Extracto
Varios agentes quimioterapéuticos ejercen efectos inmunomoduladores. Una de ellas es la gemcitabina análogo de nucleósido, que es ampliamente utilizado en pacientes con cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, el mesotelioma y varios otros tipos de cáncer, pero con una eficacia limitada. La hipótesis de que los efectos inmunopotenciadores de esta droga están parcialmente restringidas por la molécula de las células T inhibitoria CTLA-4 y por lo tanto podría ser aumentada mediante la combinación con un bloqueo de anticuerpos contra CTLA-4, que por sí solo recientemente ha mostrado efectos clínicos beneficiosos en el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico. Aquí se muestra, el uso de dos modelos de tumores murinos no inmunogénico de que el tratamiento con gemcitabina en combinación con los resultados de CTLA-4 de bloqueo en la inducción de una respuesta inmune anti-tumor potente. agotamiento de los experimentos demostraron que tanto CD4
+ y CD8 se requieren células
+ T para el efecto terapéutico óptimo. Los ratones tratados con la combinación mostraron regresión del tumor y la inmunidad protectora a largo plazo. Además, se muestra que la eficacia de la combinación es moderado por el momento de la administración de los dos agentes. Nuestros resultados muestran que el bloqueo inmune puesto de control y la quimioterapia citotóxica pueden tener un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer. Estos resultados proporcionan una base para seguir terapias de combinación con anti-CTLA-4 y la quimioterapia inmunopotenciadora y tienen importantes implicaciones para futuros estudios en pacientes con cáncer. Dado que ambos fármacos están aprobados para su uso en pacientes nuestros datos pueden traducirse inmediatamente en ensayos clínicos
Visto:. Lesterhuis WJ, salmones J, Nowak AK, Rozali ES, Khong A, Dick IM, et al. (2013) Efecto sinérgico de CTLA-4 Bloqueo y Quimioterapia del Cáncer en la inducción de inmunidad antitumoral. PLoS ONE 8 (4): e61895. doi: 10.1371 /journal.pone.0061895
Editor: Ramón Andrade de Mello, de la Universidad de Oporto, Portugal
Recibido: December 20, 2012; Aceptado: 14 de marzo de 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Lesterhuis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por subvenciones del Consejo de Investigación médica de Australia Nacional de Salud y la Comisión de Seguros y de Australia occidental. WJL es apoyado por una beca de investigación traslacional de la Sociedad del Cáncer de Holanda. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de que en el pasado, la práctica clínica ortodoxo sostuvo que la quimioterapia y la inmunoterapia no pudieron ser combinados debido a la naturaleza mielosupresor de la mayoría de los fármacos citotóxicos, esta idea ha sido puesta en duda en los últimos años por una gran cantidad de datos experimentales (revisado en [1], [2]). Por ejemplo, el tratamiento con antraciclinas y los resultados de oxaliplatino en la muerte de células tumorales inmunogénicos y quimioterápicos a base de platino regular a la baja el STAT6 inhibidora vía /PD-L2 y sensibilizar a las células tumorales para T citotoxicidad mediada por células [3] - [5]. Nuestro grupo ha demostrado que la gemcitabina análogo de nucleósido puede mejorar antígeno tumoral presentación cruzada por las células dendríticas y otros han demostrado que este tratamiento conduce a la regulación positiva de tumor expresión de clase I MHC y el agotamiento de tanto las células T reguladoras y células supresoras de origen mieloide [6 ] - [10]. Estos datos proporcionan una fuerte razón fundamental para explotar el efecto inmunopotenciador de gemcitabina mediante la combinación con otros enfoques inmunoterapéuticos.
redes inmunosupresores juegan un importante papel en la evasión de la inmunidad anti-tumor, y como tal podría restringir el efecto inmunopotenciador de la quimioterapia. Una de las vías de restricción potencialmente relevantes está mediada por la molécula inhibidora inmune de linfocitos T citotóxicos antígeno 4 (CTLA-4). La expresión de CTLA-4 es upregulated después de la activación de células T y de la vía se ha demostrado que desempeñan un papel inmunomodulador importante en el cáncer. bloqueo terapéutico de la CTLA-4 se ha demostrado ser un tratamiento eficaz para el melanoma [11]. El-CTLA-4 contra ipilimumab anticuerpo monoclonal está ahora registrado por la FDA como el primer fármaco que ha demostrado un beneficio de supervivencia global en un estudio aleatorizado de fase III en el melanoma metastásico en combinación con la quimioterapia dacarbazina [12], [13]. Sin embargo, aunque algunos pacientes lograron respuestas completas y otros siguieron a la supervivencia libre de progresión a largo plazo, la mayoría de los pacientes experimentaron progresión de la enfermedad.
