Extracto
Matriz metaloproteinasa 7 (MMP7), un metallohydrolase involucrado en el desarrollo de varios tipos de cáncer, está regulado por disminución en el
Apc
modelo de ratón /+
cáncer de colon Min siguientes sulindac tratamiento. Para determinar si este efecto es relevante para la condición humana, HT-29 células de cáncer de colon humano se trataron con sulindac y sus metabolitos, y se compararon con los resultados obtenidos a partir de
in vivo
los estudios del ratón. La expresión de
MMP7
se controló. Los resultados demostraron que el sulfuro de sulindac downregulated eficazmente tanto
MMP7
expresión y actividad. Además, la proteómica basados en la actividad demostraron que el sulfuro de sulindac redujo drásticamente la actividad de leucotrieno A4 hidrolasa en las células HT-29 como se refleja por una disminución en el nivel de su producto, leucotrieno B4. Este estudio demuestra que el efecto del tratamiento con sulindac en un modelo de ratón de cáncer de colon puede ser relevante para la contraparte humana y pone de relieve el efecto del tratamiento con sulindac en metallohydrolases
Visto:. Guillén-Ahlers H, J Tan, Castellino FJ, Ploplis VA (2011) Efecto de sulfuro de sulindac en Metallohydrolases en el colon humano línea celular de cáncer HT-29. PLoS ONE 6 (10): e25725. doi: 10.1371 /journal.pone.0025725
Editor: Mateo Bogyo, Universidad de Stanford, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Febrero 2011; Aceptado: 9 de septiembre de 2011; Publicado: 3 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Guillén-Ahlers et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (National Heart, Lung, and Blood Institute) PO1HL07375 subvención (a FJC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
no esteroideos fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), como el sulindac, son reactivos quimio-preventivo hacia los cánceres colorrectales [1], [2], [3]. Este efecto es consistente con las observaciones
in vitro
en células de cáncer de colon humano [4], así como
in vivo
en el
Apc
Min /+ ratón
modelo, donde se observa una gran disminución de la carga tumoral [5]. Las complicaciones gastrointestinales que se desarrollan en los usuarios de AINE están bien documentados [6], y representan un obstáculo en el uso de estos fármacos como agentes quimio-preventivo. Los efectos pleiotrópicos de sulindac en la prevención del cáncer de colon aún no están claros y obstaculizan el desarrollo de tratamientos más específicos con efectos secundarios disminuidos. Respecto a este tema, se ha demostrado que el tratamiento con sulindac provoca cambios en los fenómenos de remodelación de la matriz extracelular, incluyendo regulación a la baja de la metaloproteinasa 7 de la matriz (
MMP7
) en adenomas intestinales de
Apc
Min /+
ratones [7].
MMP7 pertenece a un grupo de las proteasas de iones dependiente de metal. De acuerdo con la base de datos MEROPS (www.merops.sanger.uk), metaloproteasas de matriz (MMP), que consta de 24 miembros, comprender la subfamilia de la familia M10 MA metallohydrolases del clan de M. MMP han sido fuertemente implicado en el desarrollo de muchos tipos de cáncer. Supresión de
MMP2
y
MMP9
en ratones han demostrado reducir la tumorigénesis pancreática mediante la reducción de la angiogénesis [8]. Pertinente para este estudio,
MMP7
deleción en
Apc
/+ ratones Min
se ha demostrado que reduce fuertemente la carga tumoral intestinal [9]. Estas observaciones implican MMP7 como un objetivo viable para el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento.
El objetivo fue determinar el efecto del tratamiento sobre sulindac MMP7 en la línea celular de cáncer de colon humano, HT-29, y se utiliza un enfoque global para detectar las actividades alteradas de otros metallohydrolases. Los resultados de estas investigaciones se describen en el presente documento.
Se mantuvieron
Materiales y Métodos
Cultivo de células
HT-29 células (American Type Culture Collection, Manassas, VA) en McCoy medio 5A (Gibco, Grand Island, NY) con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire /5% de CO
2. Sulindac, sulfuro de sulindac, sulindac sulfona y se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Estos fármacos se diluyeron en dimetilsulfóxido (DMSO). DMSO se añadió a los medios a una concentración final de 1% y las células se cultivaron en placas de 6 pocillos. Una vez que las células eran 80% confluentes, fueron tratados con varias concentraciones de sulindac y sus metabolitos. Después de 24 horas, las células se tripsinizaron y contaron las células viables mediante el método de azul de tripano.
