Extracto
Antecedentes
La interacción de las sustancias químicas ambientales y sus metabolitos con macromoléculas biológicas pueden resultar en efectos citotóxicos y genotóxicos. 4 aminobifenilo (4-ABP) y varias otras arilaminas relacionadas han demostrado ser causalmente involucrados en la inducción de cánceres de la vejiga de orina humana. Los efectos genotóxicos y carcinogénicos de la 4-ABP se exhiben sólo cuando se convierte metabólicamente a un electrófilo reactivo, los iones nitrenium arilo, que se une posteriormente al ADN e inducen lesiones. Aunque varios estudios han informado de la formación de aductos de 4-ABP-ADN, no extenso trabajo se ha hecho para investigar la inmunogenicidad de ADN modificado-4-ABP y su posible implicación en la generación de anticuerpos en pacientes con cáncer de vejiga.
Metodología /Principales conclusiones
el ADN humano fue modificado por la N-hidroxi-4-acetylaminobiphenyl (
N-OH-
AABP), un metabolito reactivo de 4-ABP. perturbaciones estructurales en el
N
-OH-AABP ADN modificado se evaluó por ultravioleta, la fluorescencia, y la espectroscopia dicroico circular, así como por electroforesis en gel de agarosa. La genotoxicidad de los
N-OH-
AABP ADN modificado fue comprobada por ensayo cometa. cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) el análisis de muestras de ADN nativos y modificados confirmó la formación de
N CD - (desoxiguanosina-8-il) -4-amino-bifenilo (DG-C8-4ABP) en el
N
-OH-AABP daña el ADN. Los anticuerpos inducidos experimentalmente contra
N
-OH-AABP-ADN modificado mostró mucho mejor reconocimiento de la DNA aislado a partir de pacientes con cáncer de vejiga en comparación con el ADN obtenido de individuos sanos en competitivo ELISA de unión.
Conclusiones /Importancia
Este trabajo muestra el intercambio de epítopo entre el ADN aislado de pacientes con cáncer de vejiga y el
N
ADN modificado-OH-AABP que implican el papel de la 4-ABP metabolitos en el ADN daños y antigénica neo-epítopo generación que podría conducir a la inducción de anticuerpos en pacientes con cáncer de vejiga
Visto:. Shahab T, Moinuddin, Ahmad S, K Dixit, Habib S, Alam K, et al. (2013) genotóxico Efecto de
N
hidroxi 4 Acetylaminobiphenyl en el ADN humano: implicaciones en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (1): e53205. doi: 10.1371 /journal.pone.0053205
Editor: Rizwan Hasan Khan, Aligarh Muslim University, India
Recibido: 31 de julio de 2012; Aceptado: November 26, 2012; Publicado: 31 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Shahab et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado en parte por el ICMR subvención no. Inmuno 18/11/18/2008-ECD-I (que ahora está completado) y los fondos de la Universidad (Aligarh Muslim University). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El ADN de las células expuestas a un carcinógeno químico casi siempre contiene un conjunto de estructuralmente diversos aductos carcinógeno-nucleótidos [1]. Se sospecha que replicación erróneas o misrepair de un subconjunto de estos aductos da lugar a mutaciones, que a su vez pueden ser los precursores genéticos del fenotipo de cáncer. Uno de estos es carcinógeno 4-aminobifenilo, una amina aromática. Estos son capaces de inducir una variedad de efectos tóxicos, incluyendo cáncer y met-hemoglobinemia [2]. 4-ABP es un contaminante ambiental y ocupacional generada principalmente por el humo del cigarrillo, la combustión de combustibles fósiles y de las industrias de caucho, carbón, textiles y de impresión [3] - [5]. 4-ABP se ha demostrado que es un agente etiológico importante de cáncer de vejiga humano, y también un carcinógeno potente vejiga urinaria en animales de experimentación [6], [7]. residuos de 4-ABP se han reportado en la hemoglobina y en el ADN aislado de la vejiga de los fumadores [8], [9]; potencialmente implicando 4-ABP en la etiología del cáncer de vejiga. La estructura química de 4-ABP y su metabolito fisiológico,
N-OH-
AABP, se coloca como la figura 1A
electroforesis en gel de agarosa de nativos y
N
. - OH-AABP ADN humano modificado [b]. muestras de ADN de los carriles 2-5 se trataron con una concentración creciente de
N-OH-