Hemos establecido para determinar si el puesto de control de CTLA-4 limita el potencial terapéutico actividad de gemcitabina mediante la combinación con un anticuerpo de bloqueo de CTLA-4. En este estudio se muestra por primera vez que CTLA-4 bloqueo y la quimioterapia inmunopotenciadora en una dosis terapéutica tienen un efecto sinérgico, dando como resultado la inducción de una respuesta inmune anti-tumor potente y la inmunidad protectora a largo plazo. Además, se muestra que la eficacia global de la combinación en ratones depende del momento de la administración de los componentes individuales.
Materiales y Métodos
Ratones
BALB /C (H-2
d) y C57BL /6 (H-2
b) los ratones se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Canning Vale, Australia) y se mantuvieron en condiciones estándar Instalación M-Block Animal (, Queen Elizabeth II del Centro Médico de la Universidad de Australia occidental). Todos los ratones utilizados en estos estudios fueron entre 8-12 semanas de edad.
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Universidad de las aprobaciones del Comité de Ética Animal Australia Occidental (protocolo de RA /3 /100/1016) y el código de conducta del Consejo de Investigación médica de Australia Nacional de Salud e. El Comité de Ética Animal Australia Occidental específicamente aprobado este estudio.
Líneas Celulares
El MHC de clase I-positivo, inducida por el asbesto clase II-negativas, altamente tumorigénicas y pobremente inmunogénica BALB /C-derivada ratón línea celular mesotelioma AB1, transfectadas con el gen de hA de la gripe (AB1-hA) se ha descrito antes [6], [7]. Para los experimentos de reexposición se utilizaron células no transfectadas AB1-HA. El (LLC) línea celular de cáncer de pulmón de Lewis poco inmunogénicas y altamente tumorigénicas se obtuvo de CellBank Australia (Westmead NSW, Australia), donde se validó la identidad de la línea celular. Las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgrave, Australia) suplementado con HEPES 20 mM, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, 100 unidades /ml de penicilina (CSL, Melbourne, Australia), 50 mg /ml de gentamicina (David Bull Labs, Kewdale , Australia), y 10% de FCS (Invitrogen). células AB1-HA se mantuvieron en medios que contienen el análogo de neomicina geneticina (Invitrogen) a una concentración final de 400 mg /ml. Todas las líneas celulares fueron probados con regularidad y permanecieron negativos para Mycoplasma spp.
Desafío tumoral y
células tumorales ABI-HA Protocolo experimental gratis (1 × 10
6) o LLC (2.5 × 10 sc
5) en 100 l de PBS se inocularon en el costado inferior derecho de los ratones receptores. La quimioterapia estándar comenzó 9 días más tarde para AB1-HA y 6 días más tarde para LLC cuando un tumor palpable de aproximadamente 10 mm
2 era evidente. Los ratones fueron inyectados i.p. con gemcitabina /g de peso corporal de 120 mg cada tercer día durante cinco dosis (q3dx5), un régimen establecido previamente como una dosis máxima tolerada para los ratones BALB /C (figuras S1, S2 y S3) [6], [7]. Alternativamente, los ratones fueron tratados con una sola dosis de cisplatino 6 g /g en el día 9 para AB1-HA o día 6 de LLC, que nos pareció ser la dosis máxima tolerada en este modelo basado en experimentos de titulación (datos no mostrados). Los ratones de control recibieron 100 l de PBS solo. Anti-CTLA-4 se administró por vía intraperitoneal cada tercer día durante cuatro dosis (q3dx4). Inicialmente se utilizaron 100 mg por dosis, pero los estudios de titulación de dosis posteriores demostraron que con 75 mg por dosis se obtuvieron resultados iguales y por eso tomamos esta dosis para experimentos posteriores (Figura S4). En experimentos de combinación usando AB1-HA con cisplatino, se utilizó una dosis única de 200 mg anti-CTLA-4 en el día 9, con base en un informe reciente que demuestra la viabilidad y la potencia de ese anexo [14], y en base a nuestros propios datos que muestra la equivalencia con el calendario q3dx4 75 g (datos no mostrados). El tamaño del tumor se midió utilizando micro-pinzas de al menos tres veces por semana durante el tratamiento y posteriormente hasta el tamaño del tumor alcanzó 100 mm
2, en el que se sacrificaron los ratones punto siguiente directrices de Ética Animal regionales. Durante los pesos de ratones de tratamiento fueron controlados y son sacrificados si (& gt; 15%) la pérdida de peso significativa. No se observó toxicidad o
En algunos ratones experimentos que habían mostrado una regresión completa de los tumores fueron reexponerse no transfectadas las células del mesotelioma HA AB1 en la parte baja flanco izquierdo (Figura S5). Si al menos dos meses después de la reexposición no hay tumores eran palpables, los ratones fueron considerados para ser inmune. ganglios linfáticos tumorales de drenaje se recogieron y se tiñeron para la memoria marcadores de células T (véase más adelante). No portadores de tumores de ratones no tratados previamente se utilizaron como controles.
