Extracto
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y los receptores de c-MET se han expresado en muchas no cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) células. agente único actual focalización terapéutica de un EGFR mutante tiene una alta eficacia en la clínica, pero no es curativa. A continuación, se determinó la combinación de la orientación de EGFR y c-MET vías en las células NSCLC resistentes a los inhibidores del receptor tirosina quinasa (TKIs), ARN de interferencia y la inhibición por ITC. Las diferentes líneas celulares de cáncer con diferentes características genómicas (H358, H1650 y H1975) se transfectaron con EGFR-específicos de siRNA, T790M-específicos de siRNA, c-MET siRNA o la combinación. Posteriormente ITC del EGFR (gefitinib, erlotinib o afatinib) o monoclonal cetuximab anticuerpo se combinaron, respectivamente, con el su11274 TKI c-MET-específico en líneas celulares de cáncer. La proliferación celular, la viabilidad, la caspasa-3/7 actividad y morfología apoptótica se controlaron mediante espectrofotometría, fluorimetría y microscopía de fluorescencia. El efecto combinado de EGFR TKIs, o cetuximab y su11274, se evaluó utilizando un índice de combinación. Los resultados mostraron que las líneas celulares que eran relativamente resistentes a EGFR TKIs, especialmente la línea celular H1975 que contiene la resistencia T790M mutación, se encontró que eran más sensibles a-EGFR específicos de siRNA. La combinación de EGFR siRNA más c-MET siRNA mejorada inhibición del crecimiento celular, la inducción de la apoptosis y la inhibición de la señalización corriente abajo en H358 resistente EGFR TKI, H1650 y H1975 células, a pesar de la ausencia de actividad de la c-MET siRNA solo. ITC EGFR o cetuximab más su11274 también fueron consistentemente superior a cualquiera de los agentes por separado. Se observó el efecto biológico más fuerte cuando afatinib, un irreversible pan-HER bloqueador se combinó con su11274, que consigue un efecto sinérgico en las células H1975 mutantes T790M. En conclusión, nuestros resultados ofrecen una prueba preclínica de principio para la inhibición combinada como estrategia de tratamiento prometedor para el NSCLC, especialmente para pacientes en los que los tratamientos actuales EGFR fallan debido a la presencia de la T790M-EGFR mutación o una expresión de alto c-MET .
Visto: Chen G, Noor a, Kronenberger P, E Teugels, Umelo IA, de Huelga J (2013) Efecto sinérgico de Afatinib con Su11274 en células no pequeñas células cancerosas de pulmón resistentes a gefitinib o erlotinib. PLoS ONE 8 (3): e59708. doi: 10.1371 /journal.pone.0059708
Editor: Ramón Andrade de Mello, de la Universidad de Oporto, Portugal
Recibido: 7 de Diciembre, 2012; Aceptado: February 17, 2013; Publicado: 18 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El proyecto fue financiado por la National cáncer de Bélgica plan (Grant NKP-29-011), la Stichting tegen Kanker, Bélgica. Este estudio fue apoyado en parte por el fondo de investigación de Boehringer Ingelheim GmbH. Chen Gang fue apoyada por el Consejo de Becas de China (CSC). Chen Gang y Ijeoma Adaku Umelo fueron apoyados por la beca de doctorado Vrije Universiteit Brussel (VUB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: Este estudio fue apoyado en parte por el fondo de investigación de Boehringer Ingelheim GmbH. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores
Introducción
En algunos no -. Cáncer de pulmón microcítico (NSCLC) de los pacientes, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, también conocido como ErbB1 o HER1), contiene mutaciones "sensibilizante" que aumentan la eficacia de los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR-específica (TKIs) [1], [2]. Dos principales estrategias anti-EGFR se encuentran actualmente en aplicación clínica: TKIs de bajo peso molecular que compiten con ATP por la unión a la parte de la tirosina quinasa de un receptor EGFR mutante, y anticuerpos monoclonales (mAbs) que se dirigen en el extracelular de unión a ligando dominio, evitando de ese modo la unión del ligando, y en consecuencia receptoras de dimerización, y la señalización del receptor. Estas dos clases de agentes han mostrado actividad preclínica y clínica sólida en una variedad de tipos de tumores [3].