La expresión génica
células HT-29, en el momento de la cosecha, se tripsinizaron, se centrifugaron, y el sedimento celular utiliza para extraer el ARN siguiendo el protocolo Qiagen. La concentración y la calidad de las muestras se evaluaron utilizando el perfil espectral obtenida a partir de la NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Se llevó a cabo la reacción en cadena de transcripción inversa de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) como [7] se describe anteriormente. Los cebadores y sondas diseñadas para el consumo humano
MMP7
,
MMP25
,
Trypsin1
, y
RPL-19
se muestran en la Tabla 1.
para los estudios de RT-PCR, el ARN total fue extraído a partir de células HT-29, tratadas con DMSO o 100 M sulfuro de sulindac durante 24 horas utilizando el protocolo Qiagen. RT-PCR reacción incluyó 2,5 × HotMaster Mix (5 Primer Inc., Gaithersburg, MD), RNasa inhibidor, enzima RT Multiscribe, pasivo ROX tinte de referencia, y SYBR Green. El ARN total (25 ng) fue Revere-transcrito en 30 l mezcla de reacción a 48 ° C durante 30 min. Las siguientes condiciones se usaron para la amplificación: pre-desnaturalización durante 5 min a 95 ° C, 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 20 s, hibridación a 59 ° C durante 20 seg, y extensión a 72 ° C durante 25 seg. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 3% que contiene bromuro de etidio. Una escalera de ADN de 50 pb (Promega, Madison, WI) se utilizó como marcador de peso molecular.
Western Blot
Proteomas se extrajeron de las células HT-29 y después se trató con sulfuro de sulindac (100 M) durante 24 horas a 80% de confluencia. Las células se tripsinizaron, se centrifugaron, y después se lavaron en PBS. Los sedimentos celulares se homogeneizaron y luego Dounce sonicado. El proteoma se centrifugó a 100.000 x
g
para separar las fracciones citosólicas y de membrana. La fracción segregada se obtuvo por centrifugación de los medios de comunicación celular a 100.000 ×
g
. El proteoma se precipitó por la adición de sulfato de amonio. Las muestras se pasaron a través de una columna de desalación PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Las muestras se carga en un gel de poliacrilamida al 10%, a electroforesis, y después se transfirió a una membrana de PVDF. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos policlonales MMP7 de conejo anti-humano (Abcam, Cambridge MA), y policlonales MMP7 activa de conejo antihumano (Abcam) a 1 mg /ml en tampón de bloqueo (PBS, 3% de leche en polvo sin grasa , 0,1% de Tween 20). Para MMP25 y α-tubulina, conejo MMP25 anti-humano (Abcam) y el ratón anti-humano α-tubulina (Santa Cruz Technology), respectivamente, se utilizó. anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con HRP o conjugado con HRP-anti-IgG de ratón (Cell Signaling Technology, Boston MA) en el tampón de bloqueo se utilizó como anticuerpo secundario. Las transferencias se desarrollaron utilizando los reactivos LumiGLO (Protein Research Products, Gaithersburg, MA) o el Western Rayo ECL sustrato (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA).
proteómica basada en la actividad para la identificación de metallohydrolases activados
Proteomas se ajustaron a una concentración de 1 mg /ml en PBS. Un cóctel de sondas alquino dirigidos al sitio activo de metallohydrolases fue un generoso regalo de Benjamin F Cravatt (El Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA). Etiquetado se realizó como se describe anteriormente [10]. Brevemente, se añadieron sondas a una concentración final de 1 mM y se incubaron bajo luz UV durante 1 hora. a continuación, rodamina azida estaba destinada a las sondas utilizando la química clic [11]. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% y escaneadas usando un escáner de superficie plana Hitachi FMBIO IIe (MiraBio, Alameda, CA) o el KODAK In-Vivo multiespectrales Sistema FX (Carestream Health, Rochester, NY).
identificación de proteínas marcadas basados en la actividad
impresiones de escaneo de gel de tamaño real se utilizaron como molde para extraer las bandas deseadas y escaneadas después para asegurar la correcta corte en rodajas del gel. Cada tapón de gel se redujo con ditiotreitol 10 mM en bicarbonato de amonio y se alquiló con 55 mM yodoacetamida. Las muestras se digirieron con 0,1 g de tripsina (Promega, Madison, WI) en 100 l de bicarbonato de amonio 10 mM y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Los péptidos trípticos se extrajeron de los tapones de gel con H
ácido 50% de acetonitrilo /49,9% 2O /0.1% trifluoroacético seguido de 100% de acetonitrilo y finalmente con ácido trifluoroacético al 0,1%.