AABP. Carril 1: ADN humano nativo; Carril 2: ADN humano nativo con 0,378 mM
N-OH-
AABP; Carril 3: ADN humano nativo con 0.757 mm
N-OH-
AABP; Carril 4: ADN humano nativo con 1.136 mm
N-OH-
AABP; Carril 5: ADN humano nativo con 1.515 mm
N-OH-
AABP
Los efectos genotóxicos y carcinogénicos cuando se exhiben 4-ABP se convierte metabólicamente a un electrófilo reactivo.. El primer paso es
N-oxidación de
arilaminas y arylacetamides por el citocromo específica
P
450 (CYP1A2) en los tejidos hepáticos [10], seguido por conjugación de la
N
función hidroxilo con acetato, sulfato, o glucuronato [11] - [14]. Los derivados electrófilos activados de 4-ABP ejercen su efecto genotóxico mediante la interacción con la formación de aductos de ADN que se han reportado para un papel en la carcinogénesis de la vejiga tanto en animales de experimentación [15] - [17] y los seres humanos [18], [19]. aductos de ADN también se han notificado tras la exposición de las células de la vejiga humanos a
N
-OH-ABP,
N-OH-
AABP y
N-OAc
AABP [20 ] - [22]. Sin embargo, el principal producto de adición (80%) de ADN formado ha sido identificado como
N
- (Desoxiguanosina-8-il) -4-aminobifenilo (dG-C8-ABP) [19]. A pesar de que las principales lesiones del ADN son un resultado de la formación covalente aducto, estos metabolitos también causan daño oxidativo del ADN producir especies reactivas de oxígeno [23] que en última instancia generar roturas de la cadena de ADN y modificaciones de base, tales como 8-oxo-guanina y productos afines [24] , [25].
El modo de acción de diversos agentes carcinógenos está mejor establecido mediante el análisis de su genotoxicidad [26]. El presente estudio informa de los cambios estructurales en el ADN humano tras la incubación con
N-OH-
AABP durante 24 h. El ADN modificado se caracterizó mediante varias técnicas espectroscópicas, electroforesis en gel y los estudios de desnaturalización térmica. La genotoxicidad de los
N-OH-
AABP se determinó a través de ensayo cometa. Los anticuerpos contra
N
-OH-AABP-DNA fueron inducidos en conejos hembra y se utiliza como una sonda de inmunoquímica para detectar las lesiones, provocadas por metabolitos 4-ABP, en el ADN de pacientes con cáncer de vejiga.
Ética Sentencia-
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal Institucional de JN Colegio Médico, UMA, Aligarh, India (permitir no. 401 /CPCSEA). Las muestras de sangre de pacientes e individuos sanos fueron recogidos tras el consentimiento informado verbal.
Materiales y Métodos
N-OH-
AABP era de Midwest Research Institute de Kansas. El ADN humano de placenta, metilado albúmina de suero bovino (MBSA), bromuro de etidio, Proteína A-agarosa (2,5 ml pre-columna de relleno), anti-conejo conjugados de fosfatasa IgG alcalino, fosfato de p-nitrofenilo, Tween-20, de Freund amp completa y; adyuvantes incompletos, Histopaque 1077, bajo punto de fusión de agarosa (LMPA), RPMI 1640, Triton X-100, azul tripán, y tampón fosfato salino (PBS) Ca
2 + y Mg
2 + fueron de Sigma Chemical Company , ESTADOS UNIDOS. Las placas de ELISA de microtitulación de fondo plano de poliestireno eran de Nunc (Dinamarca). Todos los demás productos químicos y reactivos utilizados fueron de grado analítico más alto.
Modificación de ADN de placenta humana
ADN de placenta humana (15 mM) se modificó mediante la incubación a 37 ° C durante 24 h con concentraciones variables (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM y 1,515 mM) de
N-OH-
AABP en DMSO. componentes no unidos se eliminaron mediante diálisis extensiva frente a tampón de fosfato de sodio (10 mM, pH 7,4) que contiene NaCl 150 mM.
gel de agarosa La electroforesis
se observó el cambio en el patrón electroforético de ADN nativo y modificado en 1% de agarosa en 30 mA durante 2 h en tampón TAE (40 mM Tris-acetato, EDTA 2 mM, pH 8,0). Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV.
El aislamiento de linfocitos
muestras de sangre heparinizada (2 ml) de donantes sanos y pacientes se diluyeron adecuadamente en Ca
2 + y Mg
2 + libre de PBS. Los linfocitos se aislaron a partir de sangre usando Histopaque 1077 y las células fueron finalmente suspendidas en RPMI 1640.