Los anticuerpos y quimioterapia
La gemcitabina (Gemzar, Eli Lilly) fue suministrado por el departamento de farmacia del Hospital Sir Charles Gairdner. El (clon 9H10) anticuerpo-CTLA-4 monoclonal anti fue preparado y purificado en el Centro de anticuerpo monoclonal, WAIMR (Perth, Australia). El hibridoma CTLA-4 fue una especie de regalo del Prof. JP Allison (Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering, Nueva York, Estados Unidos)
Para los experimentos de reducción, se utilizaron los siguientes anticuerpos:. Anti-NK1.1 (clon PK136), anti-CD4 (clon GK1.5) y anti-CD8 (clon YTS169.4), todos de la Facilidad de anticuerpos monoclonales, WAIMR (Perth, Australia). Anti-CD4 y CD8 se administraron 150 mg i.v., un día antes de gemcitabina /anti-CTLA4, seguido de 100 mg por vía i.p. cada 3 días, última dosis el día 27. Anti-NK1.1 se administró 200 g ip en días 6, 9 y 12. El agotamiento se confirmó mediante citometría de flujo de sangre periférica de cola hemorragias (Figura S6).
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para la citometría de flujo: CD3 FITC, CD4-PECy7, CD4 Pac azul, CD8 PerCpCy5.5, CD3 PE y APC ICOS, CD44-PE, CD49b FITC, CD62L-FITC, (todo Biolegend), Ki67 AF488 , Ki 67 PE y CD4 APCH7 (todo el BD Bioscience), CD3 PeCy7 FoxP3-PerCPCy5.5 y CD8 PECy7, CD8 ef780 (eBioscience).
Cell tinción y análisis de citometría de flujo
La sangre periférica toma de muestras se realizó a través de la cola sangra el día 29. un volumen de & lt; se recogieron 100 l de sangre en un tubo de heparina. cócteles de anticuerpos de manchas de la superficie (CD3, CD4, CD8 y ICOS) se prepararon y 20 l añadidos a 30 l de sangre durante 1 hora. Las muestras se sometieron a lisis (BD FACS solución de lisis) y se permeabilizaron (eBioscience Fijación /Perm Buffer), el anticuerpo para la tinción intracelular (Ki-67) se preparó y se añadió 20 l durante 45 minutos. Las muestras se resuspendieron en 200 l de estabilización de fijación (BD) y 50000 eventos de linfocitos cerrada fueron adquiridos en el flujo FACS Canto II citómetro (BD Biosciences) y se analizaron los datos utilizando el software FlowJo.
Para algunos experimentos, los ratones que implica había sido curado con el tratamiento y posteriormente resistido a la reexposición de las células tumorales en el flanco contralateral, los ganglios linfáticos de drenaje tumorales (TDLN) fueron cosechadas (véase más arriba) para el análisis de subconjuntos de células T de memoria. Los ganglios linfáticos de ambos flancos se recogieron y se combinaron y se tiñeron para CD4, CD8, CD44 y CD62L, de acuerdo con el mismo protocolo que la citometría de flujo análisis de sangre periférica (véase más arriba y la Figura S5).
