiescentes utilizando fenol DMEM libre de rojo y suero de ternero tratado con carbón dextrano. Todos estos procedimientos se han descrito anteriormente [31] - [33].
transfección, la translocación nuclear y Ensayo de transactivación
Para el análisis AR translocación (Fig. S5), las células COS-7 a 70 % de confluencia fueron transfectadas con 1 g de plásmido purificado usando el reactivo Superfect (Qiagen, Hilden, Alemania). Las células fueron luego hizo quiescente y dejaron sin estimular o se estimularon con 10 nM R1881 durante 60 minutos en ausencia o presencia de los compuestos de estudio. Para el ensayo de transactivación (Fig. S4), células Cos-7 se cultivaron a 70% de confluencia en fenol DME libre de rojo que contiene 5% de suero tratado con carbón vegetal. Después de 48 horas, las células fueron transfectadas por Superfect con 0,8 g de 3,416-pTK-TATA-Luc, solo o con 0,2 g de plásmido pSG5-Har-expresan. Después de 18 horas, las células transfectadas se estimularon con 10 nM R1881 (disuelto en 0,001% de etanol, concentración final) durante 24 horas en ausencia o presencia de los compuestos indicados. Las células de control se trataron con el vehículo solo. Se prepararon lisados celulares y la actividad luciferasa se midió usando un sistema de ensayo de luciferasa (Promega). Los resultados fueron corregidos mediante la actividad CH110-galactosidasa expresada.
AR unión de ligando estudios de desplazamiento en las células LNCaP
Se mantuvieron las células LNCaP como se informó anteriormente [32] y se inmovilizará el uso libre de rojo fenol con carbón vegetal medio de suero y dextrano [32]. Las células en 70% de confluencia se incubaron mediante la adición de 10 nM de [3H] R1881 (98 Ci /mmol; Perkin Elmer) al medio en la ausencia o presencia del exceso indicada de compuestos de radio-inerte. Después de una incubación de 4 horas a 37 ° C, las células se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo y se recogieron raspando suavemente en la cámara fría con 600 l de PBS enfriado en hielo que contienen 0,05% de EDTA (w /v). Se contó el número de células en una alícuota de 100 l. Una alícuota (200 l) de la suspensión celular se presentó por duplicado a la extracción de radiactividad intracelular usando 500 l de etanol enfriado con hielo (100%) durante 1 hora [33]. Después de 24 horas a 37 ° C, la radiactividad se contó en un contador de centelleo líquido. La unión no específica de [3H] R1881 se determinó en pocillos separados añadiendo el exceso indicada de no marcado R1881 al medio de incubación.
In vitro de quimiosensibilidad ensayo
sulforodamina B se utilizó (SRB) de ensayo de acuerdo para el método por Skehan et al. [34]. Brevemente, las células se recogieron por tripsinización, se contaron y se sembraron a una densidad de 5.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos de microtitulación de fondo plano (100 l de suspensión de células /pocillo). Los experimentos se realizaron en octuplicado y cada experimento se repitió tres veces. La densidad óptica de las células se determinó a una longitud de onda de 490 nm por un lector de placas colorimétrico. curvas de respuesta de dosis fueron creados por el software Excel y la concentración inhibidora de 50% (IC
50) se determinaron gráficamente los valores de las parcelas.
