Extracto
Pim-1 quinasa, una proteína serina /treonina quinasa codificada por el
pim
proto-oncogén, está implicado en varias vías de señalización tales como la regulación de la progresión del ciclo celular y apoptosis. Muchos tipos de cáncer muestran altos niveles de expresión de Pim quinasas y particularmente Pim-1 se ha relacionado con el inicio y la progresión del fenotipo maligno. En varios tejidos de cáncer se han identificado somáticas Pim-1 mutantes. Estas variantes naturales son polimorfismos de nucleótido único no sinónimas, variaciones de un solo nucleótido que ocurre en la región codificante y que conduce a sustituciones de aminoácidos. En este estudio se investigó el efecto de la sustitución de aminoácidos en la estabilidad estructural y de la actividad de Pim-1 quinasa. Hemos expresado y purificado algunos de los mutantes de Pim-1 quinasa que se expresan en tejidos de cáncer e informaron en la base de datos polimorfismos de nucleótido único. Las mutaciones puntuales en las variantes afectan significativamente la conformación del estado nativo de Pim-1. Todos los mutantes, expresados como proteínas recombinantes solubles, muestran una disminución de la estabilidad térmica y termodinámica y unos valores de energía de activación más bajos para la actividad quinasa. La estabilidad disminuido acompañado de un aumento de la flexibilidad sugiere que Pim-1 variantes pueden estar involucrados en una red más amplia de las interacciones proteína. Todos los mutantes obligados ATP y ATP inhibidores miméticos con valores de IC50 comparables que sugieren que los estudiados Pim-1 quinasa mutantes se pueden dirigir de manera eficiente con los inhibidores desarrollados para la proteína de tipo salvaje
Visto:. Lori C, Lantella A, A Pasquo , Alexander LT, Knapp S, Chiaraluce R, et al. (2013) Efecto del único Sustitución de Aminoácidos Observado en Cáncer de Pim-1 quinasa termodinámico de estabilidad y estructura. PLoS ONE 8 (6): e64824. doi: 10.1371 /journal.pone.0064824
Editor: Annalisa Pastore, Instituto Nacional para la Investigación Médica, Medical Research Council, Londres, Reino Unido
Recibido: 23 Enero, 2013; Aceptado: 18 de abril de 2013; Publicado: 5 Junio 2013
Copyright: © 2013 Lori et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Pim-1 quinasa pertenece a una familia de serina /treonina proteína quinasas (EC 2.7.11.1) que están codificadas por el
pim
proto-oncogenes [1] - [3]. Pim-1 locus ha sido identificado originalmente como un sitio de inserción proviral común en los linfomas de células T inducidas por virus de la leucemia murina de Moloney en ratones [4]. La proteína quinasa codificada está implicado en varias vías de señalización tales como la regulación de la progresión del ciclo celular y la apoptosis. Los tres miembros de la familia Pim Pim-1, Pim-2 y Pim-3 identificados en los seres humanos han sido reportados como señalización de las proteínas quinasas que juegan un papel importante en la biología del tumor [5], [6]. Además, muchos tipos de cáncer muestran altos niveles de expresión de Pim quinasas. Por ejemplo Pim-1 y PIM-2 se han notificado a ser altamente expresado en la leucemia, linfoma, cáncer de próstata y el mieloma múltiple y se consideran implicados en la iniciación y la progresión del fenotipo maligno [7]. Además, Pim-1 ha sido identificado como un cofactor clave que regula la expresión del factor de transcripción oncogénica de c-Myc mediante la fosforilación de la serina 10 en la histona H3 en la región de promotor de del locus Myc y sus genes diana [8].