Para el análisis de respuestas de células T en el tumor, TDLN (axilar ipsilateral y linfáticos inguinales) y el bazo, los ratones fueron sacrificados en el día 15 y se recogieron los órganos. Día 15 fue elegido como punto de tiempo ya que desde aproximadamente el día 12 las curvas de crecimiento entre los grupos comenzaron a dividirse, lo que permite una evaluación adecuada de las respuestas de células T. Los bazos y los LN se trituran entre portaobjetos de vidrio, se resuspendieron en solución de lisis de glóbulos rojos (eBioscience) y se filtró a través de un filtro de 40 micras (BD) y se tiñeron con los anticuerpos relevantes. Los tumores se desmenuzaron finamente y se transfirieron a solución de digestión que consiste en RPMI /FCS al 2% con 10 mg /ml de colagenasa y 1 mg /ml de DNasa I (Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 1 hora en un banco de rodillos. Durante los últimos 10 minutos EDTA se añadió a una solución final de 5 mM. Las muestras se lavaron con RPMI /FCS al 2% y se filtraron a través de un filtro de 40 micras y se tiñeron con los anticuerpos relevantes.
Análisis estadísticos
Los datos se analizaron usando Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc.) . datos sobre el crecimiento del tumor se analizaron mediante el SPSS versión 18 estadísticas procedimiento MIXED (IBM SPSS, Chicago IL). Las comparaciones entre los grupos de tratamiento en cada punto temporal se ajustaron para comparaciones múltiples por el método Sidak. Los datos para la supervivencia del tumor se analizaron de acuerdo con el método y la supervivencia de Kaplan-Meier proporciones se compararon entre los grupos utilizando una prueba de log rank. Los datos de los subconjuntos de células T se compararon con la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron significativas cuando el valor de p fue. & Lt; 0,05
Resultados
anti-CTLA-4 y gemcitabina Combinan de una manera sinérgica terapéuticamente
Sobre la base de los datos anteriores que demuestran gemcitabina como fármaco citotóxico inmunogénica [7], la hipótesis de que la eficacia terapéutica de gemcitabina podría mejorarse aún más si se combina con un bloqueo de anticuerpos contra CTLA-4. ratones inoculados-AB1-HA BALB /c fueron tratados con anti-CTLA-4 en combinación con gemcitabina (Figura S1 y la Figura 1). El tratamiento con gemcitabina sola dio lugar a un buen control del crecimiento de tumor cuando se administró el fármaco, como se informó anteriormente, sin embargo tumor progresó en la interrupción del tratamiento en la mayoría de los ratones [15]. El tratamiento con anti-CTLA-4 solo redujo la tasa de crecimiento del tumor, pero fue menos eficaz que la gemcitabina como una monoterapia (Figura 1A). Sin embargo, cuando anti-CTLA-4 y gemcitabina se combinaron, se observó un claro efecto aditivo de los dos tratamientos con un retraso significativo del crecimiento de tumor. El número de animales que alcanzaron regresión completa era superaditiva (~ 60% en el grupo de combinación frente a ~13% para anti-CTLA-4 y ~ 8% para la gemcitabina sola en el modelo de AB1-HA, Figs. 1A y B). También encontramos el control del tumor mejorada en el modelo de LLC, aunque el efecto fue menos pronunciado (Figura S7). Esto concuerda con estudios en humanos utilizando puesto de control inmunológico anticuerpos de bloqueo, lo que demuestra las principales diferencias en la eficacia entre los diferentes tipos de cáncer [16]. Curiosamente, cuando se trataron los ratones con el fármaco quimioterapéutico cisplatino no inmunogénico [17], no hubo efecto sinérgico claro en cualquiera de los modelos (Figura 1C y D y la Figura S7).
(A) la superficie del tumor en mm
2 (media ± dE) de los tumores AB1-HA que se inyectaron en el día 0, los ratones (n = 87) fueron tratados en el día 9/12/15/18 con 75 mg anti-CTLA-4 y con 120 mg /g de gemcitabina en el día 9/12/15/18/21, o con PBS (datos agrupados de 5 experimentos independientes se muestran). (B) de Kaplan-Meier de supervivencia parcela del mismo experimento. (C) de la superficie del tumor en mm
2 (media ± DE) de los tumores AB1-HA que se inyectaron en el día 0, los ratones (n = 65) fueron tratados en el día 9 con 200 mg anti-CTLA-4 y 6 mg /g cisplatino o con PBS (datos agrupados de 3 experimentos independientes se muestran). (D) de Kaplan-Meier de supervivencia parcela del mismo experimento.