Cuantitativo PCR en tiempo real
Total RNA celular fue aislado usando RNeasy Minikit (Qiagen). Un microgramo de ARN se transcribe de forma inversa en ADNc usando iScript (BioRad, Hercules, CA) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema de un solo color MyiQ PCR en tiempo real de detección (BioRad) y SYBR Green I tiño la química. El gen β2-microglobulina endógeno expresado de forma estable se amplificó como un control de la calidad y la cantidad de ARN de entrada. Los cebadores para la amplificación de GAPDH ARNm, adelante 5'-CGCTACTCTCTCTTTCTGGC-3 ', 5'-reversa AGACACATAGCAATTCAGAAT-3'; HPRT hacia adelante 5'AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG 3 ', 5'-reversa GTCTGGCTTATATCCAACATTCG -3'; PSA hacia adelante 5'GCAGCATTGAACCAGAGGAG 3 ', 5'-revertir CCATGACGTGATACCTTGA -3') fueron diseñados utilizando software Beacon Designer (versión 7.2, BioRad). PCR en tiempo real se llevó a cabo en las reacciones por triplicado en un volumen final de 25 ml que contiene 50 ng de molde de ADNc, mezcla de verde SYBR, y 200 nM de cebadores directo e inverso. Las muestras se mantuvieron a 95 ° C durante 10 minutos y 30 segundos, seguido de 40 ciclos de amplificación a 95 ° C durante 15 segundos, y luego a 60 ° C durante 30 segundos para GAPDH, HPRT y PSA. la especificidad del producto se controló por análisis de punto de fusión. eficiencia de amplificación, que nunca variarse & gt; 5% en los diferentes experimentos, se utilizó para determinar la expresión relativa de ARNm obtenido utilizando la Expresión Génica Software Macro (Version 1.1) (BioRad). La cantidad de ARNm se normalizó a los genes de referencia endógenos GAPDH y HPRT, y se expresó como niveles de n veces en relación con las muestras sin tratar.
tiempo real las reacciones de RT-PCR se realizaron por triplicado y el coeficiente de variación ( CV), calculada a partir de los tres valores de Ct, era siempre & lt; 1,5%. La reproducibilidad de la expresión de mRNA relativa se calcula a partir de los resultados de dos experimentos en los que el procedimiento se lleva a cabo en diferentes productos retrotranscripción derivados de la misma muestra de mRNA. CV fue siempre. & Lt; 10%
Determinación de los niveles de PSA
Un PSA ELISA kit suministrado por Abnova (Taiwán Corporation, Taiwán) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de PSA se midió espectrofotométricamente a 450 nm en un medio de cultivo.
incorporación de BrdU
Después de
in vivo
etiquetado con 100 mM BrdU (Sigma), células quiescentes en cubreobjetos fueron fijadas y permeabilizadas. incorporación de BrdU se analizó mediante inmunofluorescencia utilizando diluido (1:50 en PBS) anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU (clon BU-1, de GE Healthcare), como se informó anteriormente [35]. Se detectó el anticuerpo de ratón utilizando diluido (1:200 en PBS) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con rojo Texas (Jackson Laboratories).
Análisis de inmunofluorescencia
Las células sobre los cubreobjetos se fijaron y permeabilizaron [36 ]. De tipo salvaje hAR ectópica expresado en células Cos-7 se visualizó [37] utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-C19 (Santa Cruz). El anticuerpo primario se detectó utilizando (1:100 en PBS) anticuerpo diluido rojo Texas conjugado de cabra anti-conejo (Jackson Laboratories). Los cubreobjetos fueron finalmente se tiñeron con Hoechst 33258, invirtieron y se montaron en Mowiol (Calbiochem). Los campos se analizaron con un DMBL Leica (Leica Microsystems S.r.l., Milán, Italia) microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de aceite HCXPL Apo 63 ×. Las imágenes fueron capturadas usando la cámara DC480 (Leica) y adquiridos utilizando el software FW4000 (Leica), tal como se describe [36], [37].