la expresión de Pim-1 quinasa puede ser inducida por una variedad de factores de crecimiento. Pim-1 homeostasis es importante para la función celular normal. actividad Pim-1 es, por tanto, estrechamente regulada en varios niveles, incluyendo la transcripción, post-transcripcional, traduccional y post-translacional. Varias vías de transducción de señales se han asociado con la regulación de Pim-1 de expresión. Por ejemplo Pim-1 expresión es estimulada por la activación de la vía JAK /STAT, que también regula su degradación a través de bucle de realimentación negativa. Pim-1 se sobreexpresa en muchos tumores malignos hematológicos y estudios recientes en quinasas de la familia Pim indican que desempeñan papeles importantes también fuera del sistema hematopoyético, como en las células de varios tumores sólidos [6]. Notablemente, en varios tejidos de cáncer somáticas Pim-1 mutantes han sido identificados [9] - [12]. Muchas de estas variantes son los polimorfismos de nucleótido único (no sinónimas nsSNPs), variaciones de nucleótido único que se producen en la región codificante y que conducen a una secuencia de polipéptidos con sustituciones de aminoácidos [13]. Es importante destacar que, después de la estimulación del factor de crecimiento los niveles de proteína Pim-1 son transitorios y la proteína tiene una vida media corta en las células que se degrada rápidamente por el sistema de ubiquitina.
A número de investigaciones han abordado el efecto de nsSNPs en proteínas de estabilidad, las interacciones proteína-proteína y proteína funciona [14]. Al mismo tiempo, las variantes naturales han sido catalogados con el objetivo de distinguir entre natural diferencias genéticas, presumiblemente sin consecuencias funcionales (mutaciones de pasajeros) como los recogidos en la base de datos SNP, y los asociados con el desarrollo de enfermedades (mutaciones del conductor) [15], ya que la base de datos OMIM [16], la base de datos del Genoma humano mutación [17] y, en particular aquellos que se encuentran asociados con el cáncer (cósmica) [11].
análisis computacional de los mutantes identificados ha predicho que alrededor del 30% de variantes de proteínas que resultan de nsSNPs son menos estables que la variante de tipo salvaje [18] Sin embargo, todavía se necesita una evaluación experimental de la estabilidad de las variantes comunes para determinar el efecto de las mutaciones sobre la estructura y función de proteínas [19].
en este estudio se seleccionó nsSNPs resultantes en las variantes Pim-1 que se expresan en tejidos de cáncer y figura en la base de SNP [9], [11], [20]. Estas variantes Pim-1 se han caracterizado exhaustivamente para investigar el efecto de la sustitución de un solo aminoácido en Pim-1 la estabilidad y la estructura térmica y termodinámica en solución. Nuestro estudio mostró que todos los mutantes estudiados conducen a la desestabilización significativa de Pim-1 quinasa.
Resultados
espectroscópico Caracterización de Pim-1 Tipo y mutantes silvestres que se encuentran en el cáncer
este estudio se seleccionaron cuatro mutaciones (Y53H, E124Q, E135K y E142D) que todos han sido detectados en el cáncer para una estabilidad detallada de proteínas y análisis estructural mediante técnicas espectroscópicas (Fig. 1). Los mutantes se encuentran en el dominio catalítico de Pim-1 quinasa (Fig. 1A). Y53 está situado en el lóbulo N-terminal quinasa en la base central de β-lámina y sus formas de nitrógeno amida de un enlace de hidrógeno con el grupo carbonilo I66 en la cadena beta 3 (fig. 1B). El residuo E124 está situado en la región de bisagra quinasa y forma un puente salino con R122 (Fig. 1C). La región bisagra es un elemento clave que regula el movimiento del lóbulo C-terminal que puede ser afectado por la mutación E124Q. E135 se encuentra en la hélice αD formar un enlace de hidrógeno con Q127 que es probable que sea importante en la estabilización de esta hélice (Fig. 1C). Finalmente, E142 es un residuo expuesto de la superficie y la sustitución conservadora con y aspartato no es probable que tenga un efecto significativo en la estabilidad de proteínas, la dinámica y la estructura
(A) Estructura del Pim-1 (código PDB:. 1XWS ) se muestra como un diagrama de la cinta. residuos mutados se resaltan y se muestran los principales elementos de la estructura secundaria. El inhibidor cocristalizada mimética ATP en esta estructura se muestra en la bola y el palo de representación. (B) Vista detallada del entorno estructural local en todo el Y53 residuo mutado. (C) Vista detallada del entorno estructural local en todo el E135 residuo mutado. (D) Near-UV CD espectros se registraron en una cubeta de cuarzo 1,0 cm a 1,4 mg /ml la concentración de proteína en 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 que contiene 0,2 M NaCl y DTT 2 mM. (E) los espectros de emisión de fluorescencia intrínseca se registraron a 0,04 mg /ml la concentración de proteína (295 nm de excitación de longitud de onda) a 10 ° C en 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 que contiene 0,2 M NaCl y 200 mM de DTT. (F) Far-UV CD espectros se registraron en una cubeta de cuarzo 0,1 cm a 0,2 mg /ml en 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 que contiene 0,2 M NaCl y 0,4 mM de DTT.