Análisis de Viabilidad de los linfocitos
Los linfocitos se comprobaron por su viabilidad antes del inicio y después del final de la reacción usando azul tripán exclusión de prueba [27]. Se encontró que la viabilidad de las células a ser mayor que 93%.
Tratamiento de linfocitos
Los linfocitos (1 × 10
5 células) fueron expuestas a diferentes concentraciones de N-OH-AABP (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM, 1,515 mM) en un volumen de reacción total de 1 ml y se incubaron a 37 ° C durante 90 min. Después de la incubación, la mezcla se centrifugó a 4000 rpm, el sobrenadante descartan y los linfocitos sedimentadas se resuspendieron en 100 l de PBS (Ca
2 + y Mg
2 + libre) y procesarse adicionalmente para el ensayo de cometa.
Comet Assay
ensayo cometa se realizó de acuerdo con el protocolo dado en una publicación anterior de nuestro laboratorio [28].
análisis físico-químicos
el análisis de fluorescencia era llevado a cabo en Shimadzu (-5301-PC RF) spectrofluorophotometer. Las muestras se excitaron a 325 nm y el perfil de emisión se registró en el rango de 500 a 700 nm. dicroísmo circular (CD) mediciones de la nativa y el ADN humano modificado se registraron en Jasco J-815 espectropolarímetro en el rango de longitud de onda de 220-400 nm. Todas las exploraciones se registraron en un intervalo de 1 nm.
Cromatografía Líquida de Alta
análisis
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de ADN nativo y modificado fue realizado en el sistema de flujo biológica Duo, BioRad , (EE.UU.) equipado con detector de múltiples longitudes de onda UV-Visible. La absorbancia se monitorizó a 245 nm. Brevemente muestra de ADN 50 M se hidroliza en HCl 0,1 N (1 ml /mg de ADN) a 100 ° C durante 30 min (con el fin de liberar las bases) y se secó bajo vacío. Las bases se disolvieron en 50 l de tampón de 0,1 M Tris HCl, pH 8,5 y se filtraron a través de 0,42 M Milex, filtro syring desechable antes de cargar en la columna C-18 de fase inversa (Supelco, Descubrimiento 25 cm x 4,6 mm). El tampón eluyente fue ácido cítrico 12,5 mM, acetato de sodio 25 mM, 25 mM etilendiaminotetraacetato (EDTA), pH 5,2 y una velocidad de flujo de 1 ml /min se mantuvo durante todo.
Calendario de vacunación
aleatorios criados, New Zealand White (NZW) conejos hembra se inmunizaron como se describe anteriormente [28], [29]. Brevemente, conejos (n = 4; dos de cada uno para el ADN nativo y modificado) se inmunizaron por vía intramuscular en múltiples sitios con 50 g de los antígenos respectivos complejos con BSA metilada en la relación de 1:01 (w /w) y emulsionado con un volumen igual de adyuvante de Freund adyuvante.
purificación de anticuerpos
inmunoglobulina G (IgG) fue purificado por afinidad a partir de preinmunes y los sueros inmunes en una columna de agarosa-una proteína [30]. La homogeneidad de la IgG aislada se determinó en un 7,5% de SDS-PAGE.
El aislamiento de ADN a partir de sangre humana
Las muestras de sangre se recogieron en viales de EDTA de diferentes pacientes con cáncer de vejiga y de los individuos sanos normales. ADN de linfocitos se aisló como por las instrucciones del fabricante. Se añadieron 5 ml de sangre a 500 l de Qiagen proteasa y luego tampón AL (6 ml) se mezcló, seguido de agitación vigorosa. La mezcla se incubó a 70 ° C durante 10 min y 5 ml de etanol (98%) se añadió a la muestra y se mezclaron invirtiendo el tubo y agitación vigorosa. La solución se transfirió cuidadosamente a la columna QIAamp Maxi colocado en un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifugó a 1.850 xg (3.000 rpm) durante 3 min. El filtrado se desechó y se añadió 5 ml de tampón AW2 y de nuevo se centrifuga a 4500 × g (5000 rpm) durante 1 min. De nuevo se añadieron 5 ml de tampón AW2 y se centrifugaron a 4500 x g (5000 rpm) durante 15 min y se descartó el filtrado. A continuación, 600 l de tampón AE se vertió directamente en la membrana de la columna que se incubó después durante 5 min, y se centrifugaron a 4500 x g (5000 rpm) durante 2 min. El eluyente se vuelve a cargar en la membrana de la columna, se incubaron durante 5 min, y se centrifuga a 4500 × g (5000 rpm) durante 5 min. El eluyente que contiene el ADN se secó al aire y se disolvió en PBS, pH 7,4. La pureza y la concentración de la preparación de ADN se determinó mediante un
260 y A
280 mediciones.