Los péptidos trípticos se cromatografiaron en una 100 m × columna de 10 cm C18 (tamaño de partícula: 5 micras) y se eluyó utilizando un gradiente lineal de 3-45% de acetonitrilo en H
2O más de 70 min a temperatura ambiente, a una velocidad de flujo de 500 nl /min. El eluyente fue electro-rociado en el espectrómetro de masas de trampa de iones cuadrupolo lineal (LTQ) (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA). Sequest y X! Tandem algoritmos se utilizaron para buscar la base de datos que utiliza el Índice Internacional de Proteínas (IPI) de base de datos del ratón.
El leucotrieno B4 inmunoensayo enzimático
A 80% de confluencia, se incubaron las células HT-29 ya sea con el sulfuro de sulindac o DMSO durante 24 horas. Se obtuvo el proteoma secretada y se concentró por centrifugación al vacío. Proteomas se ajustaron a 5 mg /ml y LTB4 cuantificado con un kit de inmunoensayo enzimático (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).
Resultados
El metabolito reducido de sulindac, sulfuro de sulindac, aumenta de forma selectiva la muerte celular de las células HT-29
HT-29 células fueron tratadas con sulindac, el sulfuro de sulindac, y sulfona de sulindac en concentraciones que van de 10 a 1000 m (Figura 1). A partir de 250 mM, sulfuro de sulindac aumentó significativamente la muerte celular, alcanzando el 100% de muerte celular en 500 mM. En contraste, sulindac y sulfona de sulindac no lograron aumentar significativamente la muerte celular, incluso cuando los fármacos fueron añadidos a concentraciones mM.
En el 80% de confluencia, las células se trataron con concentraciones crecientes de sulindac (gris), el sulfuro de sulindac ( blanco), y sulfona de sulindac (negro).
sulfuro de sulindac reduce
MMP7
en el mRNA, proteína y los niveles de actividad
Se informó de que dos días sulindac del tratamiento es suficiente para regular a la baja en los tumores de MMP7
Apc
/+
ratones Min [7]. Con el fin de determinar qué metabolito efectivamente disminuida MMP7, las células HT-29 fueron tratadas con sulindac y sus metabolitos en 100 mM, una concentración no tóxica para las células como se demuestra en la figura 1, por 24 hr. El perfil de expresión de
MMP7
se comparó con los resultados previamente obtenidos en estudios de ratón (Figura 2A). Sólo el metabolito activo, el sulfuro de sulindac, fue capaz de reducir significativamente la expresión de
MMP7.
Una curva de titulación utilizando diferentes concentraciones de sulfuro de sulindac reveló que incluso a 50 M,
MMP7
mostraron una pequeña (14%), pero la regulación por disminución estadísticamente significativa de la expresión (p = 0,044) (Figura 2B). A 100 M, se observó una disminución de 65% (p = 0,000001). La diferencia entre 100 mM y 200 mM era menos dramático (11%), pero aún fue significativamente diferente entre estas dos concentraciones (p = 0,017) guía.
(A) en tiempo real RT-PCR de ARN de HT- 29 células después de 24 horas de tratamiento con DMSO, sulindac (S), sulfuro de sulindac (SD) y sulfona de sulindac (SN). Los resultados fueron obtenidos utilizando el método ΔΔCt con
hRPL-19
como la limpieza de genes. C
valores de T entre 20.10 y 20.56 en todas las muestras presentan niveles constantes de
hRPL-19
expresión. (B) La expresión de
hMMP7
después de 24 horas de tratamiento sulindac. La regulación a la baja de
hMMP7
fue significativa en todas las concentraciones. Los resultados fueron obtenidos utilizando el método ΔΔCt con
hRPL-19
como la limpieza de genes. C
valores de T entre 23.22 y 23.56 en todas las muestras presentan niveles constantes de
hRPL-19
expresión. (C) citosólica, de membrana y fracciones proteoma secretadas extraídos de DMSO y sulindac sulfuro-tratada células HT-29 se sometieron a análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo que no distingue entre MMP7 activa e inactiva (arriba), y un anticuerpo que se sólo reconoce el sitio activo (parte inferior). La banda esperado para MMP7 aparece a 28 kDa, sin embargo, una banda a 45 kDa con frecuencia se reporta, posiblemente un dímero. Cito denota la fracción citosólica; Mem, fracción de membrana, secr, fracción secretada, y aMMP7, MMP7 activo.