Entre el receptor TKIs, erlotinib (Tarceva, Genentech, Inc, South San Francisco, CA, y OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY) mejora la supervivencia en pacientes con CPNM avanzado que progresaron después de uno o dos regímenes de quimioterapia previos [4], [5], [6], [7]. Tanto gefitinib y erlotinib son superiores a la quimioterapia en el tratamiento de primera línea de adenocarcinoma de pulmón en el que el receptor EGFR alberga las mutaciones en el exón sensibilizantes 19/21 [8], [9], [10]. La experiencia clínica agregada hoy indica que sólo los pacientes cuyos tumores contienen una mutación sensibilizante, obtienen un beneficio clínico significativo del ITC del EGFR. De hecho, los estudios aleatorizados indican que en pacientes no seleccionados para tales mutaciones, estos fármacos podrían tener un efecto adverso en el resultado [10], [11].
La eficacia de los inhibidores se limita en el tiempo debido a la aparición de células con los mecanismos de resistencia, en casi la mitad de los casos una sustitución de treonina a metionina en el EGFR en la posición de aminoácido 790 (T790M). Afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), es un inhibidor irreversible de EGFR, quinasas HER2 y HER4 y retiene algo de actividad en tumores con mutaciones T790M, pero a dosis que son un registro más alto que lo que se necesita para los cánceres que albergan mutaciones sensibilizantes [ ,,,0],12], [13], [14], [15], [16], [17].
El anticuerpo cetuximab monoclonal IgG1 quimérico EGFR (Erbitux, de ImClone Systems Incorporated, Nueva York, Nueva York, y Bristol -Myers Squibb Company, Princeton, NJ) bloquea la interacción ligando-receptor y por lo tanto regula por disminución la señalización de EGFR, lo que resulta en la inhibición de la proliferación celular y la angiogénesis, y la inducción de apoptosis [3]. Cetuximab en combinación con la quimioterapia, ha sido aprobado por la FDA y la EMEA para el tratamiento de cáncer metastático colorrectal (CCR) y en combinación con radioterapia para el tratamiento de la cabeza localmente avanzado y cáncer de cuello (CCC) [18], [19]. Cetuximab ha demostrado una actividad modesta como agente único como en combinación con docetaxel en pacientes con avanzado, quimioterapia refractario NSCLC [20]. Una multinacional, multicéntrico, abierto, de fase III de ensayos ha demostrado que la adición de cetuximab a la quimioterapia basada en platino mejorado los resultados para los pacientes con NSCLC avanzado [21]. El beneficio general, sin embargo, es limitado, por lo que no hay consenso sobre la relevancia para la aplicación clínica.
ARN de interferencia (RNAi), mediante la interferencia de ARN corto (siRNAs) o ARN corto horquilla (shRNAs), tiene proporcionado una herramienta poderosa para modular la expresión génica para el estudio de la función génica. El ARNi es actualmente también está bajo consideración como herramienta terapéutica, en el laboratorio y la clínica [22], [23], [24]. Varios informes describen los efectos de RNAi EGFR para inhibir el crecimiento celular [25], [26], [27], [28], [29], sin embargo, los intentos de derribar el alelo que contiene T790M-(utilizando lentiviral shRNA construye) eran sin éxito [26].
adquirido resistencia a los ITC también se puede desarrollar a través de un "interruptor de quinasa", con la amplificación de c-MET y la sobre-expresión [30], [31]. La amplificación de c-MET, un receptor transmembrana tirosina quinasa, ya se puede producir antes de que el tratamiento con inhibidores de TK en NSCLC [32], [33], [34], [35], y c-MET se expresa en el 60% de los tumores de NSCLC tal como se mide mediante técnicas de inmunohistoquímica [34]. Los altos niveles de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el ligando de c-MET, producidos por las células del estroma [36], también se han correlacionado con mal pronóstico de pacientes con NSCLC [37]. c-MET amplificación y regulación se identificaron en algunos pacientes con resistencia adquirida a gefitinib /erlotinib [30], [31]. Además, c-MET puede ser activado por mutaciones así como [38]. Por lo tanto, la inhibición de c-MET podría convertirse en una estrategia terapéutica valiosa para estos pacientes
.