ELISA
La unión específica de los anticuerpos se comprobó en un ensayo de unión competitiva [31]. El porcentaje de inhibición se calculó con la fórmula dada:.
El porcentaje de inhibición = 1- (A
inhibido /A
desinhibida) × 100
Resultados y Discusión
el patrón de gel (Figura 1B) muestra un aumento en la movilidad de ADN modificado con el aumento de concentración de
N
-OH-AABP (carriles 2-5). La movilidad máxima se observó con 1.515 mm
N-OH-
AABP; y cualquier aumento en su concentración como resultado la pérdida completa de la estructura del ADN. El aumento de la movilidad de la N-OH-AABP ADN tratado puede ser debido a la generación de roturas de cadena individuales, que puede resultar en la formación de ADN de tamaño pequeño de haber movilidad más rápida en comparación con el ADN nativo de carril 1. Una pérdida de la fluorescencia de ADN también se observó como una función del aumento de la concentración de
N
-OH-AABP. De nuevo, esto apunta hacia el daño a la estructura helicoidal del ADN.
La electroforesis en gel de una sola célula (SCGE) o ensayo cometa es un método muy sensible para la evaluación de daños en el ADN. Durante la electroforesis, el ADN dañado migra desde el núcleo hacia el ánodo, formando una forma de "cometa" con una cabeza (núcleo de la célula con el ADN intacto) y una cola (ADN relajado y rota). Por lo tanto, el ensayo de cometa se puede utilizar para poner a prueba la genotoxicidad de agentes cancerígenos en células cultivadas incluyendo linfocitos humanos recién aislados. En este estudio hemos utilizado el cometa-ensayo para analizar el daño al ADN de linfocitos humanos tras el tratamiento
N-OH-
AABP. Las imágenes del cometa, tras el tratamiento de los linfocitos con diferentes concentraciones de
N-OH-
AABP, se presentan en la Figura 2. Un cometa con una cola es indicativo de rotura del ADN en la electroforesis en gel de células individuales. Nuestros resultados establecen claramente el daño del ADN después del tratamiento con 1,515 mM
N
-OH-AABP, como se desprende de la formación de la cola distinta de la cabeza difusa (Figura 2E). Hemos observado que con concentraciones crecientes de
N
-OH-AABP, el porcentaje de ADN en la cola también aumentó. A una concentración 0,378 mM de
N-OH-
AABP, el 19% del ADN se encontró en la cola. Sin embargo, a 0,757 mM y 1,136 mM de
N
-OH-AABP el porcentaje de ADN de la cola aumentó a 27% y 58%, respectivamente. Se siguió aumentando hasta 89% a los 1.515 mm
N-OH-
AABP. Los parámetros de daño en el DNA, es decir, momento de la cola de oliva (OTM) y la longitud de la cola también fueron medidos y encontraron que aumentar de forma significativa con 1.515 mm
N-OH-
AABP en comparación con 0,378 mM, 0,757 mM y 1,136 mM
N-OH-
AABP. Se observó un marcado aumento de la OTM (94%) en los linfocitos tratados con 1,515 mM
N
-OH-AABP en comparación con el control (linfocitos no tratados). Además, un aumento sustancial de la longitud de la cola también se registró. Se encontró que 72% por encima de la del control de linfocitos sin tratar. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Todos los linfocitos fueron tratados durante 24 horas a 37 ° C.
En una publicación anterior, se observó un 62% en hipercromicidad 260 nm en el espectro de absorción UV de
N
-OH-AABP modificado ADN humano [32]. El hipercromicidad observada corresponde a la exposición de grupos cromóforos como resultado de la generación de roturas de la cadena y disociación de enlaces de hidrógeno en el caso de ADN modificado.