The espectro CD UV cercano de tipo salvaje Pim-1 muestra la contribución espectral de todos los residuos aromáticos y se caracteriza por dos fuertes picos negativos centrados a 290 nm y a 269 nm acompañado de características de estructura fina en 275 a 280 nm (Fig. 1D) . El mutante E124Q muestra un espectro CD UV cercano muy similar a la del tipo salvaje excepto por un ligero descenso de la estructura fina en 275 a 280 nm. E142D muestra un espectro de CD de UV cercano que difiere sorprendentemente a partir del espectro de tipo salvaje en la región de 275-280 nm. El espectro CD UV cercano de Y53H es dramáticamente diferente del espectro de tipo salvaje y los otros mutantes: la estructura fina en 275 a 280 nm se pierde, la contribución a 290 nm se reduce significativamente y la elipticidad negativa en alrededor de 269 nm es marcadamente alterada. E135K espectro CD UV cercano se parece al de Y53H con un disminuido notablemente la actividad dicroico en la región de 290 a 275 nm y con una contribución positiva en la región por debajo de 275 nm. Los espectros de emisión de fluorescencia de tipo salvaje y mutantes estén centrados en la misma longitud de onda de emisión máxima alrededor de 345 nm diferencias y mostrar en la intensidad de fluorescencia de emisión (Fig. 1E). Far-UV CD espectros de todos los mutantes son prácticamente superponibles a la de Pim-1 de tipo salvaje y típico de una proteína alfa y beta, que muestra un mínimo local en alrededor de 208 nm, un 200 nm intersección cero y una relación de 1,52 de la 208 /222 bandas (Fig. 1F).
dependencia de la temperatura de la actividad quinasa
la dependencia de la temperatura de la actividad quinasa de Pim-1 de tipo salvaje y sus mutantes se examinó por encima del rango de temperatura de 10- 42 ° C (Fig. 2A). Las temperaturas óptimas para la catálisis, en la concentración de ATP constante, se estima que a 37 ° C para el tipo salvaje y E142D, en torno a 35 ° C durante E124Q y Y53H, y en torno a 30 ° C durante E135K (Tabla 1 y Fig. 2A). En particular, la actividad de la quinasa a 37 ° C de todos los mutantes Pim-1 se reduce significativamente y se corresponde con 57, 37, 16 y 3% de la de la proteína de tipo salvaje para E142D, E124Q, Y53H y E135K, respectivamente. La energía de activación,
E
a
‡, determinado por la ecuación de Arrhenius (1) en el intervalo de temperatura entre 10 ° C y la temperatura óptima de cada proteína es menor que la de la naturaleza tipo (Tabla 1 y Fig. 2B). Este resultado sugiere un aumento de la flexibilidad de todas las variantes en comparación con la de tipo salvaje, particularmente evidente para E135K. La comparación de la dependencia de temperatura de la actividad quinasa con el desplegamiento térmico estructural monitorizado a 209 nm (Fig. 3A) indica claramente que todas las variantes son significativamente menos térmico resistente y más flexible que el tipo salvaje
.
(A) dependencia de la temperatura de la actividad quinasa de Pim-1 de tipo salvaje y mutantes. (B) de ajuste no lineal de la dependencia de la temperatura de la actividad quinasa de la ecuación de Arrhenius (ecuación 1.); El recuadro muestra el gráfico de Arrhenius lineal para los mismos datos. Los ensayos se realizaron en las condiciones descritas en Materiales y Métodos, utilizando la enzima 2,7 mM.