En el presente estudio hemos investigado en primer lugar los efectos combinados de los siRNA-EGFR específico con c-MET siRNA en diferentes líneas celulares de cáncer con distinta genómico características. También se investigó la combinación de ITC del EGFR (gefitinib, erlotinib o afatinib) o el anticuerpo cetuximab EGFR monoclonal, con el su11274 inhibidor de c-MET en el mismo conjunto de líneas celulares de cáncer de pulmón.
Métodos
siRNAs
Con anterioridad, ocho siRNAs dirigidos EGFR tipo salvaje y secuencias NCBI T790M (Referencia de secuencia: NM_005228.3) fueron diseñados utilizando algoritmos de Invitrogen, Eurogentec, Dharmacon, Maurice HO diseño racional siRNA (http: //ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html), Reynolds [39], Ui-Tei [40] y Jagla [41]. La capacidad de estos siRNAs candidatos para derribar EGFR o EGFR T790M-mutante en el ARNm, y su capacidad para suprimir la proliferación celular se ensayó [42]. Se seleccionaron los siRNAs más eficaces para los experimentos en el presente estudio (Tabla 1). c-MET siRNAs (NCBI secuencia de referencia: NM_001127500.1) fueron adquiridos como "en SmartPool objetivo" (Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, Inglaterra) y las secuencias de siRNA se resumen en la Tabla 1. Los siRNAs revueltos fueron generados por www.sirnawizard. com y verificado por una búsqueda BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). El gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de control positivo siRNA de Invitrogen (ref. SKU#12935-140 cautela RNAi GAPDH control positivo, Merelbeke, Bélgica) se utilizó como una prueba principal de la eficacia de la transfección de ARNsi. Un control TOX transfección y los indicadores de transfección Siglo verdes se realizaron como controles positivos para la eficacia de transfección (ref D-001630-01-02;. D-001500-01-05, Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, Inglaterra). El ARNsi de control negativo fue una secuencia exclusiva que no se corresponde con cualquier gen eucariota (O-0030-neg 05, S.A. Eurogentec, Lieja, Bélgica). Los dúplex de siRNA se transfectaron transitoriamente utilizando lipofectamina
TM 2000 (Cat. No. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Bélgica) medio en medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% sin antibióticos, como se describe anteriormente [43], [44 ], [45]. Cada experimento se llevó a cabo al menos por triplicado y tres veces independientemente.
Líneas celulares y reactivos
El NSCLC humano líneas celulares H292 (CRL-1848 ™, el carcinoma mucoepidermoide pulmonar), H358 (CRL-5807 ™, carcinoma broncoalveolar), HCC827 (CRL-2868 ™, adenocarcinoma), H1650 (CRL-5883 ™, adenocarcinoma; carcinoma broncoalveolar) y H1975 (CRL-5908 ™, adenocarcinoma) se obtuvieron de la American Type Culture Americana Collection (ATCC, Países Bajos). La línea celular H292 se informó como EGFR y K-Ras línea de células de tipo salvaje [46], [47], [48], [49], que nos confirmó utilizando en tiempo real de RT-qPCR y análisis de secuenciación (datos no mostrados ). H358 es de tipo salvaje EGFR, tiene un codón 12 de K-Ras mutación [50], y una deleción homocigótica del gen de p53 [51]. H1650 y HCC827 tienen una mutación de deleción en marco en el dominio tirosina quinasa de EGFR (supresión E746-A750, el exón 19). células H1650 también tienen una deleción COOH-terminal de PTEN y la pérdida de la proteína PTEN [52] y expresan el receptor de insulina como factor de crecimiento (IGF1R) [53]. La línea celular H1975 tiene un dominio mutación sensibilizante L858R quinasa en el exón 21, y un segundo T790M en el exón 20,
en cis
, en el dominio de quinasa del EGFR, lo que hace que sean resistentes a la gefitinib y erlotinib TKIs reversible [54 ]. Además, todas estas cinco líneas de células expresan el receptor c-MET sin amplificación de genes [28], [30], [53], [55], [56]. Las cinco líneas de células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corp., Gent, Bélgica), suplementado con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (Perbio Science NV, Erembodegem, Bélgica), 2 mM L-glutamina y piruvato de sodio 1 mM a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO
2. las poblaciones de diez milímetros de las ITC gefitinib-EGFR específica (AstraZeneca, Cheshire, Reino Unido), erlotinib (AstraZeneca, Cheshire, Reino Unido), el pan-HER irreversible Afatinib inhibidor (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) y un inhibidor de c-MET , su11274 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Bélgica) se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenó a -80 ° C. Estos fármacos se diluyeron en RPMI fresco 1640 con una concentración final de DMSO menos del 0,1% en todos los experimentos. El cetuximab anticuerpo monoclonal específico-EGFR (2 mg /ml) se adquirió de Merck KgaA, Darmstadt, Alemania.
