Extracto
Las metástasis en el hígado es un factor principal en la mortalidad por cáncer colorrectal. Estudios previos sugieren que el estrés psicológico crónico es importante en la progresión del cáncer, pero su efecto sobre las metástasis hepáticas no se ha investigado. Para hacer frente a esto, se estableció un modelo de metástasis hepática en /c ratones desnudos BALB para investigar el papel del estrés crónico en la metástasis de hígado. Nuestros datos sugieren que el estrés crónico eleva los niveles de catecolaminas y promueve la metástasis de hígado. El estrés crónico también se asoció con un aumento de la infiltración de macrófagos asociados a tumores en el tumor primario y el aumento de la expresión de genes metastásicos. Curiosamente, el tratamiento β-bloqueante invirtió los efectos del estrés crónico en la metástasis de hígado. Nuestros resultados sugieren que la vía de señalización de β-adrenérgicos está implicado en la regulación de la progresión del cáncer colorrectal y metástasis de hígado. Además, consideramos que la terapia adyuvante con un β-bloqueante puede complementar las terapias del cáncer colorrectal existente
Visto:. Zhao L, Xu J, F Liang, Li A, Zhang Y, Sun J (2015) Efecto de la crónica el estrés psicológico en hígado metástasis del cáncer de colon en ratones. PLoS ONE 10 (10): e0139978. doi: 10.1371 /journal.pone.0139978
Editor: Obul Reddy Bandapalli, Universidad de Heidelberg, Alemania |
Recibido: 30 de mayo de 2015; Aceptado: 18 Septiembre 2015; Publicado: 7 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (81403350) y el Proyecto de innovación independiente de Putuo (2012PTKW004). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La incidencia global y la mortalidad del cáncer colorrectal (CCR) han disminuido debido a un diagnóstico precoz y los nuevos métodos terapéuticos [1]. Sin embargo, la metástasis hepática sigue siendo un reto importante en la prolongación de la supervivencia. Acerca de 50 ~ 60% de los pacientes desarrollan metástasis en el hígado, que tiene resultados esperados pobres. Además, las estrategias terapéuticas actuales no son eficaces [2]. La resección quirúrgica es el único tratamiento potencialmente curativo para el CRC metástasis hepáticas. Sin embargo, está limitado por indicación y contraindicación, y sólo el 10 ~ 20% de los pacientes con metástasis de hígado recibir tratamiento quirúrgico. El pronóstico para los pacientes con metástasis hepáticas no tratada es pobre, y la tasa de supervivencia a 1 año se espera es inferior al 30% [3-4]. Para reducir la morbilidad y mejorar el pronóstico, es esencial para desarrollar nuevas terapias. Curiosamente, los estudios epidemiológicos sugieren que el tratamiento con propranolol (un no selectivo β-bloqueante) reduce el riesgo de algunos tipos de cáncer, incluyendo CRC [5-8].
Los estudios recientes sugieren que un estado emocional en dificultades es un potencial factor de riesgo para la progresión del cáncer. Como diagnóstico de cáncer puede causar una angustia mayor, los pacientes a menudo experimentan miedo, la ansiedad y la depresión [9]. Estas señales pueden activar las vías de estrés, que incluye el eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA) y el sistema nervioso simpático (SNS), y provocar respuestas fisiológicas. Estas vías pueden producir neurotransmisores y hormonas que alteran el microambiente tumoral.
Hormonas de la catecolamina, incluyendo la norepinefrina (NE) y epinefrina (E), se elevan durante el estrés, y juega un papel clave en la respuesta al estrés. Estas hormonas activan los receptores sobre las células tumorales y regulan una amplia variedad de funciones biológicas que participan en la progresión del cáncer, incluyendo la proliferación celular, la migración, invasión y la angiogénesis [10 a 12]. La activación de la β
vía de señalización 2-AR inducida por las hormonas catecolaminas juega un papel clave en la progresión del cáncer [13, 14].
Los estudios anteriores sugieren que la proliferación celular inducida por el CRC hormonas del estrés es dependiente de los receptores adrenérgicos y que el estrés crónico podría promover el crecimiento del tumor de células de carcinoma de colon implantadas subcutáneamente en un modelo de ratones desnudos a través de la vía de señalización de β-AR [15, 16]. La hipótesis de que el estrés crónico promovería CRC metástasis en el hígado. Aquí investigamos cómo el estrés crónico afecta metástasis hepática utilizando un
in vivo
modelo de metástasis de cáncer de colon, y determinar si se requiere la vía de señalización β-AR para la progresión de la CRC.