(A) Pim-1 de tipo salvaje y mutantes se calentaron desde 10 ° C a 72 ° C en un 0.1- cm cubeta de cuarzo a 0,2 mg /ml en 20 mM Tris /HCl, pH 7,5 que contiene 0,2 M NaCl y DTT 0,4 mM. La actividad dicroico a 209 nm se monitorizó continuamente cada 0,5 ° C. (B) primera derivada de los mismos datos que en (A). (C) los datos PMTV registran en los mismos experimentos se muestra en (A).
térmica del despliegue
La estabilidad térmica de Y53H, E124Q, E135K y fue investigado por E142D un seguimiento continuo de los cambios de elipticidad a 209 nm en el intervalo de temperatura entre 10 y 72 ° C. Los datos de los mutantes se compararon con la de la proteína de tipo salvaje (Fig. 3A). El parámetro elegido para comparar las curvas de transición de Pim-1 de tipo salvaje y mutantes es la temperatura de fusión (T
m) definido como el punto del proceso de desnaturalización mediados tal como se calcula mediante el trazado de la primera derivada de los valores de elipticidad molar como una función de la temperatura (Fig. 3B). Los cambios inducidos por la temperatura de elipticidad a 209 nm, donde se observó la amplitud principal, se encuentran en una transición cooperativa aparente para E124Q y E142D, con T
m valores de 40,0 por E124Q y 44,0 ° C durante E142D. Para E135K la transición aparece menos cooperativa con un T
m valor de 45,0 ° C y no hay acumulación detectable de despliegue intermedia (s), lo que sugiere que la sustitución de E135 con un residuo de lisina puede inducir despliegue un local parcial y /o que esta variante puede existir como una población heterogénea de estados plegados. Para el tipo salvaje y Y53H, las aparentes transiciones térmicas de tres estados sugieren que la acumulación de despliegue intermedios con dos T
m valores. La primera transición se produce con T
m valores (T
m1) a 40,5 y 40,0 ° C, el segundo (T
m2) en 54,0, 52,0 ° C para el tipo salvaje y Y53H, respectivamente (Tabla 2 ). Los cambios de elipticidad inducidos por la temperatura de tipo salvaje y mutantes son todos coincidente con el aumento inducido por el calor de la tensión del tubo fotomultiplicador (PMTV) por encima de 370 V (Fig. 3C), lo que sugiere que la inducida por la temperatura despliegue está acompañado por la proteína de agregación [ ,,,0],21]. Agregación ocurrió también cuando las exploraciones térmicas se realizaron a una velocidad de calentamiento inferior con un cambio de la aparente m T
a temperaturas más bajas; las diferencias entre la aparente T
m de tipo salvaje y variantes fueron los mismos que los medidos en mayor velocidad de calentamiento (datos no mostrados). Las transiciones observadas son irreversibles, como se indica por los espectros medidos al final de la fase de enfriamiento que difieren de los de las proteínas nativas medidos al comienzo de las transiciones térmicas. Además, la inspección de la cubeta al final de la fase de enfriamiento reveló la presencia de una gran cantidad de precipitado en todas las muestras.
Efectos de PIM-1 mutaciones en ATP y la unión del inhibidor
Las mutaciones identificadas en el cáncer son una causa frecuente de resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, estábamos interesados si la unión del inhibidor se vería afectada por las mutaciones estudiadas. Para hacer frente a esta hemos examinado varios inhibidores conocidos Pim-1 de la beta-carbolina y imidazopyridazole clase [22], [23] por los ensayos de cambio de la temperatura [24]. Screening contra una serie de derivados de inhibidor no reveló diferencias significativas en los valores de cambio de temperatura que sugieren que todos los mutantes se unen estos inhibidores con constante de unión similares (Tabla S1 y la Tabla S2). Para confirmar esta medimos enzima datos cinéticos en un subconjunto de inhibidores. Los valores de IC50 de Pim-1 inhibidores K00487, K018444a y K00207a fueron 0.048, 0.010 y 0.007 mm, respectivamente, por Pim-1 de tipo salvaje. Estos valores fueron muy similares para las variantes de Pim-1 con la excepción de los valores de IC50 para K00487 y K00207a que eran de 1,8 y 1,4 veces mayor para Y53H. Llegamos a la conclusión de que, por tanto, un inhibidor específico de unión no se ve afectada de manera significativa por las mutaciones estudiadas.