RT-qPCR
aislamiento de ARN, ARN de la normalización, la transcripción inversa y qPCR eran tan descrito anteriormente [43], [44], [45].
análisis de transferencia Western
Después de ser tratado con siRNAs o diferentes agentes durante los períodos indicados, las células se lavaron con PBS y se lisaron en un tampón que contiene Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCl 150 mM (pH 6,85), EDTA 1 mM (pH 8), TRITON-X 1%, Na-pirofosfato 2,5 mM, ortovanadato de sodio (Na3VO4) 1 mM, leupeptina 1 mg /ml, cócteles de inhibidores de proteasa 1% y cócteles de inhibidores de fosfatasa 1% (Sigma-Aldrich NV /SA, Bornem, Bélgica). Los lisados se centrifugaron a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C y se hirvieron durante 5 min. La concentración de proteína del lisado se detecta mediante el ensayo de proteínas Bio-Rad Bradford (Nazaret Eke, Bélgica) y 25 g de proteína desnaturalizada se sometió a SDS-PAGE (gel 10% SDS-acrilamida) con un tampón de carga que contiene Tris 80 mM -HCl (pH 6,8), 5% SDS, 10% de glicerol, EDTA 5 mM (pH 8), 5% de 2-mercaptoetanol, 0,2% Bromophenolblue y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de PVDF (BioRad) durante 2 horas a 100 mA. La membrana se incubó con los siguientes anticuerpos primarios como se indica: EGFR (Señalización Celular), fosfo-EGFR (Tyr1173, clon 9H2, Upstate), c-MET (L41G3, Señalización Celular), fosfo-c-MET (Tyr1234 /1235, 3D7, Señalización celular), fosfo-AKT /PKB (pS473, Invitrogen), fosfato ERK1 /2 (pTpY185 /187, Invitrogen), fosfo-STAT3 (Tyr705, 3E2, Señalización celular), fosfo-STAT5 (pY694, BD Biosciences ) y β-actina (Sigma-Aldrich NV). Un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (dilución 1:4000, ECL anti-ratón o anti-conejo IgG HRP vinculados, Na 931, /Amersham, GE Healthcare Bio-ciencias Diegem, Bélgica) se añadió, y las membranas se sometieron a detección de quimioluminiscencia (reactivos de detección ECL Plus Western Blot, GE Healthcare Bio-ciencias /Amersham, Diegem, Bélgica).
proliferación
el crecimiento celular se evaluó mediante un ensayo colorimétrico de tetrazolio (MTS sustrato, CellTiter96 acuosa Uno Cell solución Ensayo de proliferación G3580, Promega, Madison, EE.UU.). El protocolo fue el siguiente: diferentes agentes y combinaciones se añadieron a placas de 96 pocillos con concentraciones crecientes, y se incubaron a 37 ° C durante hasta 96 h (experimentos de combinación de hasta 72 h). Después de la adición de 20 l de reactivo MTS a cada pocillo, las placas se incubaron durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora, y la absorbancia a 490 nm se registró usando un lector de microplaca de 96 pocillos (Scientific Multiskan MK3, Thermo Finlandia). Los resultados fueron la media de seis pozos y se expresaron como la relación de la absorbancia dividido por la absorbancia del control mock × 100.