lisados y Western blot
Cell lisados (a las 2 se prepararon mg /ml la concentración de proteína) como se describe anteriormente [32]. Ciclina D1, p27 y CDK4 se detectaron utilizando los anticuerpos apropiados [38]. AR se detectó, utilizando los anticuerpos anti-AR policlonales de conejo (C-19; Santa Cruz), según ha informado [36] proteínas inmunes reactivas se revelaron usando el sistema de detección ECL (de GE Healthcare)
in vivo Los experimentos
de cinco a seis semanas de edad macho SCID CB-17 ratones /IcrHanHsd-Prkdcscid se adquirieron de Harlan Laboratories (Correzzana, Italia). ratones desnudos viejo CD-1 macho de seis a 8 semanas (nu /nu) fueron adquiridos de Charles River Laboratories (Calco, Italia). Todos los experimentos con animales se realizaron en el Centro de Animales (SAFU) de Regina Elena Instituto Nacional del Cáncer en Roma, Italia. En el momento en que se realizaron los experimentos, no hubo Comité Ético de Investigación Animal activa en Regina Elena Instituto Nacional del Cáncer. Sin embargo, el Fondo para el animal en el Instituto había recibido autorización completa para llevar a cabo los experimentos in vivo desde el Ministerio de Sanidad italiano, que también aprobó el presente estudio. Todos los procedimientos con animales y su cuidado se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales, que están en cumplimiento con la legislación nacional (DL Nº 116, GU, Suppl 40, Feb. 18 213, 1992;. Circular No. 8, GU, julio de 1994) y las leyes internacionales (Directiva 86/609 CEE del Consejo, DO L 358. 1 12 Dic, 1987; Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio, Estados Unidos National Research Council, 1996). Los animales fueron sacrificados por razones éticas por dislocación cervical cuando los tumores alcanzaron una media de 3,0 g de peso o cuando se convirtieron en moribunda durante el período de observación.
Para (
R
) -9 experimentos toxicológicos , ratones sanos fueron tratados por vía oral por sonda diariamente con 10, 25, 50 y 100 mg /kg de (
R
) -bicalutamide o (
R
) -9 durante 28 días consecutivos. Para los experimentos de la actividad antitumoral, los ratones se inyectaron por vía subcutánea en el flanco con VCAP, LNCaP y las células de cáncer de próstata LNCaP-RBIC en 10
6 células /ratón en 100 l de solución compuesta por 50% de Matrigel y 50% de medio libre de suero. Después de alrededor de 1 mes (cuando una masa tumoral de 5-150 mg fue evidente) se asignaron al azar ratones, dividido en grupos y se inició el tratamiento. Los ratones fueron tratados por vía oral por sonda diariamente por.
4 semanas consecutivas con (
R
) -bicalutamide, (
R
) -9 o Casodex® a 10 mg /Kg . Los compuestos se disolvieron en 80% de PEG-400 y 20% de Tween-80. Los ratones de control fueron tratados con vehículo para el mismo período de tratamiento. Se evaluaron cinco ratones para cada grupo. El tamaño del tumor se midió tres veces a la semana en dos dimensiones por un peso pinza y el tumor se calculó usando la siguiente fórmula: a × b
2/2, donde a y b son el diámetro largo y corto del tumor, respectivamente.
eficacia antitumoral de los tratamientos se evaluó mediante los criterios de valoración siguiente:% TWI, el porcentaje de inhibición del peso del tumor; (B) retraso en el crecimiento del tumor, evaluada como T-C, donde T y C son los tiempos promedio para los tumores tratados y de control, respectivamente, para conseguir un tamaño equivalente (
es decir
1000 mg.); c) la estabilización, la regresión o respuesta completa mostrada por palpación.
Ética Declaración
Todos los procedimientos con animales y su cuidado se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales, que están en cumplimiento con la legislación nacional (DL n . 116, GU, Suppl 40, Feb. 18 213, 1992;. Circular No. 8, GU, julio de 1994) y las leyes internacionales (Directiva 86/609 CEE del Consejo, DO L 358. 1 12 Dic, 1987; Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio, Estados Unidos National Research Council, 1996).