Ni ADN nativo ni su forma modificada tiene su propia fluorescencia y por lo tanto un fluoróforo extrínseco , bromuro de etidio, se utilizó para la espectroscopia de fluorescencia de ADN y su
N
forma modificada-OH-AABP. Nativo y
N
-OH-AABP ADN modificado se incubaron con bromuro de etidio durante 30 min y el perfil de emisión se registró usando la longitud de onda de excitación (325 nm) de bromuro de etidio (Figura 3A). Una disminución de 43,17% en la intensidad de fluorescencia del ADN modificado, en comparación con su forma nativa, significa perturbaciones en el ADN estructura de doble hélice como resultado de
N
-OH-AABP modificación.
Los espectros de emisión de fluorescencia de DNA humano nativo (---) y el ADN humano modificado con 1,515 mM
N
-OH-AABP (-) [a]. Los espectros dicroico circular de ADN humano nativo (-) y
N-OH-
AABP modificó el ADN humano (----) [b]
Los cambios en la estructura del ADN eran. evaluada por mediciones de elipticidad. La
N
-OH-AABP ADN modificado exhibe un cambio de 5 nm (275-280 nm) en la señal de CD junto con un aumento de la elipticidad 5,57-9,27 MDEG (Figura 3B), lo que indica cambios estructurales en la molécula de ADN. El aumento de la elipticidad corresponde a la pérdida de 39,9% en la estructura del ADN tras la modificación. Esta pérdida estructural puede ser debido a desapilado de bases del ADN como resultado de la desestabilización de la hélice. Las perturbaciones estructurales sugieren despliegue de ADN, puede ser debido a la generación de roturas de cadena individuales.
Figura 4A y 4B muestran cromatogramas de HPLC representativo de muestras de ácido hidrolizado de nativos y
N
-OH- AABP modificado ADN humano respectivamente. No se observaron picos bien definidos en el tiempo de retención 4,467 min, 7.332 min y 8.727 min en el ADN humano nativo. Sin embargo, en el caso de ADN modificado estos picos cambiaron a 4,631 min, 7.443 min y 9,164 min, respectivamente, lo que sugiere la modificación de las bases de ADN. El pico extra en un tiempo de retención de 22,029 min en el hidrolizado ácido de ADN modificado es característico de dG-C8-4-ABP aducto, un marcador conocido para el ADN dañado por 4-ABP y
N
-OH- AABP [33]. La identificación de dG-C8-4-ABP aducto está de acuerdo con los informes publicados sobre aductos de ADN con arilaminas en animales de experimentación [15] - [17]. Aductos de ADN similares han sido reportados en las muestras de biopsia de vejiga de la orina humana [18], [19].
Representante cromatograma HPLC del hidrolizado ácido de
N-OH-
AABP modificó el ADN humano [b].
Las conejas inmunizados con
N-OH-
AABP modificó el ADN humano mostró vigorosa respuesta humoral obtención de anticuerpos específicos de alta inmunógeno título. Los anticuerpos inducidos experimentalmente fueron utilizados como una sonda de inmunoquímica detectar los
N
-OH-AABP o arilaminas relacionados inducida por lesiones en el ADN genómico de los pacientes con cáncer de vejiga. El patrón de unión del ADN aislado de pacientes con cáncer de vejiga fue muy revelador en el ensayo de inhibición competitiva. La inhibición de la anti-
N
-OH-AABP ADN-IgG por el ADN de los linfocitos de pacientes con cáncer de vejiga se registró en el intervalo de 60,5% a 77,6%. Mientras que, la inhibición causada por el ADN de linfocitos de individuos sanos normales era bastante bajo (Tabla 2). Significativamente alto reconocimiento del ADN de linfocitos de pacientes con cáncer de vejiga por los anticuerpos inducidos experimentalmente contra
N
es un claro indicador de compartir epítopo entre el ADN genómico de los pacientes con cáncer de vejiga y el ADN humano modificado ADN modificado -OH-AABP
in vitro fotos: por
N-OH-
AABP. Esto lleva a la conclusión de que
N-OH-
AABP, o una arilamina relacionado, genera neo-epítopos en la molécula de ADN que son reconocidas como "
extranjero de búsqueda: 'o
no auto
por el sistema inmune que resulta en la generación de autoanticuerpos en pacientes con cáncer de vejiga. Significativamente alto nivel de reconocimiento del ADN genómico de pacientes con cáncer de vejiga por los anticuerpos inducidos experimentalmente contra
N
-OH-AABP modificado ADN humano es una evidencia hacia la participación de bases modificadas y las regiones individuales del filamento en la patogénesis de la enfermedad .
Reconocimientos
los autores agradecen el apoyo Infraestructura de instalaciones DST-PUÑO del Departamento.