Materiales y métodos
cultivo de células y animales
línea celular de cáncer de colon humano, HT-29, se adquirió de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia china de Ciencias. HT-29 se cultivó en medio McCoy'5A (Invitrogen), complementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
Cuatro semanas de edad, machos BALB /c nu /nu ratones fueron adquiridos de Shanghai SLAC Experimental Animal Co., Ltd (licencia No: SCXK [Hu] 2012-0002) y se mantuvieron en condiciones SPF. Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del Hospital Putuo afiliado a la Universidad de Shanghai de Medicina Tradicional China.
modelo de metástasis de hígado
Los ratones fueron inyectados con células de cáncer de colon HT-29 en el bazo para producir metástasis en el hígado. Los ratones fueron anestesiados con 2,5% de sodio pentobarbital por inyección peritoneal. Después de la esterilización de la piel en el área de la cirugía, se hizo una incisión abdominal en paralelo el margen subcostal izquierda. Las células tumorales (1 × 10
7) en 100 l se inyectaron solución salina tamponada con fosfato en el bazo mediante una aguja 29-G. Después de pulsar el agujero 1-2 min con bastoncillos de algodón asépticas para evitar que las células se escape, el bazo fue devuelto en la cavidad peritoneal. La herida se cierra con suturas de vicryl 5-0
El estrés crónico y la administración del fármaco protocolo
Los ratones fueron asignados al azar en 6 grupos:. En blanco-Control (AC, n = 10), blanking estrés (BS, n = 10), propranolol-control (PC, n = 10), propranolol-estrés (PS, n = 10), ICI118,551-control (IC, n = 10) y ICI118,551-estrés ( IS, n = 10). Los ratones en los grupos de estrés experimentado restricción física durante 6 horas por día durante 35 días, comenzando 7 días antes de la inyección de las células tumorales. Todos los ratones fueron sacrificados 28 días después de la inyección de las células tumorales, y el bazo y el hígado se recogieron y se pesaron
.
Para los estudios de antagonistas beta-adrenérgicos, (±) -propranolol clorhidrato (un bloqueador no selectivo β-10 mg, /kg /día, Sigma, P0884) y ICI118,551 (un β selectivo
2-bloqueante, 25μM /30μl, Sigma, I127) [17] fueron entregados a los ratones por vía subcutánea mediante minibomba osmótica (Alzet, modelo 1004). Los fármacos se dan para la duración del experimento comenzando 7 días antes de la inyección de células tumorales (Fig 1).
(A) Los ratones en los grupos de estrés se contuvo en un espacio especial que les impedía moverse libremente. (B) Los ratones en los grupos de estrés experimentado restricción física durante 6 horas por día durante 35 días, comenzando 7 días antes de la inyección de células tumorales. Un antagonista β-adrenérgico se administra por vía subcutánea mediante minibomba osmótica. La exposición al fármaco se mantuvo durante todo el experimento. Se inyectaron células HT-29 en el bazo en el día 0.
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
sangre
Veintiocho días después de la inyección de células tumorales, los ratones fueron sacrificados y fue cosechada de los ojos y se colocaron inmediatamente en tubos Eppendorf limpios recubiertos de heparina. las concentraciones de E y de NE en el suero se midieron por ELISA (R & amp; D Systems). de acuerdo con las instrucciones del fabricante
cromatografía líquida de alto rendimiento con detección electroquímica
Los niveles de catecolaminas en tejido tumoral se cuantificaron utilizando una columna de cromatografía líquida de alta resolución equipado con un detector electroquímico. Los tejidos tumorales se lavaron en solución salina tamponada con fosfato para eliminar la sangre restante. Las muestras fueron luego se sonicaron en ácido perclórico /L 1 mol frío. Los sobrenadantes se centrifugaron se recogieron y se filtraron con una placa de filtro de 0,22 micras (Millipore). El sistema de HPLC-ECD comprendía una columna de fase inversa (Agilent 1100, 4,6 mm × 12,5 mm, EE.UU.), y un detector electroquímico (Couloshem III, ESA, EE.UU.). La fase móvil contenía 5% de metanol en agua desionizada, ácido 85 mmol /L cítrico, /L de citrato de sodio 300 mmol, 0,2 mmol /L EDTA, 1,2 mmol /L de sulfonato de octano de sodio, y agua destilada. La velocidad de flujo fue de 1 ml /min, y el pH se ajustó a 4,0 con el potasio 2 mol /L de sodio.