análisis estadístico
Para el análisis del ensayo de la proteína PSA, se analizaron las diferencias entre los valores observados después de los diversos tratamientos utilizando la prueba t de Student para observaciones no pareadas
& lt valor P
;. 0,05 fue considerado significativo. Para el análisis de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real, ANOVA de una vía con posterior a la prueba de Dunnett se realizó utilizando GraphPad Prism versión 4.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.). Los datos obtenidos a partir de la incorporación de BrdU, SON-luc ensayos de gen reportero y translocación nuclear fueron analizados por pares de
t-test
. Un
P
valor & lt; 0,05 se consideró significativo. Para
in vivo
experimentos, la prueba t de Student (no pareada, de dos colas) se utilizó para comparar los valores medios (Primer Software de Bioestadística, McGraw-Hill, Nueva York, NY, EE.UU.). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
Estructura Compuesto
Nuestro trabajo se centró en la identificación de compuestos de plomo potenciales de una nueva clase de moduladores selectivos del receptor de andrógenos (SARMs), sintetizado por una metodología innovadora y altamente diastereoselectiva, para un mayor desarrollo preclínico y clínico. Las actividades antagonistas y agonistas de alrededor de 30 no esteroideo diferente, ligandos AR sintéticos a través de un estudio de la relación estructura-actividad ya se han descrito [28]. En particular, se evaluó la
in vitro
actividad antitumoral en dos nuevas moléculas propanamida bicalutamida similar, (
S
) -11 y (
R
) -9, ( Fig. 1A). Sus estructuras químicas difieren de la de bicalutamida en presencia de un átomo de nitrógeno en lugar del grupo hidroxilo en el átomo de carbono central, y en el sustituyente en la estereocentro quiral,
por ejemplo
. un bencilo y un grupo fenilo, respectivamente. Por otra parte, (
S
) -11 se caracteriza por la presencia de un resto de hidantoína, que influye aún más su impedimento estérico.
(A) Estructura química y el peso molecular (MW) de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 y (
R
) -9. (B) AR ligando análisis de desplazamiento en las células LNCaP vinculante. Las células quiescentes LNCaP fueron incubadas con 10 nM de [3H] R1881 en ausencia o presencia del exceso indicada (de 0,5 M a 4 M) de compuestos inertes radio. radiactividad intracelular se ensayó. El recuadro en el panel B muestra los sitios de unión de AR ensayadas en 10
3 células incubadas con 10 nM de [3H] R1881 (R1881 *) en la ausencia o presencia del exceso indicada de no marcado (
R
) -9, (
S
) -11 o (
R
) -bicalutamide (
R
) -bic. Los datos de tres experimentos diferentes se recogieron y unión residual se calculó y se expresaron como% del total de sitios de unión de AR.
n =
número de experimentos. La significación estadística de los resultados también se evaluó por el emparejado
t
de prueba y P valores & lt; 0,005 se consideraron significativos. No significación se atribuye a la diferencia en la unión residual entre las células incubadas con 10 nM de [3H] R1881 en presencia de (
S
) -11 o (
R
) -9 y las incubadas con 10 nM de [3H] R1881 en presencia de (
R
) -bicalutamide ((
R
) -bic). células LNCaP también se incubaron con 10 nM de [3H] R1881 en ausencia o presencia de 100 veces en exceso (1 M) de R1881 no marcado o Casodex®. Unión residual fue de 13% y 14% para R1881 no marcado o Casodex®, respectivamente.
Encuadernación Desplazamiento Estudios
En primer lugar, evaluamos la capacidad de (
S
) -11 y (
R
) -9 para desplazar específicamente la actividad de unión del ligando de AR en las células LNCaP enteros. Con este fin, las células quiescentes se incubaron con 10 nM de [3H] R1881 en ausencia o presencia del exceso indicada de compuestos de radio-inerte. Se hicieron las células en reposo mediante el tratamiento de suero con dextrano-carbón para eliminar los esteroides libres y después se recogieron raspando suavemente para preservar la unión de AR membrana con el fin de considerarlo como parte de los resultados de unión. Los resultados de diferentes experimentos independientes se analizaron, revelando que tanto (
S
) -11 y (
R
) -9 compuestos desplazado a la [3H] R1881 unión en alrededor de 45% y 80% cuando utilizado a 0,5 M y 1 M, respectivamente (Fig. 1B y recuadro). Se detectó casi total [3H] R1881 desplazamiento cuando se utilizó cada compuesto a 2 mM o 4 mM (fig. 1B y recuadro). Datos similares se observaron mediante el uso de R1881 no marcado o Casodex® (Fig. 1B leyenda) o cuando el análisis de desplazamiento de unión se realizó en células COS ectópica expresan hAR (datos no mostrados). El anti-andrógenos (
R
) -bicalutamide comportó sustancialmente similares (
S
) -11 y (
R
) -9, aunque era ligeramente más eficaz que (
S
) -11 y (
R
) -9 en el desplazamiento de la unión cuando se usa en concentraciones bajas (0,5 o 1 M) AR ligando. Desde un punto de vista estadístico (fig. 1B leyenda), estas diferencias parecen insignificantes. En general, estos resultados indican que (
S
) -11 y (
R
) -9 compuestos se unen AR.