Los estudios previos en pacientes con cáncer y los animales han sugerido que
+ células T ICOS juegan un papel importante en la acción de anti-CTLA -4, así como tener importancia pronóstica [18], [19]. Se analizó la expresión de ICOS y estado de proliferación de las células T circulantes en los ratones y encontraron que los ratones que fueron tratados con la terapia de combinación mostraron un aumento significativo de CD4
+ ICOS
+ células T en la sangre periférica, así como una claro aumento de CD4
+ células T proliferativas como se determina por Ki-67 tinción (Figura 2A-D, p & lt; 0,001).
a comparación se muestra de la activación y proliferación de células T marcadores de la sangre periférica en el día 29 después de la inoculación para los diferentes grupos de tratamiento (p = 0.05 *; ** P & lt; 0,01 *** p & lt; 0,001). ICOS
+ /CD4 células
+ J (A); Ki-67
+ /CD4
+ Th células (B); CD8
+ /ICOS
+ CTL (C) y CD8
+ /Ki-67
+ CTL (D). (E y F) Flujo de análisis de citometría de proliferar
+ células T CD8 y Treg en el tumor, los ganglios linfáticos y el bazo en el día 15. Se representa el drenaje de tumores son el porcentaje de Ki-67
+ CD8
+ de CD3
+ células Foxp3 y
+ CD4
+ CD3
+ células (F). Seis ratones por grupo se probaron para el control y anti-CTLA-4, 12 ratones por grupo para los regímenes que contiene gemcitabina agrupados por 2 ratones debido al tamaño pequeño del tumor en estos grupos. Las medias con se muestran SEM (n = 36). (G) de Kaplan-Meier parcela supervivencia de los tumores AB1-HA que se inyectaron en el día 0, los ratones (n = 57) fueron tratados con anti-CTLA-4 y /o gemcitabina, o con PBS en combinación con ozono anticuerpos contra CD4 o CD8 (agruparon se muestran los datos de 2 experimentos independientes).
Para obtener mayor conocimiento en la composición de las células infiltrantes de tumor durante el tratamiento, se calculó la frecuencia de Foxp3 + Treg CD4 +, CD49b
+ CD3
- las células NK y ICOS
+ CD4
+ activa las células Th y Ki-67
+ CD8
+ proliferar CTL en el tumor, los ganglios linfáticos de drenaje del tumor (TDLN) y el bazo en el día 15 (Figura 2E-F, Figura S8). El porcentaje de CD8
+ CTL no difirió entre los grupos de tratamiento (Figura S8), pero su capacidad de proliferación, medida por Ki-67 hizo aumento cuando los ratones fueron tratados con anti-CTLA4, tanto en tumor y TDLN. Curiosamente, la pérdida relativa de la proliferación de células T CD8 + que infiltran el tumor
en ratones tratados con gemcitabina fue rescatado en parte por anti-CTLA-4 (Figura 2E). Tumor infiltración de células T CD4 + no se alteró significativamente por gemcitabina o anti-CTLA-4, aunque la expresión ICOS como un marcador de la activación se redujo en todos los ratones tratados con gemcitabina, ya sea con o sin anti-CTLA4 (Figura S8). El porcentaje de tumores infiltrantes de Foxp3
+ células T CD4 +
se redujo significativamente en los tumores tratados con gemcitabina, anti-CTLA-4 o el tratamiento de combinación (Figura 2F), resultado que concuerda con los datos publicados anteriormente [10 ]. No se observaron diferencias claras en el número de células NK entre los grupos de tratamiento (Figura S8).
Para investigar si la respuesta mejorada a la terapia de combinación que participan principalmente
+ células CD4
+ o CD8 T o NK las células que llevan a cabo experimentos que agotan utilizando anticuerpos monoclonales contra CD4, CD8 (modelo AB1-HA) y NK1.1 (LLC modelo, ya que los ratones BALB /C no expresan NK1.1). Se encontró que el efecto terapéutico de la gemcitabina más anti-CTLA4 fue abrogada por completo cuando sea CD4
+ o CD8
+ células fueron agotadas (Figura 2G), mientras que el agotamiento de las células NK no afectó a la eficacia del tratamiento ( Figura S9). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el anti-CTLA-4 y la quimioterapia sinergia en la inducción de una respuesta inmune anti-tumor potente, con un papel importante tanto para CD4
células
+ y CD8 + T para efecto terapéutico óptimo .