análisis de citometría de flujo
Para analizar la infiltración de los macrófagos asociados al tumor (TAM) y células mieloides suprimidas derivado (MDSCs) la infiltración por citometría de flujo, las suspensiones de una sola célula se prepararon a partir de tumores implantados en el bazo recogidas 28 días después de la inyección y se incubó con anticuerpos directamente conjugados con fluorocromo etiquetas como se describe anteriormente [18]. Para obtener suspensiones de células individuales, el bazo se diseca y se homogeneiza en medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen), complementado con 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Los eritrocitos se eliminaron mediante incubación con una solución hemolítica (155 mmol /L NH4Cl, 10 mmol /L KHCO3, pH 7,2) durante 5 min. Para analizar los TAM, esplenocitos (1 × 10
6) fueron teñidas con PE anti-ratón F4 /80 (BioLegand, 123110) y FITC anti-ratón /humano CD11b (BioLegand, 101206). Para el análisis de las células supresoras de origen mieloide monocitos (M-MDSC) y células supresoras de origen mieloide granulocitos (G-MDSC), los esplenocitos se tiñeron con el ratón MDSC flujo Cocktail2 con isotipo Ctrl (BioLegand, 147003). Los anticuerpos se diluyeron 1: 100 en tampón de citometría de flujo (solución salina tamponada con fosfato con 5% de suero bovino fetal). Todos los análisis se llevó a cabo en el flujo BD LSRII citómetro (Beckman Coulter).
Cuantitativo en tiempo real PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
RT-PCR se utilizó para cuantificar la expresión de la metástasis relacionadas con los genes, incluyendo IL-6, VEGF, MMP-9, TGF-β y PTGS2. ARN total fue extraído de tejido tumoral en el bazo con el reactivo TRIZOL (Invitrogen), y la concentración y la pureza se determinó mediante un espectrofotómetro UV. A continuación, el ARN 1μg fue sometido a transcripción inversa en ADNc con el kit de reactivos PrimeScript RT ™ (Takara, Dalian, China). PCR en tiempo real cuantitativa se realizó mediante SYBR
® Premezcla Ex Taq ™ II (Takara, Dalian, China). Las condiciones de reacción fueron: pre-desnaturalización a 95 ° C durante 30 s y un total de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 5 s, hibridación a 60 ° C durante 34 s y extensión a 72 ° C durante 30 s. Las muestras se analizaron por triplicado y la expresión se normalizó a la expresión de GAPDH. La amplificación se realizó usando los siguientes cebadores: sentido GAPDH (5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 ') y antisentido (5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'), IL-6 sentido (5'-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3 ') y antisentido (5' -TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3 '), VEGF sentido (5'-GCCAGACAGGGTTGCCATAC-3') y antisentido (5'-GGAGTGGGATGGATGATGTCAG-3 '), el sentido MMP9 (5'-CTGGACAGCCAGACACTAAAG-3') y antisentido (5'-3-CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG '), TGF-β sentido (5'-AGACCACATCAGCATTGAGTG-3') y antisentido (5'-GGTGGCAACGAATGTAGCTGT-3 '), el sentido PTGS2 (5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3') y antisentido (5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3 ') . Los cebadores fueron sintetizados por Shanghai Sangon Biotech.