Actividad citotóxica in vitro
luego evaluaron la
in vitro
actividad citotóxica in de (
R
) -9 y (
S
) -11 en un panel de líneas celulares de cáncer de próstata en diferentes etapas de la hormona capacidad de respuesta y representativos de diferentes características patológicas de cáncer de próstata humano (Fig. 2).
La actividad citotóxica de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11and (
R
) -9 en líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP, LNCaP-RBIC, LNCaP-AR y VCAP después de una exposición de 144 horas, medido por el ensayo de SRB (promedio de tres experimentos independientes). Las concentraciones (M) de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 y (
R
) -9 causando disminución del 50% en la supervivencia celular (IC
50) se muestran a la derecha de las curvas.
las células fueron expuestas a concentraciones de fármaco escalares que van desde 0,02 M a 20 M durante 144 horas. (
R
) -bicalutamide no mostró curvas de dosis-efecto en la línea celular LNCaP-RBIC resistentes o en células VCAP albergar altos niveles de AR de tipo salvaje. Aunque una débil tendencia dosis-efecto se observó en las líneas celulares que expresan de forma natural AR (LNCaP) o células de ingeniería genética para sobreexpresar el receptor (LNCaP-AR), IC
50 (2 M) sólo se observó en la línea celular LNCaP (Fig . 2).
(
S
) -11 mostraron una actividad modesta en absoluto, pero la concentración más alta (20 mM) a la que se observó un modesto efecto citotóxico en las células VCAP (Fig. 2 ). En las otras líneas celulares se detectó un fuerte efecto citocida con IC
50 valores que van desde 11,2 M a 13 mM. (
R
) -9 produce un efecto similar a la de (
S
) -11 sólo en LNCaP-RBIC pero indujo una fuerte efecto citotóxico relacionado con la dosis y en las otras líneas celulares, que expresa de forma natural o artificialmente AR, alcanzando siempre IC
50 valores, incluso en las células VCAP (6 M).
Influencia sobre hormonal estímulo
también se investigó la interferencia de los antiandrógenos en la efecto de R1881 en LNCaP ingenuo y líneas LNCaP AR-derivado, éste ingeniería genética para expresar niveles más altos de AR de tipo salvaje ((Fig. 3A). la exposición prolongada a 10 nM R1881 aumento de la proliferación celular de las líneas de cáncer de próstata en un 1.5- 2,5 veces. La exposición concomitante de las células para R1881 y (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 o (
R
) -9 durante 72 horas suprimido el estímulo de crecimiento propuesta por el andrógeno sintético. en particular, (
R
) -9 demostrado ser el más eficaz en la inhibición de la estimulación proliferativa hormonal, a partir de una concentración de 5-M. por otra parte, como se esperaba, un incremento significativo (
P
& lt; 0,01) en los niveles de PSA se observó en el medio de cultivo de LNCaP (43%) y LNCaP-AR (62%) de las células después de una exposición de 48 horas a 10 nM de la andrógeno sintético R1881 (Fig. S1). Por el contrario, todos los compuestos antiandrógenos utilizan en concentraciones de 20 mM secreción de PSA inhibido en el medio de cultivo de las dos líneas celulares. En particular, ambos (
R
) -9 y (
S
) -11 causado una reducción en los niveles de PSA significativamente mayor (
P Hotel & lt; 0,01) que la producida por (
R
) -bicalutamide (
P Hotel & lt; 0,01).