Equilibrio urea inducida despliegue Transiciones
Pim-1 de tipo salvaje y variantes de forma reversible desarrollarse en urea a 10 ° C en Tris HCl 20 mM, pH 7,5, que contiene 200 mM de ditiotreitol (DTT) y 0,2 M NaCl. El efecto de concentraciones crecientes de urea (0-8 M) en la estructura de Pim-1 mutantes se analizó por medida de UV-CD y la espectroscopia de fluorescencia y en comparación con el efecto ejercido sobre el tipo salvaje. La intensidad de emisión de fluorescencia intrínseca a 345 nm de Pim-1 de tipo salvaje y variantes de cambios después de 30 minutos de incubación a 10 ° C, un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio (Fig. 4). La representación gráfica de los cambios de intensidad de fluorescencia relativa frente aumentar la concentración de desnaturalizante muestra perfiles complejos para el tipo salvaje y todos los mutantes (Fig. 4), lo que sugiere un proceso de despliegue no de dos estados y la población de desnaturalización intermedio (s). La complejidad de los perfiles se desarrollan puede atribuirse a la arquitectura de múltiples dominios de Pim-1 que contiene residuos de triptófano en ambos los lóbulos N-terminales y C-terminales de la proteína. Al final de la transición, por encima de 7 M urea, la intensidad de emisión de fluorescencia intrínseca a 345 nm se reduce aproximadamente 1,3 veces (Fig. 4) y la fluorescencia máxima de longitud de onda de emisión se desplaza a alrededor de 357 nm, ya sea para el tipo salvaje y todas las variantes (datos no mostrados). Las mismas muestras utilizadas para monitorear los cambios de emisión de fluorescencia (Fig. 4) durante la transición despliegue se utilizan para controlar el momento-UV circular elipticidad dicroísmo (Fig. 5) para permitir una comparación directa con los datos de fluorescencia. Los cambios de urea-inducida en 222 nm elipticidad de todos los mutantes son similares a la del tipo salvaje, muestran una dependencia sigmoidal de la concentración de urea y seguir una transición de dos estados aparente sin ninguna detectable intermedio (Fig. 5). El proceso de despliegue es completamente reversible tras la dilución del desnaturalizante, ya sea para el tipo salvaje o para todos los mutantes (Fig. 5) con puntos medios de transición entre 4,23 y 5,34 M urea (Tabla 2). La Tabla 2 muestra los valores de los parámetros termodinámicos obtenidos para el tipo salvaje y formas mutantes de Pim-1 a partir de los datos de transición de CD UV lejano. -1 Pim tipo salvaje es significativamente más estable que todas las variantes, como se indica por comparación de Δ
G
valores que en el caso de E135K es de aproximadamente 3,5 veces menor que la del tipo salvaje (Tabla 2) . La disminución de Δ
G
puede ser referido principalmente a los menores
valores de m
observados para todas las variantes con respecto al tipo salvaje. Estos resultados indican que el cambio en el área de superficie expuesta a disolvente despliegue es menor para todas las variantes Pim-1 que para la proteína de tipo salvaje. En particular, los valores de
m
determinados para Pim-1 de tipo salvaje y sus variantes (Tabla 2) son cinco veces menor que la predicha para una proteína monomérica de 272 residuos de aminoácidos desplegado en la urea [25]. Los bajos valores de
m
puede estar relacionado con el equilibrio de varios estados desarrollo, en línea con los resultados obtenidos de supervisión del proceso que tiene lugar por la intensidad intrínseca de emisión de fluorescencia (Fig. 4).
relativa normalizada intensidades de fluorescencia a 345 nm; las líneas continuas representan el ajuste de regresión no lineal de las intensidades de fluorescencia relativa a 345 nm de la ecuación. 5 calculado como se describe en Materiales y Métodos. Los puntos de reversibilidad se muestran como círculos vacíos y no se incluyeron en el análisis de regresión no lineal. Todos los espectros se registraron a 10 ° C como se describe en Materiales y Métodos. (A-C) La fracción del nativo (
f
N), primer intermedio (
f
I1), segundo intermedio (
f
I2) y desplegada (
f
estados U), calculado como se describe en Materiales y Métodos utilizando los parámetros termodinámicos obtenidos a partir de los ajustes del equilibrio despliegue transiciones a la ec. 5, se muestran para el tipo salvaje (A), E124Q (verde) (B) y E135K (rosa) (C).
elipticidad molar a 222 nm ([Θ]
222 ) informaron después de la eliminación del ruido de alta frecuencia y el error aleatorio de baja frecuencia por SVD. Las líneas continuas son los de regresión no lineal a la ecuación. 3 de los datos a concentraciones variables desnaturalizantes, como se describe en Materiales y Métodos. Los puntos de reversibilidad (símbolos vacíos) se muestran, para mayor claridad, solamente para el tipo salvaje y no se incluyeron en el análisis de regresión no lineal. Todos los espectros se registraron a 10 ° C como se describe en Materiales y Métodos.