Western blotting
proteína total fue extraído de tejido tumoral en el bazo como se describió anteriormente [15], y la concentración de proteína se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas BCA ( Beyotime, P0012). Western Blot se realizó con los siguientes anticuerpos primarios: anti-IL-6 (1: 500, Abcam, ab154367), anti-VEGF (1: 1000, Abcam, ab46154), anti-MMP-9 (1: 500, Abcam, ab38898), anti-TGF-β (1: 1000, Abcam, ab31013), andanti-PTGS2 (1: 500, Abcam, ab62331), seguido de incubación con anticuerpo secundario anti-conejo con peroxidasa de rábano-conjugado (1: 1000) . Las proteínas se visualizaron por un sistema de detección de quimioluminiscencia ECL. La detección de GAPDH (1: 2000, Abcam, ab181602) sirvió como control interno de carga
La inmunohistoquímica
Las muestras de metástasis hepáticas fueron fijadas en 10% formalina tamponada y se procesa para los exámenes histológicos.. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-VEGF (1: 200, Abcam, ab1316), anti-CD31 (1: 200, Abcam, ab28364), o anti-MMP-9 (1: 200, Abcam, ab38898). Los portaobjetos se aclararon y se incubaron en anticuerpo secundario biotinilado (1: 200). La intensidad de la tinción para VEGF, CD31, y la expresión de MMP-9 se midió por Image-Pro 6.0. La media de 3 valores integrados de densidad óptica se considera como la intensidad de la expresión de la proteína en este campo.
Estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 18.0 (SPSS Inc.). Los resultados se expresaron como la media ± SEM para todas las comparaciones estadísticas pareadas. El análisis estadístico se realizó mediante de Student
t-test
. Un valor de
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
crónica inducida por el estrés β-adrenérgico la activación del receptor del hígado mediada por la metástasis
HT-29 células (1 × 10
7) eran se inyecta en el bazo de 60 ratones para establecer metástasis en el hígado y se sacrificaron 28 días después de la inyección de las células tumorales para el análisis. Todos los ratones que fueron sometidos a la inyección del tumor en el bazo desarrollaron metástasis de hígado. Imágenes representativas de bazo y el hígado metastásico se muestran en la figura 2A y 2B. Para investigar el papel del estrés crónico en el crecimiento del tumor primario y la metástasis del hígado, se evaluaron los pesos de bazo y el hígado. El estrés crónico aumenta el peso del bazo por el 20,61% (BC
vs
BS:.. 0,13 ± 0,01 g
vs 0,15 ± 0,01 g
,
P = 0,1784
), y un aumento significativo en la metástasis de hígado se observó en los ratones expuestos a estrés crónico (cambio de 1,6 veces:. 2,73 ± 0,16 g en el grupo BC
vs
4,30 ± 0,27 g en el grupo de BS,
P
& lt; 0,0001, figura 2C). Estos hallazgos sugieren la moderación de estrés crónico promueve la metástasis hepática.
(A) Imágenes representativas de bazo tomadas en el día 28 después de la inyección de las células tumorales. (B) Imágenes representativas de hígado metastásico tomada en el día 28 después de la inyección de las células tumorales. (C) Los datos representan el peso medio del bazo de los seis grupos. (D) Los datos representan la media de peso de hígado a partir de los seis grupos. **
P Hotel & lt; 0,01 frente al grupo AC,
#
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo de BS.
A medida que los estudios anteriores sugieren que el estrés crónico acelera la progresión del cáncer a través de la señalización de β-adrenérgico, se trataron los ratones con propranolol o ICI118,551 para inhibir la señalización de β-adrenérgico. Como se muestra en la figura 2D, el tratamiento redujo la metástasis hepática β-bloqueante inducida por el estrés crónico. En comparación con los ratones en el grupo de BS, los ratones en el PS y grupos es tuvieron menos metástasis hepáticas. Los pesos metástasis hepáticas de ratones en el PS y son los grupos fueron significativamente más bajos que los de los ratones del grupo BS (PS
vs
BS:. 3.46 ± 0.28 g
vs
4,30 ± 0,27. g,
P = 0,0482
; es
vs
BS: 3,35 ± 0,28 g
vs
4.30 ± 0.27 g,
P = 0,0265
).. . Se observó ninguna diferencia significativa en la metástasis de hígado entre el propranolol y el tratamiento ICI118,551 (
P Hotel & gt; 0,05).
El estrés crónico hasta regula los niveles de catecolaminas
Una característica central de la respuesta al estrés crónico es la regulación de la vía de respuesta al estrés adrenérgico, que se traduce en la pérdida de peso y el aumento de los niveles de catecolaminas [19]. El estrés psicológico fue confirmada por el peso perder (figura 3A) y la exposición al estrés crónico aumentado significativamente los niveles séricos de NE por el 30.25% (BC
vs
BS:. 101.5 ± 1.78 ng /L
vs
. 132.2 ± 2.51 ng /L,
P Hotel & lt; 0,0001, figura 3B), y moderadamente aumentado los niveles séricos de e por el 14,24% (BC
vs
BS:. 37,43 ± 1,76 mg /L
vs
. 42,76 ± 1,82 mg /L,
P = 0,047
, la figura 3B). El análisis por HPLC-ECD de tejido tumoral bazo mostró un aumento significativo de E 18,3 veces (BC
vs
BS:.. /l
vs
103,4 ± 25,08 pg /l 5.657 ± 1.613 pg,
P = 0,0177
, la figura 3C y 3D).