anti-CTLA-4 y la combinación de gemcitabina terapia induce la larga duración de protección anti-tumoral memoria inmunológica
Una de las ventajas teóricas importantes de la inmunoterapia sobre la quimioterapia es que el primero tiene el potencial de inducir memoria inmunológica y por lo tanto el potencial de lograr respuestas duraderas. Hemos probado si el tratamiento de combinación con anticuerpos anti-CTLA-4 y gemcitabina resultó en la memoria inmunológica anti-tumor. Nos reinoculado ratones que habían rechazado completamente sus tumores después del tratamiento de combinación y han encontrado que el 93% (13 14 ratones) de estos ratones eran completamente resistentes a la reexposición tumor (Figura 3A). Es importante destacar que, para los experimentos de reexposición usamos células AB1 que no fueron transfectadas con HA, lo que indica que la inmunidad inducida estaba en contra de los antígenos tumorales compartidos en las células de mesotelioma AB1 y no solamente contra el antígeno HA transfectadas. Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células T en los ganglios linfáticos de drenaje de estos ratones mostraron mayores niveles de memoria y efectoras de memoria central células CD4
+ T, y en menor medida CD8
+ células de memoria (Figura 3B-E , p & lt; 0,001). En conjunto, estos datos sugieren que los resultados del tratamiento de combinación en un aumento de las células T de memoria y la inducción de la inmunidad protectora.
(A) de Kaplan-Meier parcela supervivencia de ratones que habían sido curado por cualquiera de anti-CTLA- 4 solo o terapia de combinación y que fueron puestos a prueba nuevamente a continuación con las células de mesotelioma AB1, mostrando inmunidad protectora en 80% y 92%, respectivamente. análisis T subconjunto de células en los ganglios linfáticos de drenaje de tumores en estos ratones (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01 *** p & lt; 0,001): CD44
+ /CD62L
+ /CD4
+ T células de memoria central (B); CD44
+ /CD62L
- /CD4
+ células T efectoras de memoria (C); CD44
+ /CD62L
+ /CD8
+ células T de memoria central (D); CD44
+ /CD62L
- /CD8
+ células T efectoras de memoria (E) guía empresas
La eficacia de anti-CTLA-4 /gemcitabina depende del momento
con el fin de determinar el régimen de tratamiento óptimo en términos de tiempo de ambos anti-CTLA-4 y gemcitabina, se trataron ratones portadores de tumores AB1-HA con tres regímenes diferentes: gemcitabina seguida de anti-CTLA-4, la terapia de combinación concomitante y anti-CTLA-4 seguida de gemcitabina (Figura S3; Figura 4). Un animal en el anti-CTLA-4 seguida de grupo de gemcitabina fue sacrificado debido a la pérdida de peso mayor que 15%, de lo contrario no había toxicidad aparente. Hemos observado diferencias marcadas en consecuencia del tumor entre estos grupos (Figura 4). No había ningún valor aditivo significativo de la terapia de combinación sobre cualquiera anti-CTLA-4 o la gemcitabina sola cuando el fármaco quimioterapéutico se administra por separado del anti-CTLA-4. El efecto antitumoral sinérgico sólo se observó cuando los fármacos se administraron simultáneamente ambos. Sorprendentemente, cuando se omitió sólo la primera dosis de gemcitabina (como en el 'anti-CTLA-4 primero "brazo contra el brazo concomitante), el efecto anti-tumor se redujo drásticamente (Figura 4). Estos datos muestran que la programación adecuada de los compuestos separados es fundamental para la eficacia óptima.
(A) el área tumoral en mm
2 (media ± DE) de los tumores AB1-HA que se inyectaron en el día 0, ratones (n = 86) fueron tratados con diferentes horarios de anti-CTLA4 y gemcitabina (ver Figura S2), o con PBS (datos combinados de 3 experimentos separados se muestran). (B) de Kaplan-Meier de supervivencia parcela del mismo experimento.