Viabilidad
La viabilidad celular se ensayó por detección fluorimétrica de resorufina (CellTiter Cell-Azul Viabilidad de ensayo, G8080, Promega, Madison, EE.UU.). El procedimiento fue según el fabricante. Los tratamientos y los controles fueron como se mencionó anteriormente. Fluorimetría (ex: 560 nm /em: 590 nm) estaba usando un lector de placas de fluorescencia FL600 (Bio-Tek, EE.UU.). Todos los ensayos se realizaron por triplicado y cada vez se utilizaron seis pocillos individuales. Los datos de fluorescencia se expresan como la fluorescencia de las muestras tratadas dividido por fluorescencia del control mock × 100.
caspasa-3/7 actividad de detección
se midió la actividad de la caspasa-3/7 usando un sintética rodamina marcado sustrato de caspasa 3/7 (Apo-ONE® homogénea caspasa 3/7 Ensayo, G7790, Promega, Madison, EE.UU.) inmediatamente después de la detección fluorimétrica de la viabilidad celular en los mismos pozos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 60 min, se midió la fluorescencia de cada pocillo (ex: 499 nm /em: 512 nm), utilizando un lector de placas de fluorescencia FL600 (Bio-Tek, EE.UU.). Actividad de la caspasa-3/7 se expresa como la fluorescencia de la muestra tratada /control de mock × 100.
evaluación microscopía fluorescente de la apoptosis celular y la morfología
Los efectos de los diferentes tratamientos sobre la apoptosis y la morfología nuclear en las células fueron evaluados por Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Bélgica) y yoduro de propidio (PI, Sigma-Aldrich NV Bornem, Bélgica) doble tinción cromatina fluorescente. En resumen, después del tratamiento simple o doble de siRNAs o agentes, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se tiñeron 15 min con Hoechst (1 mg /ml) y yoduro de propidio (PI, mg /ml), y se observaron bajo un fluorescencia avanzada microscopio (Zeiss Axiovert 25, Zaventem, Bélgica). La apoptosis y la morfología nuclear fueron identificadas por la condensación de la cromatina nuclear y su fragmentación. Este sistema determina el número absoluto de células viables (Hoechst positivo /negativo PI), las primeras células apoptóticas (Hoechst positivo /PI negativa con fragmentaciones azules en las células), a finales de células apoptóticas (Hoechst positivo /PI positivo, con fragmentaciones de color rojo en las células ), las células necróticas (Hoechst negativo /positivo PI) y las señales de escombros. Las células viables y apoptóticas se contaron en 10 campos diferentes bajo la magnificación 200 x, y en cada pocillo a partir de tres experimentos independientes. Contando fue por dos personas y el resultado promedio se expresó en relación al control simulado. el número de células apoptóticas de diferentes tratamientos se compararon al ser normalizado a sus números de células viables.
El análisis estadístico
SPSS19.0 se utilizó para el análisis estadístico. Los resultados fueron representativos de tres experimentos independientes a menos que se indique lo contrario. Los valores se presentan como la media ± desviación estándar (SD). Una forma de análisis de la prueba de varianza (ANOVA) se utilizó para analizar la significación entre los grupos. El método de mínima diferencia significativa (LSD) de comparaciones múltiples con diferentes tratamientos y grupo de control se aplica cuando la probabilidad de ANOVA fue estadísticamente significativa. La significación estadística se determinó a un
P Hotel & lt; 0,05. El análisis de aditividad y sinergia fue evaluada por el programa Biosoft Calcusyn (Ferguson, MO, EE.UU.). El índice de combinación (IC) se utilizó para expresar sinergismo (CI & lt; 1), efecto aditivo (IC = 1), o el antagonismo (CI & gt; 1). [57]
Resultados
Efecto de tipo salvaje EGFR T790M y específicos de siRNAs en la expresión de destino y fenotipo maligno
el siRNA dirigidos a secuencias de tipo salvaje fue capaz de derribar la transcripción del EGFR, reducir el nivel de proteína EGFR, inhibir el crecimiento celular e inducir apoptosis de las células en todas las líneas celulares de NSCLC a prueba, sin embargo, con diferente magnitud independiente de las mutaciones del gen controlador específico (Figura 1). Del mismo modo, el T790M-específicos de siRNA podría derribar T790M ARNm, y también suprimir la proliferación celular y mejorar la actividad caspasa en células H1975 células que contienen la mutación T790M. Sin embargo, el efecto fue menos potente en comparación con el EGFR-específicos de siRNA (datos no presentados). Todos los siRNAs control negativo y revueltos no tuvieron efecto.