(A) los pesos corporales fueron controlados durante todo el experimento. Se inyectaron células HT-29 en el bazo en el día 0. representan (B) Datos niveles medios en suero de NE y E en BC y BS grupo, *
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo AC, **
P Hotel & lt; 0,01 frente al grupo antes de Cristo. (C) Imágenes representativas de HPLD ECD-huella digital de los niveles de catecolaminas en los tejidos tumorales bazo en BC y el grupo de BS. (D) Los datos representan el nivel promedio de NE y E en el tejido tumoral del bazo en BC y el grupo de BS, *
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo antes de Cristo.
Efecto de la vía de señalización de β-adrenérgico en el microambiente tumoral
La investigación anterior indica que la señalización de β-adrenérgico regula el microambiente tumoral mediante el reclutamiento o la modificación de la actividad del tumor macrófagos -asociado [20]. Para determinar si el estrés crónico afecta el microambiente tumoral, se utilizó citometría de flujo para cuantificar la composición de células HT-29 en tumores primarios cosechadas a partir del bazo.
Como se muestra en la figura 4A, el estrés crónico aumentó CD11b
+ F4 /80
+ infiltración de macrófagos (cambio de 4,2 veces:. 2,79 ± 0,43% de células vivas en el grupo BC
vs 10,33 ± 1,01
% en el grupo de BS,
P = 0,0023
, Fig 4B). El estrés crónico también aumentó la infiltración M-MDSCs por 2,4 veces (BC
vs
BS:.. 17.15 ± 0.38% de células vivas
vs
35.51 ± 4.27%,
P
= 0,0128, figura 4C y 4D). El estrés crónico reclutamiento de macrófagos asociados al tumor y M-MDSCs principalmente inducida al tumor primario, como G-MDSCs no estaban presentes (
P
& gt; 0,05). Para confirmar que los macrófagos asociados tumor y la infiltración M-MDSCs estaban mediados por la vía de señalización β-adrenérgicos, se analizó la composición de las células de tejido tumoral bazo recogidas de ratones estresados tratados con propranolol o ICI118,551. Como se muestra en la figura 4, el tratamiento β-bloqueante abrogada significativamente el CD11b
+ F4 /80
+ macrófagos de población en el tejido del tumor primario (PS
vs
BS:. 6,71 ± 0,57% de vida células
vs
10,33 ± 1,01%,
P = 0,0353
; ES
vs
.BS:. 6,60 ± 0,68% de células vivas
vs
. 10,33 ± 1,01%,
P = 0,0374
). Sin embargo, no se observó significación en el CD11b
+ Gr
loLy6C
hi poblaciones MDSC (PS
vs
BS:. 28,08 ± 0,80% de células vivas
vs
. 35.51 ± 4.27%,
P = 0,2722
; es
vs
.BS:. 26,77 ± 0,57% de células vivas
vs
35.51 ± 4.27%,
P = 0,2116
).
(a) CD11b
+ F4 /80
+ células se cuantificaron por citometría de flujo en el TC-29 tumores primarios de bazo cosechadas 28 días después de la inyección. (B) Los datos representan la media CD11b
+ F4 /80
+ composición de tumores recogidos a partir del bazo. **
P Hotel & lt; 0,01 frente al grupo AC,
#
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo BS. (C) MDSCs se cuantificaron por citometría de flujo en el TC-29 tumores primarios de bazo cosechadas 28 días después de la inyección. (D) Los datos representan la media CD11b
+ Gr
loLy6C
composición alta en tumores recogidos a partir del bazo. *
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo antes de Cristo.