(A) Evaluación mediante ensayo con SRB del Acitivity antitumoral de concentraciones escalares de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 o (
R
) -9 en LNCaP sensible a hormonas y células LNCaP AR-AR-sobreexpresan, en presencia o no del andrógeno sintético, R1881 (10 nM). Las barras representan la media de dos experimentos independientes. (B), (C) Evaluación de los niveles de mRNA de gen del PSA después de una exposición de 24 horas a diferentes concentraciones de (
S
) -11 (C) o (
R
) -
9 gratis (D) en presencia o ausencia de R1881 (puntos son la media de dos experimentos independientes, *
P Hotel & gt; 0,05).
también investigaron
no se observó a principios del modulación de la actividad transcripcional de AR ejercida por las dos nuevas moléculas en los tiempos de exposición y concentraciones no es capaz de inducir la muerte celular masiva.
un incremento significativo en los niveles de ARNm de PSA (
P & lt
; 0,01) en ambas líneas celulares después de una exposición de 24 horas a 10 nM R1881 (figura 3 antes de Cristo).. Una exposición de 24 horas a (
S
) -11, solo o en combinación con R1881, inducida por una modesta reducción en los niveles de ARNm de PSA en ambas líneas celulares. Por el contrario, una exposición de 24 horas a (
R
) -9 solo indujo una reducción significativa de la expresión de ARNm de PSA en LNCaP y LNCaP-AR a partir de la concentración más baja utilizada (0,5 M). Cuando una exposición de 24 horas de R1881 precedió a la de (
R
) -9, una reducción significativa en la expresión de ARNm de PSA con respecto a la exhibida por las células expuestas a R1881 solo se observó a partir de 0,5 M en LNCaP y a partir de 5 micras de LNCaP-AR, respectivamente (
P Hotel & lt; 0,005). Los datos obtenidos parecen indicar que (
R
) -9 a bajas concentraciones es más eficaz que (
S
) -11 en la inhibición de la actividad transcripcional de AR.
efecto sobre la incorporación de BrdU
Se evaluó el efecto de ambos compuestos sobre la síntesis de ADN inducida por andrógenos de células LNCaP en tres experimentos diferentes. (
R
) -9 (Fig. 4A) y (
S
) -11 (Fig. 4B), inhibió la incorporación de BrdU estimulada por el tratamiento 10 nM R1881 de células LNCaP se inmovilizará el uso de fenol medio libre de rojo y suero tratado con carbón dextrano. El efecto inhibidor fue similar o incluso más fuerte que la obtenida utilizando el mismo intervalo de concentración (10-20 M) de Casodex (Fig. 4 A y B) o (
R
) -bicalutamide (Tabla 1). (
R
) -9 y la incorporación de BrdU (
S
) -11 de nuevo inhibió significativamente estimulado por 10 tratamiento nM R1881 de células LNCaP-AR hechas de reposo tal como se describe anteriormente para LNCaP (Fig. S2).
en a y B, las células LNCaP quiescentes en cubreobjetos se dejaron sin tratar (control) o tratadas durante 18 horas con el andrógeno sintético R1881 (10 nM) en ausencia o presencia de los antagonistas de los indicados (utilizado en 10 o 20 mM). Después de
in vivo
pulsando con 100 M de BrdU, la incorporación de BrdU se analizó mediante inmunofluorescencia y se expresa como% del total de núcleos. En A y B, los números en la parte superior de cada barra representan la media de tres experimentos independientes (
n = 3
), con una desviación estándar (SD) & lt; 1. La significación estadística de los resultados en A y B se evaluó con el emparejado
t
prueba.
P
valores eran & lt; 0,005 para las células estimuladas con 10 nM R1881. Higo.