La urea inducido se analizaron mediante un modelo de transición de cuatro estados despliegue transiciones supervisadas por los cambios de intensidad de fluorescencia relativa (Fig. 4) a la ecuación 5 como se indica en Materiales y Métodos. Los parámetros termodinámicos relativos al proceso de despliegue se reportan en la Tabla 3. Los datos indican que la primera transición de estado nativo (N) a la primera intermedio (I
1) se produce para Pim-1 de tipo salvaje y todos los mutantes por debajo de 1 M de urea con una mayor Δ
G
valor para E124Q y un menor Δ
G
relación calidad-E135K. La segunda transición de I
1 a la segunda intermedio (I
2) se produce en un intervalo de concentración de urea muy similar para toda la Pim-1 mutantes examinados y Δ
G
valores para E142D y Y53H sugerir una estabilización de la sustancia intermedia para estas dos variantes (Tabla 3). El Δ
G
valor en relación con la última transición al estado desnaturalizado (U) es significativamente mayor para el tipo salvaje en comparación con las variantes. En línea con los resultados obtenidos a partir de ahora-UV CD transiciones sigmoidal (Tabla 2), la suma de la Δ
G
valores para los tres transiciones es más grande para el tipo salvaje, en comparación con los otros mutantes, con el excepción de E142D cuya
G
tot Δ es similar a la del tipo salvaje. Cabe destacar que la Δ
G
tot de E135K es significativamente inferior a la de todas las otras variantes. La discrepancia entre los parámetros termodinámicos obtenidos de lejos-UV CD y la intensidad de fluorescencia apoya fuertemente la presencia de productos intermedios que se desarrollan. La falta de un intermedio detectable por CD UV lejano puede indicar que los estados intermedios detectados por fluorescencia representan cambios conformacionales que se producen en la proximidad de cualquiera de los residuos de triptófano, con arreglos terciarias alternativos. Está bien establecido que la intensidad de fluorescencia es muy sensible al medio ambiente de un fluoróforo y se considera como una de las señales más directos que se pueden utilizar para controlar la termodinámica de las transiciones que se desarrollan [26]. Para evaluar la acumulación fraccionada de las diferentes especies sobre urea inducida despliegue, la distribución de equilibrio de las cuatro especies, N, I
1, I
2 y U como una función de la concentración de desnaturalizante podrían reconstituirse usando el equipada Los valores de Δ
G
1, Δ
G
2, Δ
G
3
m
1,
m
2 y
m
3 reportaron en la Tabla 3. La distribución de equilibrio de N, I
1, I
2 y U es similar para el tipo salvaje (Fig. 4A) y todas las variantes, sin embargo, algunas diferencias se pueden observar (Fig. 4B-C). La fracción de N (
f
N) se incrementa para E124Q (Fig. 4B) y significativamente más pequeño para E135K (Fig. 4C), y similar a la de los de tipo salvaje (Fig. 4A ) para todas las otras variantes Pim-1 (datos no presentados). La fracción de I
1 (
f
I1), que se acumula en 1,0 M de urea para todas las especies, es un poco más grande y más pequeño para E135K para E124Q. La distribución fraccionada de la segunda desnaturalización intermedia I
2 (
f
I2), que se acumula en alrededor de 4,0 M de urea, aparece aumentó moderadamente durante Y53H, E124Q y E135K, en comparación con el tipo salvaje (datos no mostrados). En particular, para el tipo salvaje y todas las variantes que se desarrollan los intermedios I
1 muestran la misma longitud de onda de emisión máxima de N centrada en aproximadamente 345 nm, mientras que la de I
2 se desplaza a alrededor de 348 nm. El análisis detallado de Pim-1 transiciones de desnaturalización sugiere que las diferencias significativas en la plasticidad de dominio y desplegado se producen en Pim-1 mutantes en comparación con la proteína de tipo salvaje.