Efecto de la vía de señalización de β-adrenérgico sobre la metástasis hepática
Los estudios anteriores sugieren que el estrés crónico altera el microambiente del tumor y puede contribuir a la metástasis del cáncer
In
vivo [21]. Para determinar si el estrés crónico promueve la metástasis del hígado, se examinaron la expresión de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9 y VEGF en tumores de bazo por RT-PCR y análisis de transferencia Western. Se encontró que el TGF-β (aumento 9,4 veces,
P
= 0.0040), IL-6 (aumento 7,6 veces,
P
= 0,0005), PTGS2 (aumento 8,1 veces,
P = 0,0002
), MMP-9 (aumento de 9,4 veces,
P = 0,0081
), y VEGF (aumento de 7,6 veces,
P = 0,0005
) ARNm expresión aumentó significativamente en los ratones en el grupo BC, en comparación con los ratones en el grupo de BS. Los ratones tratados con bloqueadores beta tenían significativamente disminuyeron TGF-β, IL-6, expresiones PTGS2, MMP-9 y VEGF mRNA en tumores de bazo en comparación con los ratones en el grupo de BS (Fig 5A). No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos propranolol y ICI118,551 (
P Hotel & gt; 0,05).
(A) la expresión de ARNm de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9 , y VEGF con respecto a los ratones en el grupo BC en los tumores del bazo **
P
. & lt; 0,01 frente al grupo AC,
#
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo BS,
##
P Hotel & lt; 0,01 frente al grupo BS. (B) Expresión de proteínas de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9 y VEGF en tumores de bazo. GAPDH se utilizó como control de carga.
También se observó aumento de la expresión de proteínas de TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9 y VEGF proteína en ratones expuestos a estrés crónico, que era abrogadas por el tratamiento con bloqueadores beta (figura 5B).
Los estudios anteriores sugieren que el estrés psicológico crónico promueve la metástasis por la sobre regulación de la neovascularización tumoral y la invasión de los tejidos. Aquí nos muestran que VEGF, CD31, y MMP9 expresión de la proteína aumenta en el tejido hepático indicativo de la angiogénesis y la invasión. La expresión fue significativamente mayor en los ratones en el grupo de BS en comparación con los ratones del grupo AC (VEGF: 2,5 veces aumento,
P = 0,0014
; CD31: aumento de 2,1 veces,
P =
0,0004; MMP9: aumento de 2,2 veces,
P = 0,0028
). La inhibición de la señalización de β-adrenérgico disminuido VEGF (PS
vs
BS:.. 0,3091 ± 0,04158
vs
0,5340 ± 0,04043,
P = 0,0179
; es
vs .
BS:. 0,2854 ± 0,02639
vs
0,5340 ± 0,04043,
P = 0,0067
), CD31 (PS
vs
BS:. 0,3053 ± 0,03593
vs
0,4333 ± 0,01677,
P = 0,0320
; es
vs
BS: 0,3040 ± 0,02751
vs
0,4333 ± 0,01677,
P..
= 0,0160) y MMP9 (PS
vs
BS:.. 0,3338 ± 0,01203
vs
0,5277 ± 0,04289,
P = 0,0121
; es
vs
BS:. 0,3187 ± 0,01987
vs
0,5277 ± 0,04289,
P = 0,0115
) expresión de la proteína (figura 6).. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la activación de la señalización de β-adrenérgico es necesario y suficiente para mejorar la angiogénesis tumoral, invasión y metástasis en la presencia de estrés crónico.
muestras de tumor metastásico (A) del hígado se tiñeron para VEGF por inmunohistoquímica. muestras de tumor metastásico (B) de hígado fueron teñidos para CD31 mediante técnicas de inmunohistoquímica. muestras de tumor metastásico (C) del hígado se tiñeron para MMP9 por inmunohistoquímica. Todas las fotografías fueron tomadas a 200 ×. (D) Media densidad óptica (DO) de VEGF, CD31, y MMP9 en los tumores metastásicos del hígado de los ratones en el AC, PC, IC, BS, PS, e IS grupos. **
P Hotel & lt; 0,01 frente al grupo AC,
#
P Hotel & lt; 0,05 frente al grupo BS,
##
P Hotel & lt; 0,01 frente al grupo de BS.
En conjunto, nuestros resultados sugieren que el estrés crónico promueve CRC metástasis hepáticas a través de la señalización de β-adrenérgico, y hace hincapié en la importancia del microambiente del tumor en la regulación de la invasión de las células tumorales.