Discusión
La combinación de quimioterapia e inmunoterapia en el tratamiento del cáncer es una promesa no realizada [1]. El anticuerpo anti-CTLA-4 recientemente aprobado por la FDA es un enfoque inmunoterapéutico lógica y fácilmente traducible para combinar con quimioterapia. La hipótesis de que encontraríamos una interacción sinérgica con una combinación de anti-CTLA-4 bloqueo y un fármaco citotóxico inmunopotenciadora. Se anticipó que la quimioterapia podría causar la reducción del tumor y la liberación de antígenos inmunogénicos mientras que el anti-CTLA-4 podría aumentar la activación de células T y la expansión. Los datos anteriores a apoyar esta hipótesis eran limitadas. Un gran estudio de fase III en el melanoma metastásico comparar anti-CTLA-4 más DTIC en comparación con DTIC solo encontró un beneficio de supervivencia para la terapia de combinación en comparación con DTIC quimioterapia sola [13]. Pero debido a que no había comparación con anti-CTLA-4 solo, no se pudo evaluar con precisión la contribución relativa de la quimioterapia para el efecto observado. Del mismo modo, un estudio de fase II en cáncer de pulmón de células no pequeñas, se encontró mejoría en la supervivencia libre de progresión para la combinación de ipilimumab y quimioterapia versus quimioterapia sola; de nuevo aquí ipilimumab por sí solo no era un comparador [20]. En un estudio de fase II que no comparar el ipilimumab frente ipilimumab + DTIC, pero el uso de dosis más bajas de fármaco del estudio, hubo una tendencia hacia una mejor tasa de beneficio clínico para el grupo de combinación, pero esto no alcanzó significación [21]. Sobre la base de estos estudios publicados en humanos, no hay ninguna conclusión definitiva se puede dibujar en un posible efecto sinérgico de anti-CTLA-4 y la quimioterapia. Aunque un estudio en animales anterior encontró eficacia antitumoral mejorada cuando se añadió anti-CTLA4 a la quimioterapia melfalán, este experimento usó una dosis subterapéuticas de melfalán, destinado a sesgar las respuestas de células T hacia un fenotipo Th1 [22]. Recientemente, Wu y sus colegas encontraron que el anti-CTLA-4 de tratamiento en combinación con cisplatino resultó en una mejor control de la enfermedad en un modelo murino de mesotelioma, cuando se trataron tumores antes de que eran palpables, presumiblemente debido a la repoblación de células de cáncer inhibido [23]. Nos No se han encontrado datos publicados animales relevantes a nuestra hipótesis, utilizando dosis terapéuticas de quimioterapia en el cáncer manifiesta.
A medida que la gemcitabina es ampliamente utilizado en el tratamiento de muchos tipos de cáncer, incluyendo el mesotelioma, hemos probado la combinación en un bienestar establecida modelo murino no inmunogénica de mesotelioma. El tratamiento de AB1-HA con resultados gemcitabina en la reducción del tumor moderada o excrecencia tumoral retrasado en este modelo, imitando así la situación clínica en el tratamiento quimioterapéutico de la mayoría de cánceres metastásicos.
Se encontró aquí que la terapia de combinación de gemcitabina y anti -CTLA-4 ejerce un efecto anti-tumor mucho mayor que cualquiera de los agentes por sí solos, actuando así de una manera sinérgica (Figura 1). Esto correlaciona con un aumento pronunciado en las células CD4
+ ICOS
+ células T en la sangre periférica, así como un claro aumento en la proliferación de células CD4
+ células T como se determina por Ki-67 tinción, aunque nosotros no lo detectar este aumento en el tumor así (Figura 2). CD4
+ infiltración de células T en el tumor se ha mejorado por el tratamiento de combinación, y una disminución gemcitabina asociada en la proliferación de células de tumor infiltrante CD8
+ T fue rescatado en parte por CTLA-4 bloqueo. Es importante destacar que no se encontró ninguna reducción en el crecimiento del tumor cuando el anti-CTLA-4 se combinó con cisplatino. El cisplatino se ha demostrado que induce una forma no inmunogénica de la muerte celular [17], y aunque no regular a la baja la molécula inhibidora de PD-L2 [5], el modelo de tumor que utilizamos expresa solamente niveles muy bajos de PD-L2 (datos no mostrado). Por lo tanto, consideramos cisplatino ser una forma no inmunopotenciadora de la quimioterapia en este modelo. Estos resultados sugieren que el tratamiento de combinación con anticuerpos anti-CTLA-4 será más potente cuando se combina con quimioterapia inmunopotenciadora.
Dado que una de las ventajas teóricas de la combinación de quimioterapia con la inmunoterapia es la inducción de una memoria inmunológica de larga duración, se determinó la respuesta de células T de memoria en ratones con tumores que se habían regresión después del tratamiento (Figura 3). Se encontró que estos ratones habían mejorado niveles tanto de CD4
+ y CD8
+ efectoras de memoria y células T de memoria centrales de los ganglios linfáticos de drenaje de tumores, que se correlaciona con la inmunidad protectora a una reexposición con células tumorales. Estos hallazgos concuerdan con estudios en un murinos Listeria monocytogenes OVA-expresión de
Tarjetas telefónicas modelo, en el que CD8
+ T de memoria celular se ve reforzada por una sola dosis de anti-CTLA-4 [14]. Es importante destacar que, en nuestro modelo, ni la formación de CD4
+ ni CD8
+ células T de memoria se vio obstaculizado por la gemcitabina.