Discusión
Este estudio representa, a nuestro conocimiento, la primera espectroscópico y caracterización termodinámica de quinasa humana Pim-1 y algunos de sus mutantes de enfermedades relevantes encontrados en el cáncer. Se investigó el efecto de la sustitución de aminoácidos en la estabilidad térmica y termodinámica de tipo salvaje Pim-1 y se compararon estos resultados con cuatro variantes Pim-1, Y53H, E124Q, E135K y E142D, publicados en la base de datos de SNPs [9] - [12] , [15], [20]. El examen de la estructura cristalina Pim-1 mostró que la mayoría de las mutaciones se encuentran cerca de los elementos estructurales importantes para la función quinasa y que forma interacciones polares con residuos vecinos.
Las mutaciones puntuales en las variantes afectan significativamente la conformación de la nativa estado de Pim-1. Las diferencias en el CD de UV cercano entre mutantes y de tipo salvaje sugieren que los contactos terciarios se alteran de manera significativa para todos los mutantes y que la sustitución de aminoácidos solo afecta Pim-1 estructura terciaria y conducir a cambios profundos en el pliegue de proteínas en general terciario. En particular, la sustitución de Y53 con histidina conduce a dramáticos cambios en la estructura terciaria, tal como se revela por la pérdida de la estructura fina en 260 a 280 nm (Fig. 1D). El Y53H mutante lóbulo N-terminal muestra las variaciones más significativas en los contactos terciarios, como se juzga sobre la base de espectro CD UV cercano. En particular, el espectro de CD de UV cercano del mutante E124Q aparece más similar a la del tipo salvaje, probablemente debido a que el cambio de un residuo de Glu polar cargada en el residuo Gln polar no cargado sólo tiene un efecto menor en la estructura terciaria y su estabilidad .
el residuo Tyr53 se coloca en el medio de la cadena beta 2 y su nitrógeno de la amida es hidrógeno unido al carbonilo de I66 en beta-strand 3. en Y53H, la sustitución de Y53 con una histidina polar puede dar lugar a un nuevo enlace de hidrógeno con H68 (Fig. 1). Además, la proximidad de Y53 a de unión a fosfato P-loop, una región que juega un papel importante en la especificidad y afinidad de los inhibidores de [27], sugiere que la mutación de este residuo puede influir en la unión del inhibidor.
la otra mutación encontrada en el cáncer, E124Q, se refiere a un residuo situado en la región de bisagra (121 a 126). El OE2 de E124 forma un puente salino con el H11 de la vecina R122 (Fig. 1). La sustitución de E124 para glutamina (E124Q) destruye el puente de sal en la región de bisagra que puede determinar la movilidad de la (128-305) lóbulos N-terminal (33 a 121) y C-terminal. En particular, ya que los lóbulos menudo giran o cerca alrededor de la bisagra sobre inhibidores de la unión de la mutación E124 altera significativamente las propiedades dinámicas de la Pim-1 y puede cambiar inhibidores de afinidad. Curiosamente, este puente de sal glutamato-arginina no está presente en el Pim-2 isoforma posiblemente contribuir a la estabilidad más baja de esta proteína [28].
La reversibilidad del equilibrio inducido por urea despliegue a baja temperatura permite una cuantitativa determinación del efecto de las mutaciones en la termodinámica de Pim-1 despliegue. Todos los mutantes, expresados como proteínas recombinantes solubles, muestran una disminución de la estabilidad térmica y termodinámica (Tabla 2 y 3). El efecto desestabilizador de todas las sustituciones de aminoácidos es particularmente evidente a partir de la disminución de la temperatura de fusión supervisada por los cambios de estructura secundaria que sugiere una mayor flexibilidad de las variantes con respecto a la de tipo salvaje. La disminución de la temperatura de fusión de todo el Pim-1 variantes estudiado está acompañado de una disminución significativa en la Δ
G
H
2
O con relación a la urea inducida desplegado en comparación con el tipo silvestre. Estos resultados son sorprendentes ya que todos los mutantes son menos estables que el tipo silvestre y Pim-1 es un proto-oncogén, por lo tanto se puede concluir que Pim-1 variantes son menos eficientes como oncogenes que el tipo salvaje. Sin embargo, la estabilidad disminución se acompaña de un aumento de la flexibilidad, como se indica por los valores de energía de activación más bajos para la actividad de quinasa observada en todas las variantes en comparación con la del tipo salvaje, lo que sugiere que las variantes Pim-1 pueden estar implicados en una red más amplia de las interacciones proteína
en particular, los puntos medios de transición para los cambios espectrales de todos los mutantes no se cambian significativamente con respecto al tipo salvaje.; por lo tanto, la disminución de Δ
G
H
2
O valores se debe principalmente a una disminución de la
m
valores. Así, el efecto de la sustitución de aminoácidos en la estabilidad de Pim-1 se puede hacer referencia principalmente a una disminución en el cambio de la superficie expuesta disolvente en desarrollo para todas las variantes Pim-1.