líneas celulares de cáncer de pulmón fueron tratados con-EGFR siRNA 1247. Las células vivas y células apoptóticas se detectaron con Hoechst 33342 y PI doble tinción fluorescente. El número de células apoptóticas se normalizó al número de células vivas en el mismo pocillo. Hoechst 33342 y PI doble tinción fluorescente × 200
Orientación dual de EGFR y c-MET con siRNAs
Las líneas celulares con diferentes mutaciones (KRAS: H358; PTEN:. H1650; T790M : H1975) que sean resistentes a la ITC del EGFR render se seleccionaron más de la doble orientación. La resistencia de las células H1975 hacia EGFR TKIs se ha atribuido a la presencia de la mutación T790M, sino también a la activación del receptor c-MET [30], [31]. La sinergia de la inhibición de c-MET con la inhibición del EGFR se ha demostrado en modelos que tienen una vía de c-MET activado o sobreexpresa [58]. En nuestro experimento hemos investigado la interacción de la inhibición de EGFR y la inhibición de c-MET en células, donde la activación de tales c-MET no está presente. Una piscina de c-MET siRNAs tenía poco o ningún efecto sobre el crecimiento celular (ensayo de MTS) en las líneas celulares H358 y H1650. En H1975 células, se observó una muy modesta reducción en la tasa de proliferación (a 87%, la Figura 2A). Hubo una falta similar de inducción de caspasa-3/7 para la inhibición único tratamiento de c-MET en todas las líneas celulares (Figura 2B). Aunque inmunotransferencia reveló que el receptor c-MET fue eliminado de manera efectiva hacia abajo, y se inhibió de que la fosforilación de c-MET, también en células H1975 (Figura 3), hubo poco efecto sobre la señalización aguas abajo (Akt, ERK y STAT vías). tratamiento de c-MET siRNA solos por lo tanto no tiene ningún efecto significativo en cualquiera de las líneas celulares de cáncer probadas
in vitro
Panel A:. La proliferación celular después de la transfección con diferentes siRNAs. Las líneas celulares H358 (blanco), H1650 (gris) y H1975 (negro) fueron transfectadas con EGFR-específicos de siRNA 1247, T790M siRNA, una piscina c-MET siRNA, o combinaciones de éstos, y la proliferación se analizó 72 h post la transfección usando un ensayo de MTS colorimétrico. Panel B: la caspasa-3/7 actividad. *
P Hotel & lt; 0,05 y **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación tanto con solo tratamiento
Panel A: El análisis por inmunotransferencia de H358 y H1650 células transfectadas. con el tipo salvaje EGFR siRNA, una piscina c-MET siRNA o una combinación de éstos. Panel B: análisis de inmunotransferencia de células H1975, como en el panel C. En este caso, también se incluyó la-T790M específicos de siRNA. Los anticuerpos incluyen fosforilada (p) EGFR, EGFR, PC-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, p-STAT5, p-STAT3, y β-actina.
La adición de EGFR siRNA (ya sea de tipo salvaje o T790M-específico) para la inhibición del crecimiento mejorado c-MET siRNAs en H358 y H1650 células en comparación con EGFR siRNA solo, pero mucho menos que en las células H1975 (Figura 2A). El tratamiento combinado también aumentó la actividad de caspasa-3/7. En H1650 células la señal de apoptosis incluso aumentó a 8,94 veces del control en comparación con solo EGFR siRNA (4,16 veces. En H1975 células, hubo un aumento más modesto de 3,29 veces, que es ligeramente más alto que EGFR siRNA solo (2,26 -fold). Western blotting, sin embargo, reveló que la combinación de EGFR /c-MET siRNA fue capaz de afectar a la vía de ERK también (además de AKT, la Figura 3), que está en contraste con la inhibición de EGFR solo. la vía de ERK downregulated fue la mayor cantidad en las células H1975, mientras que se observó la mayor reducción de p-AKT en las células H1650.
el efecto sobre la viabilidad también se evaluó mediante un ensayo de viabilidad resorufina fluorimétrica y mediante recuento microscópico de viables (Hoechst 33342 pi negativo) células positivas /. En ambos ensayos los resultados reflejaban el ensayo de tetrazolio MTS (datos no mostrados). del mismo modo, la actividad de caspasa-3/7 también se confirmó mediante Hoechst y ensayo de tinción fluorescente doble PI (datos no mostrados).