Nuestro tercer objetivo fue determinar la secuencia óptima de la quimioterapia y anti-CTLA La terapia -4. Puesto que se conoce a partir de varios estudios en animales que el tiempo es crucial en el uso de anti-CTLA-4 cuando se combina con los enfoques de vacunación [24], [25], la hipótesis de que el tiempo óptimo /programación en combinación con quimioterapia también sería crítico para anti-CTLA-4 eficacia. Se encontró que la eficacia de la combinación de hecho dependido de programación: si la gemcitabina se administró antes o después de anti-CTLA-4, no había valor aditivo por encima de ya sea sola terapia, mientras que el tratamiento concomitante dio como resultado en el control de la enfermedad en la mayoría de los ratones ( la Figura 4).
en conclusión, nuestros resultados demuestran que el anti-CTLA-4 terapia y quimioterapia citotóxica pueden tener un efecto sinérgico claro en el tratamiento del cáncer. Nuestros datos proporcionan un fundamento para desarrollar aún más las combinaciones de fármacos citotóxicos y anti-CTLA-4 en la clínica. Sin embargo, en base a nuestros datos sugieren que para los diferentes grupos de compuestos anticancerígenos citotóxicos, su horario y la inmunogenicidad óptima primero deben determinarse cuidadosamente en modelos preclínicos y estudios clínicos pequeños.
Apoyo a la Información
Figura S1. horario
tratamiento de gemcitabina y anti-CTLA-4 en el modelo AB1-HA. ratones Balb /c fueron inoculados con 1 x 10
6 AB1-HA células del mesotelioma murina en días 0 y ip posteriormente inyectados con PBS, 120 mg /g de gemcitabina peso corporal cada tres días durante cinco dosis (q3dx5) en días 9- 12-15-18-21 o 75 mg anti-CTLA-4 (q3dx4) en días 9-12-15-18, ya sea solo o en combinación, como se indica
doi:. 10.1371 /journal.pone.0061895. s001 gratis (PDF)
figura S2. horario
tratamiento de gemcitabina y anti-CTLA-4 en el modelo LLC. Ratones C57BL /6 se inocularon con 2,5 × 10
5 LLC células de cáncer de pulmón murino de día 0 y ip posteriormente inyectados con PBS, 120 mg /g de gemcitabina peso corporal cada tres días durante cinco dosis (q3dx5) en los días 6-9 -12-15-18 o 75 mg anti-CTLA-4 (q3dx4) en días 6-9-12-15, ya sea solo o en combinación, como se indica
doi:. 10.1371 /journal.pone.0061895.s002 gratis (PDF)
Figura S3. horario
El tratamiento de la terapia de combinación de gemcitabina y anti-CTLA-4 en el modelo AB1-HA, la comparación de diferentes esquemas de tratamiento. ratones Balb /c fueron inoculados con 1 x 10
6 AB1-HA células del mesotelioma murina en el día 0 y, posteriormente, inyectada ip con 120 mg /g de gemcitabina peso corporal (q3dx5) y 75 g anti-CTLA-4 (q3dx4) divididos en tres grupos, "concurrente" (anti-CTLA-4 en los días 9-12-15-18; gemcitabina en los días 9-12-15-18-21), "anti-CTLA-4 en primer lugar '(anti-CTLA- 4 en los días 9-12-15-18; gemcitabina en los días 12-15-18-21-24) y gemcitabina 'primera' (gemcitabina en los días 9-12-15-18-21; anti-CTLA-4 en los días . 24-27-30-33)
doi: 10.1371 /journal.pone.0061895.s003 gratis (PDF)
figura S4.
estudio de optimización de dosis de anti-CTLA4 en el modelo AB1-HA. superficie del tumor en mm
2 (media ± DE) de los tumores AB1-HA que se inyectaron en el día 0, los ratones (n = 40) fueron tratados con 75 mg anti-CTLA-4 i.p. en los días 9-12-15-18 en las dosis indicadas y con gemcitabina 120 mg /g de peso corporal en los días 12-15-18-21-24
doi:. 10.1371 /journal.pone.0061895.s004
(PDF)
Figura S5. estrategia
de apertura de puerta para la determinación de memoria subconjuntos de células T en los ganglios linfáticos de drenaje de tumores, usando citometría de flujo. ganglios linfáticos tumorales de drenaje se cosecharon como se describe en la sección de materiales y métodos.