En conclusión nuestros resultados indican que el efecto de la mutación observada en los tejidos de cáncer se dirigen a los cambios locales de la estructura terciaria que sin embargo no afectan la unión al tipo I quinasa inhibidores estudiados.
Materiales y Métodos
mutagénesis dirigida
Pim-1 plásmido enzima de tipo silvestre se obtuvo mediante SGC (Oxford). Cambio rápido de mutagénesis dirigida kit (Stratagene) se utilizó para introducir las mutaciones individuales en Pim1 tipo salvaje plásmido utilizado como plantilla. Los oligonucleótidos mutagénicos utilizados se enumeran en la Tabla 4.
Expresión y Purificación de Proteínas
proteína recombinante Pim-1 se ha expresado y purificado como se describe en [29], con modificaciones menores. Pim-1
tipo salvaje y mutantes se expresaron en
E. coli
cepa BL21 (DE3). 10 ml de cultivo de una noche se hizo crecer a 37 ° C en 1 l de medios LB que contenían ampicilina como antibiótico a una concentración final de 50 mg /ml hasta que la densidad óptica OD
600 alcanzó 0,6. El cultivo se enfrió en hielo durante 20 min, entonces la expresión de la proteína se indujo durante la noche mediante la adición de 0,5 mM isopropil-β-D-tiogalactósido (Sigma-Aldrich) y se cultivó durante la noche a 15 ° C con agitación enérgica. El cultivo se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 50 ml de tampón de unión (Hepes 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM, 5% de glicerol, pH 7,5) que contiene 0,5 mM
tris
(2-carboxietil) fosfina (TCEP), y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. Las células se descongelaron en hielo suplementado con inhibidores de la proteasa (completo, Roche) y se rompieron por sonicación. El lisado se aclaró por centrifugación y el sobrenadante se cargó en una columna DE52 (GE Healthcare), equilibrada previamente con tampón de unión y TCEP 0,5 mM, para eliminar los ácidos nucleicos. El flujo a través se cargó en una Ni-NTA (Ni
2 + - nitriltriacetate) columna de afinidad (GE Healthcare) pre-equilibrada con tampón de unión. La columna se lavó con tampón de unión para eluir los contaminantes débilmente ligados. La proteína recombinante se eluyó mediante el paso sobre la columna soluciones tampón que contienen concentraciones creciente de imidazol de unión (50 mM, 100 mM, 150 mM y 250 mM, respectivamente). Los eluatos recogidos se complementaron con una concentración final de DTT 10 mM y se analizaron para la pureza en SDS gel usando el sistema de gel prefabricado (Invitrogen). Las fracciones puras se incubaron durante la noche con la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV-Pro), para eliminar la etiqueta de hexahistidina. Después de la digestión, la proteína se concentró a 2 ml usando concentradores Millipore y se cargó en un Superdex 200 300/10 columna de filtración en gel en el sistema FPLC AKTA previamente equilibrada con Tris 50 mM /HCl, 0,25 M NaCl, 10 mM de DTT, pH 7,5 a una velocidad de 1,0 ml /min de caudal. Fracciones de 2 ml se recogieron y la proteína pura se identificó mediante SDS PAGE. La concentración de proteína se determinó por espectrofotometría utilizando una absortividad molar de 48930 M
-.
1 cm
-1at 280 nm basado en una masa molecular de 35.685 kDa
espectroscópico