Orientación dual de EGFR TKI con o cetuximab y c-MET con su11274
además, verificó si los resultados obtenidos con el tratamiento combinado siRNA podría ser imitado mediante doble EGFR y los inhibidores de c-MET-específicas que pueden aplicarse más fácilmente
in vivo
. El cáncer de pulmón fueron tratados con la única ITC del EGFR gefitinib, erlotinib, o afatinib, y en combinación con c-MET su11274 inhibidor. También se estudió la combinación del anticuerpo cetuximab EGFR monoclonal con su11274.
El efecto de su11274 solo en el crecimiento celular y la apoptosis era extremadamente débil en las tres líneas celulares, aunque, no había un efecto ligeramente más fuerte en las células H1975 , que tiene mayor expresión de c-MET que las otras dos líneas celulares (Figura 4). A una concentración de 1 su11274 mu M, por ejemplo, una reducción del 20-30% en la tasa de proliferación y un modesto aumento de 40 a 50% en /7 señales de 3 caspasa-en contraste con la falta de efecto en las otras dos líneas celulares (Figura 4, Figura 5). Estos resultados son congruentes con los experimentos de c-MET siRNA.
H358, H1650 y H1975 células fueron incubadas con un rango de concentración de su11274, y se incubaron las células durante 72 h. Panel A: la proliferación. Panel B: la caspasa-3/7 actividad. Panel C: apoptosis. Grupo D:. Curvas dosis-efecto
Panel A: proliferación de las células después del tratamiento único o combinado con ITC. Las líneas celulares H358 (blanco), H1650 (gris) y H1975 (negro) se cultivaron en RPMI que contiene 10% de SFB y 1 su11274 M, gefitinib, erlotinib, afatinib o cetuximab, y sus combinaciones. La proliferación se analizó 72 h post-tratamiento usando un ensayo colorimétrico MTS. Panel B: caspasa -3/7 inducción por tratamiento único o combinado con ITC. *
P Hotel & lt; 0,05 y **
P
. & Lt; 0,01 en comparación tanto con solo tratamiento
En la combinación con ITC del EGFR, se mantuvieron las concentraciones a 1 M para todos los agentes. En las células H358 y H1650 (Figura 5A), la TKIs solo indujo una pequeña reducción en el crecimiento celular (como máximo un 41% en H1975 con afatinib, la Figura 5A), y un modesto aumento de la caspasa-3/7 señales (por 1,6 veces -al máximo también en H1975 con afatinib, Figura 5B) en comparación con los controles del vehículo. Las combinaciones con su11274 fueron capaces de disminuir el crecimiento de células ligeramente en H358 y H1650, y el efecto de la combinación fue más potente en H1975 (en particular su11274 + afatinib, Figura 5A). Mientras tanto, la adición de su11274 ofreció alguna ganancia en /7 señales de 3 caspasa-, de acuerdo con los datos de inhibición de crecimiento de células (Figura 5B). Se observaron los efectos más fuertes en las células H1975, que se sabe que EGFR-TKI resistentes. En estas células, el tratamiento de agente único con gefitinib y erlotinib es ineficaz, mientras que afatinib pueden reducir el crecimiento e inducir la apoptosis. Todas las combinaciones con su11274 lograrse un mayor efecto sobre el crecimiento celular y la apoptosis. La combinación su11274 + afatinib fue capaz de reducir la viabilidad celular al 49% a una concentración de 1 mM (Figura 5A), y el aumento de las señales de apoptosis a 2,64 veces (Figura 5B).
Con el fin de determinar el aditivo o sinérgico naturaleza de los tratamientos duales, una serie de concentraciones de hasta 1 M se estableció para cada compuesto y las combinaciones. Los efectos fue evaluado utilizando el ensayo de proliferación colorimétrico MTS formazan, y un CI que diferencia entre aditivos y sinérgicos se calculó (software Calcusyn Biosoft). Los resultados muestran claramente que el efecto combinado de todos los agentes sobre la proliferación en H358 y H1650 era aditivo. En H1975 células, un efecto aditivo de gefitinib o erlotinib o cetuximab + su11274 también se observó (Figura 6). Sin embargo, la combinación de afatinib + su11274 anotó sinérgicamente (CI & lt; 1) en la inhibición del crecimiento celular y la inducción de la apoptosis (Figura 7). Este efecto sinérgico se podría explicar por la inhibición de cooperación de la proliferación /supervivencia y anti-apoptóticos señal Akt, ERK y STAT (Figura 8). transferencia Western sugirió que la inhibición de estas tres vías es particularmente eficaz en las células H1975 después del tratamiento combinado con su11274 + afatinib (Figura 8).