Western Blot de MMP7, así como el sitio activo de MMP7, se realizó en citosólica, de membrana y secretadas fracciones de HT-29 proteomas después de 24 h de tratamiento de sulfuro de sulindac a 100 mM (Figura 2C). En ambos casos, MMP7 sólo se detectó en las fracciones secretados de la proteoma. tratamiento de sulfuro de Sulindac mostró una clara reducción de MMP7 en la fracción secretada a una concentración 100 mM. El análisis de transferencia Western dirigida al sitio activo de MMP7 reveló una desaparición completa de MMP7 activa detectable después del tratamiento sulfuro de sulindac.
Con el fin de determinar si otras MMP, otras clases de proteasas, y la limpieza de genes, RPL-19, fueron afectados por sulindac en células HT-29, RT-PCR (extractos de células enteras) y Western blot (secretada, citosólica, y fracciones) se realizaron análisis. ARNm para MMP25, trypsin1, y RPL-19 no se alteró después del tratamiento sulfuro de sulindac (Figura 3A, B). El análisis de transferencia Western de la fracción de membrana de estas células confirmó los resultados de RT-PCR para MMP25 (Figura 3C).
(A) producto de la PCR de RT-PCR de ARN de las células HT-29 después de 24 horas de tratamiento con DMSO o sulfuro de sulindac. Carril 1, escalera de ADN de 50 pb; carril 2,
MMP25
después del tratamiento sulfuro de sulindac; carril 3,
MMP25
después del tratamiento DMSO; carril 4,
Trypsin1
después del tratamiento sulfuro de sulindac; carril 5,
Trypsin1
después del tratamiento DMSO; carril 6,
MMP7
después del tratamiento sulfuro de sulindac; carril 7,
MMP7
después del tratamiento DMSO; carril 8
RPL-19
después del tratamiento sulfuro de sulindac; carril 9,
RPL-19
después del tratamiento DMSO. Los resultados demuestran que sólo el
MMP7
expresión se ve afectada por el tratamiento sulfuro de sulindac. (B) RT-PCR cuantitativa de
MMP25
,
Trypsin1
, y
MMP7
después de DMSO o el tratamiento de sulfuro de sulindac. Los resultados fueron obtenidos utilizando el método ΔΔCt con
hRPL-19
como la limpieza de genes. Los resultados indican diferencias cuantitativas en
MMP7
expresión después del tratamiento sulfuro de sulindac en relación con el tratamiento de DMSO. (C) de transferencia de Western de la fracción segregada de células HT-29 que demuestran que los niveles de proteína de MMP25 en la fracción de membrana son similares entre el sulfuro de sulindac y células tratadas DMSO.
basada en la actividad de la proteína de perfiles de orientación metallohydrolases revela una disminución de la actividad de LTA4H
Proteomas extraídos de las células HT-29 después de 24 horas de tratamiento con sulfuro de sulindac o DMSO fueron etiquetados con un cóctel sonda dirigidas a la superfamilia metallohydrolase y correr en un gel de 1D. Se observó una fuerte banda de entre 60 y 65 kDa en las células HT-29 tratadas con DMSO. Las células tratadas con sulfuro de sulindac mostraron una débil banda de peso molecular similar. Las bandas se cortaron y se analizaron por espectrometría de masas. Las muestras se realizaron por cuadrupolo lineal MS /MS (Figura 4) y los resultados coincidentes con la base de datos MEROPS para metallohydrolases. Había dos péptidos (LTYTAEVSVPK y LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK) detectados en la banda de ~ 70 kDa que corresponde leucotrieno A4 hidrolasa (LTA4H). El peso molecular predicho de LTA4H es de 69 kDa. LTA4H ha sido previamente demostrado ser un objetivo para este cóctel sonda de metaloproteasas (10).
proteomas etiquetado basado en la actividad de las células Metallohydrolase HT-29 secretadas. Se añadieron estándares de MMP2 y MMP7 a proteomas de células (flechas). La banda se presentan una fuerte disminución (*) después del tratamiento de sulfuro de sulindac se extrajo y se analizó por espectrometría de masas. MS /MS Los espectros de LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK y LTYTAEVSVPK péptidos correspondía a los aminoácidos 366-386 y 155-165, respectivamente, de la proteína LTA4H. El contenido de proteínas en todas las muestras se ajustó a 1 mg /ml y el equivalente de 15 g de proteoma se añadió por carril. MW denota el peso molecular; los niveles de enfermedades de transmisión sexual, normas, Sd, sulindac sulfuro de tratados y D, tratados con DMSO.