Discusión
a pesar de las mejoras en la terapia integral para CRC, los médicos se enfrentan a desafíos en tratar a los pacientes con metástasis hepática debido a la limitada eficacia. En este estudio, encontramos que el estrés crónico aumenta el crecimiento y la metástasis de CRC a través de la señalización de β-adrenérgicos (Fig 7).
β-adrenérgicos de señalización mejorado significativamente la difusión de células tumorales de hígado, y la inhibición farmacológica de β- señalización adrenérgico reduce la metástasis de hígado. Nuestros estudios también sugieren que el propranolol puede complementar las estrategias terapéuticas existentes para retrasar o prevenir la metástasis hepáticas de CCR, mejorando la supervivencia de los pacientes que sufren de estrés psicológico.
El impacto negativo del estrés crónico en los resultados del cáncer está bien establecida. El estrés crónico activa el SNS y el eje HPA para estimular la liberación de catecolaminas, y regular aún más el microambiente tumoral y afectar a la progresión del tumor [19]. Las catecolaminas son potentes estimuladores de la vascularización. Estudios previos muestran que la moderación de estrés crónico conduce a aumento de los niveles de catecolaminas de tejido y angiogénesis tumoral mejorada mediante la regulación de VEGF y MMP expresión [22]. Además, los bloqueadores beta habían demostrado que invertir la tensión mejorada la angiogénesis [23]. Otros estudios muestran que el estrés crónico eleva las hormonas del estrés que aumentan el crecimiento CRC
in vivo
[16]. Aquí, ampliamos en estos estudios mediante la investigación de la función de las catecolaminas en CRC metástasis en el hígado. Nuestros resultados demuestran que el estrés crónico eleva significativamente los niveles E y NE en el suero y en el tejido tumoral.
Para determinar si el estrés crónico era suficiente para regular la angiogénesis
in vivo
, estudiamos la densidad de los vasos sanguíneos de hígado metastásico del tumor a través de VEGF y la inmunotinción CD31 y encontró un aumento significativo de la angiogénesis en ratones estresados, respectivamente. De acuerdo con estudios previos que demuestran que el SNS regula la angiogénesis, nuestros datos sugieren tratamiento β-bloqueante abrogada vascularización inducida por el estrés. También se muestra que la exposición al estrés crónico regula la expresión de MMP9 en el hígado tumor metastásico. En conjunto, nuestros datos sugieren que la señalización de β-adrenérgico regula tanto la vascularización del tumor y la invasión.
El estrés crónico también puede alterar el microambiente del tumor y promover la progresión tumoral mediante la supresión de la inmunidad del huésped [2, 24]. TAM y MDSCs dos grandes células inmunosupresoras en el microambiente tumoral. TAM suprimen las células inmunes anti-tumorigénicos, promoviendo así la metástasis [25]. Sin embargo, el mecanismo de la participación de TAM en la metástasis del hígado durante la exposición al estrés psicológico crónico no se ha definido. MDSCs también se acumulan en pacientes que informaron altos niveles de estrés psicológico [26-27]. Nuestros datos confirman los resultados anteriores que el estrés crónico da forma a la microambiente tumoral mediante el reclutamiento de macrófagos y más MDSCs en el tumor primario, lo que puede facilitar la metástasis.
Nuestros datos muestran que la exposición al estrés crónico altera significativamente el microambiente del tumor primario, que puede facilitar la metástasis en órganos distantes. Es importante destacar que la inhibición farmacológica de la señalización de β-adrenérgico puede ser una nueva estrategia para minimizar CRC metástasis en el hígado. Nuestros resultados son consistentes con los hallazgos epidemiológicos que vinculan el uso de β-bloqueante a la reducción de la metástasis y la mortalidad por cáncer de colon [28, 29]. Nuestros datos plantea la intrigante posibilidad de que el tratamiento con β-bloqueantes puede ser una nueva estrategia para la gestión del estrés crónico en pacientes con CCR. Además, nuestros resultados ponen de relieve la importancia de considerar la psicología del paciente en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para limitar la progresión del cáncer y minimizar las tasas de metástasis en el CCR.
Reconocimientos
Los autores agradecen al técnico de Yuejin Gao en la División de Ciencia Animal de Laboratorio en el hospital Putuo afiliado a la Universidad de Shanghai de Medicina tradicional china para una excelente orientación sobre los experimentos con animales y el cuidado del ratón.