índice de combinación (IC) se calculó en H1975. IC & gt; 1, lo que indica efecto aditivo (Panel A: gefinib + su11274; Grupo B: erlotinib + su11274; Grupo C: cetuximab + su11274).
índice de combinación (IC) de afatinib y su11274. Aquí, IC del afatinib + su11274 & lt; 1, lo que indica efecto sinérgico
Inmuno blot de lisados celulares de H358, H1650 y H1975 células tratadas con ITC /cetuximab solo o combinado.. Los anticuerpos incluyen fosforilada (p) EGFR, EGFR, PC-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, p-STAT5, p-STAT3, y β-actina.
Discusión
EGFR es una diana terapéutica en el CPNM. En un estudio anterior se ha mostrado que la droga agente único que apunta con EGFR TKI no lograr un efecto biológico máximo, incluso en las líneas celulares sensibles, y que la adición de-EGFR específicos de siRNA a EGFR TKIs o cetuximab aumenta los efectos terapéuticos [45 ]. Sin embargo, sólo la orientación de la vía EGFR no es eficaz en las células que albergan los mecanismos de resistencia y es aún insuficiente para anular el fenotipo maligno completo en las células sensibles. Así, la siguiente pregunta era si la inhibición simultánea de EGFR y c-MET, por RNAi, se traduciría en un aumento de los efectos biológicos, y por lo tanto ser útil para superar la resistencia de TKI en células H1975. Tang et al [28] mostró que la combinación de EGFR siRNA y c-MET siRNA en células H1975 resultó en una mayor inhibición de la señalización de EGFR aguas abajo, incluyendo las Akt y STAT3 vías pro-supervivencia. Aquí, hemos explorado el efecto sobre el crecimiento celular y la apoptosis. La adición de c-MET siRNA a ya sea de tipo salvaje EGFR o siRNAs-T790M específica, resultó en un aumento del efecto sobre la inhibición del crecimiento celular y la inducción de la caspasa-3/7 actividad. El tipo salvaje EGFR siRNA era más potente que T790M siRNA, de acuerdo con los resultados individuales siRNA descritos anteriormente, y en consonancia con el grado de inhibición vía (ver abajo). La combinación con c-MET siRNA incrementó la inhibición del crecimiento y la inducción de apoptosis más significativamente en células H358 y H1650. Inmunotransferencia muestra una baja regulación constante de fosfo-AKT, de acuerdo con Tang et al. [28], pero la baja regulación de fosfo-STAT3 fue más débil. También se encontró que dos señales descendentes se inhibieron: fosfo-STAT5 y especialmente fosfato ERK1 /2. Cuando se combinaron T790M y c-MET siRNAs, la cooperativa efecto fue menos potente.
La doble focalización de EGFR y c-MET fue entonces verifica por medio de ITC (gefitinib, erlotinib y afatinib más su11274). tratamiento de agente único, ya sea con inhibidor, en las tres líneas celulares resistentes a EGFR TKIs tuvo un efecto relativamente débil en la inhibición del crecimiento y la inducción de apoptosis y era incluso mínima o ausente para el inhibidor de c-MET. Sin embargo, dosis más altas de erlotinib podrían inducir la apoptosis en la línea celular mutante KRAS H358 [45]. En el presente estudio, hemos encontrado que una combinación de su11274 y erlotinib también tuvo un mayor efecto sobre la inhibición del crecimiento celular en células H1975. El grado de inhibición (35%) estaba en el mismo intervalo que informado por otros (por 42%) [28]. Para determinar el aditivo o de la naturaleza sinérgica del tratamiento dual, una serie de concentraciones crecientes TKI se creó. Los efectos se evaluaron utilizando el ensayo de proliferación colorimétrico MTS formazan, y un IC se calculó. El efecto de la doble erlotinib más el tratamiento su11274 en las células H1975 fue aditivo. Un efecto aditivo similar se encontró con gefitinib o cetuximab más su11274 en células H1975. Sin embargo, la combinación de afatinib y su11274 tenía claramente un efecto sinérgico sobre la inhibición del crecimiento celular en las células H1975.