Con el fin de validar la reducción de la actividad de LTA4H, se utilizó un inmunoensayo enzimático para medir el leucotrieno B4 (LTB4) después de sulindac tratamiento (Figura 5). células de sulfuro de sulindac tratados mostraron niveles de LTB4 redujeron fuertemente en comparación con las células tratadas con DMSO
.
proteomas secretada de tratados con DMSO y se analizaron células de sulfuro de sulindac tratados para los niveles de LTB4 usando un inmunoensayo enzimático.
Discusión
El presente estudio demostró que el sulfuro de sulindac es capaz de reducir los niveles de ARN y de proteínas de MMP7, que es coherente con lo observado en estudios de ratón [7]. A través de perfiles de proteínas basado en la actividad, se demostró que el sulfuro de sulindac reduce drásticamente la actividad de LTA4H. Este resultado fue validado por una disminución de los niveles de LTB4
.
La participación de las metaloproteasas en el cáncer de colon ha sido previamente identificado, pero el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas a estas enzimas no ha tenido éxito [12]. Uno de los problemas es la baja especificidad de los inhibidores de metaloproteasas que han hecho a los ensayos clínicos. MMP7, sin embargo, ha consistentemente ha encontrado que es relevante en el cáncer de colon y sus modelos animales [9], [13]. El presente estudio indica que el sulfuro de sulindac es capaz de reducir la expresión de
MMP7 Hoteles en la línea celular de cáncer de colon humano HT-29 que también se observó,
in vivo
, en
Apc
Min /+
ratones [7]. Con el fin de determinar si también se alteraron otras MMP u otras clases de proteasas, MMP25, una MMP asociada a la membrana que está altamente expresado en las células del cáncer [14], y se analizaron trypsin1 y mostraron ser afectados por el tratamiento de sulfuro de sulindac. Además, la limpieza de genes RPL-19 tampoco se ve afectada por este AINE. Nobiletina, otro agente con propiedades contra el cáncer, también se ha demostrado que regular a la baja
MMP7
[15] en células HT-29. Varios mecanismos se han propuesto por el cual MMP7 promueve el crecimiento tumoral. Varios de estos estudios enlazar MMP7 con un interrumpido respuesta apoptótica mediada por Fas [16], [17], [18], y se ha propuesto la facilitación relacionada con la inflamación del crecimiento del tumor que es causada por la escisión MMP7 de Fas ligando [19]. metalopeptidasas
zinc constan de 12 miembros y pertenecen a la familia de metallohydrolases. Estas proteasas se han implicado en varios tipos de cáncer, incluyendo aminopeptidasa N en el cáncer de colon [20], aminopeptidasa cistinil en el cáncer renal [21], y LTA4H en adenocarcinomas de pulmón y colon [22]. Este es el primer estudio que une sulindac a la regulación de LTA4H. La regulación a la baja de la actividad de LTA4H, y la disminución de la carga tumoral, después del tratamiento sulindac apoya estudios en los que se ha demostrado ser upregulated en el cáncer de colon. Además, [6] gingerol, un componente natural con propiedades, antitumoral, se ha encontrado para suprimir el crecimiento del cáncer mediante la inhibición LTA4H [23]. La disminución de la actividad de LTA4H fue validado por la observación de que se encontraron niveles más bajos después del tratamiento de LTB4 sulindac. LTB4 es un eicosanoides conocida con propiedades quimiotácticas y se ha demostrado que estimula la proliferación,
in vitro
, de células HT-29 de cáncer de colon [24].
No ha habido ningún otro informe de la participación de sulindac, o cualquier otro NSAID, en MMP7 o LTA4H expresión. Sin embargo, en estudios preliminares, hemos demostrado que el sulindac no es el único AINE capaz de regular negativamente
MMP7
, es decir, la aspirina (datos no mostrados), lo que sugiere que
MMP7
es downregulated por una mecanismo de AINE compartida [7], [25] y no una propiedad única de sulindac.
en resumen, el presente estudio se identificaron dos candidatos, se informó anteriormente a ser de gran importancia en el desarrollo de tumores, que son alterados después del tratamiento sulindac . Nuevas modalidades de tratamiento y orientación selectiva de MMP7 LTA4H, de forma individual o en combinación, ofrecer nuevos enfoques terapéuticos que se aprovechan de los beneficios del tratamiento con sulindac, pero potencialmente sin los efectos secundarios adversos de este fármaco.
Reconocimientos
los autores agradecen a Benjamin Cravatt (Instituto de Investigación Scripps, la Jolla CA) para las sondas alquino dirigidos al sitio activo de metallohydrolases y Sherry Niessen y Eranthie Weerapana (Instituto de Investigación Scripps, la Jolla CA) para la asistencia técnica con los experimentos de proteómica.