Extracto
Recientemente hemos desarrollado un método para generar células mieloides con capacidad de proliferación de las células iPS humanas. iPS-ML (derivado de células iPS mieloide /línea de macrófagos), generada mediante la introducción de proliferación y anti-senescencia factores en células mieloides derivadas de células iPS, creció continuamente de una manera M-CSF-dependiente. Un gran número de células que presentan propiedades similares a macrófagos se puede obtener fácilmente mediante el uso de esta tecnología. En el presente estudio, se evaluó la posible aplicación de IPS-ML en la terapia contra el cáncer. Hemos establecido un modelo de cáncer gástrico peritoneal diseminada por vía intraperitoneal inyectar NUGC-4 células de cáncer gástrico humano en ratones SCID. Cuando iPS-ML se inyectaron intraperitonealmente en los ratones con peritoneales NUGC-4 tumores preestablecidos, iPS-ML masivamente acumula y se infiltró en los tejidos tumorales. IPS-ML expresar IFN-β (IPS-ML /IFN-β) inhibió significativamente el crecimiento intra-peritoneal del cáncer NUGC-4. Además, IPS-ML /IFN-β también inhibe el crecimiento del cáncer pancreático humano MIAPaCa-2 en un modelo similar. IPS-ML son, por tanto, un agente prometedor para el tratamiento de cáncer peritoneal diseminada, para los cuales hay un tratamiento estándar está disponible actualmente
Visto:. Koba C, M Haruta, Matsunaga Y, K Matsumura, Haga E, Sasaki Y, et Alabama. (2013) Efecto terapéutico de células iPS humano de células derivadas de células mieloides que expresan IFN-β contra el cáncer diseminado intraperitoneal en modelos de xenoinjertos. PLoS ONE 8 (6): e67567. doi: 10.1371 /journal.pone.0067567
Editor: José Najbauer, Universidad de la Escuela Médica de Pécs, Hungría
Recibido: 30 de septiembre de 2012; Aceptado: 21 de mayo de 2013; Publicado: 24 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Koba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en-Ayudas Nos. 23650609 y 24300334 de SN y 23659158 de S. S. desde el MEXT, Japón; una subvención para Y.N. de la princesa Takamatsu Cancer Research Fund; Beca de Investigación de S. S. de enfermedades intratables del Ministerio de Salud y Bienestar, Japón; y una donación de S. S. de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los macrófagos juegan un papel esencial para mantener la homeostasis en el cuerpo. Residen en todos los tejidos del cuerpo y participan en diversas funciones, tales como la eliminación de patógenos invasores, la remodelación de los tejidos, y la limpieza de las células muertas. Además, la infiltración de macrófagos se observa frecuentemente en varios tipos de cáncer [1]. Estudios recientes indican que estos macrófagos asociados al tumor (TAM) promueven principalmente progresión del cáncer mediante la aceleración de la invasión local y metástasis de los cánceres de [2]. Por el contrario, otros estudios demuestran efecto tumoricida de los macrófagos [3], [4]. Sobre la base de los efectos anticancerígenos de los macrófagos observados en los estudios preclínicos, la aplicación de los macrófagos para la terapia del cáncer ha sido tratado; por ejemplo, la transferencia de los macrófagos pre-activadas con IFN-γ se ensayó como un agente de tratamiento potencial para pacientes con cáncer [5] - [9]. Sin embargo, ningún beneficio terapéutico clara contra el cáncer se ha observado hasta ahora en la terapia de los macrófagos.
Para establecer la terapia de macrófagos como una terapia más eficaz contra el cáncer, mejora del método de macrófagos que suministran es necesario. En los ensayos clínicos notificados, macrófagos utilizados para fines terapéuticos se generaron a partir de donantes monocitos de sangre periférica que se aislaron por leucoféresis. Sin embargo, los monocitos de sangre periférica aislados de no pueden ser reproducidos fácilmente. El número de macrófagos generados por tales métodos es limitada (como máximo 10
9-10
10), y puede ser insuficiente para lograr efectos clínicos. Si un número suficiente (por ejemplo, más de 10
10) de macrófagos con la propiedad anti-cáncer potente podría administrarse repetidamente, podríamos darse cuenta de la terapia anti-cáncer eficaz con los macrófagos.
Las células madre pluripotentes, tales como las células madre embrionarias (ES) o células madre pluripotentes inducidas (iPS), pueden propagarse indefinidamente y poseen la capacidad de diferenciarse en diversos tipos de células somáticas, incluyendo las células de la sangre. La destrucción de un embrión humano es necesaria para generar células madre embrionarias humanas. células iPS, por otra parte, se pueden generar mediante la introducción de varios factores definidos en células somáticas derivadas de cualquier donante [10] - [13]. De este modo, la tecnología de células iPS puede superar los problemas éticos, así como la cuestión histoincompatibility entre las células terapéuticas donante y el receptor, y la aplicación futura de las células iPS a la medicina clínica se espera [14], [15].
Varios grupos, incluyendo el nuestro, han establecido hasta la fecha métodos para generar los macrófagos de ratón o las células madre pluripotentes humanas [16] - [24]. Sin embargo, las células pluripotentes stemα rendimiento menor número de macrófagos que las células madre pluripotentes del ratón. Así métodos mucho establecidas generan el número de macrófagos humanos que son menos de 100 veces el número de las células iPS indiferenciadas utilizados como materiales de partida; Además, la generación de macrófagos por métodos convencionales tarda más de un mes. Por lo tanto, los métodos convencionales son demasiado laborioso y caro para ser aplicada a la medicina práctica.
Recientemente, se estableció un método para inducir la proliferación de las células mieloides derivadas de células iPS-(iPS-MC) por transducción de lentivirus mediada de genes que pueden promover la proliferación de células o inhibir la senescencia celular, tal como cMYC más BMI1, EZH2, o MDM2, para generar una línea celular mieloide /macrófagos derivados de iPS-célula (IPS-mL) [25]. IPS-ML puede proliferar de manera M-CSF-dependiente durante al menos varios meses sin perder el potencial de diferenciarse en células dendríticas (IPS-ML-DC) con una capacidad estimulante de las células T potente.
el presente estudio, se evaluó el potencial del uso de IPS-ML como células efectoras contra el cáncer. Hemos investigado si o no genéticamente modificado iPS-ML expresa el anticuerpo anti-HER2 o interferón (IFN) podría ejercer un efecto terapéutico contra gástrica peritoneal diseminada y páncreas en modelos de xenoinjertos.
Materiales y Métodos
Las células y los reactivos
Este estudio fue aprobado por la junta de revisión ética de Kumamoto University Graduate School of Medical Sciences. Una línea celular de cáncer gástrico humano, NUGC-4, y una línea celular de cáncer pancreático humano, MIAPaCa-2, fueron proporcionados por la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (JCRB, Osaka, Japón). Los métodos para la generación, el mantenimiento y la modificación genética de las células iPS humanas se han descrito anteriormente [21].
El análisis de citometría de flujo
Los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con FITC o PE se compraron de BD Pharmingen (San Diego, CA), Beckman Coulter (Brea, CA), Miltenyi Biotec (Bergish-Gladbach, Alemania), Sigma (St. Louis, MO), o eBioscience (San Diego, CA): HI30 anti-CD45 (clon, IgG1 de ratón), anti-CD33 (WM53, ratón IgG1), anti-CD36 (FA6.152, ratón IgG1), anti-CD11b (ICRF44, ratón IgG1), anti-CD14 (61D3, IgG1 de ratón), anti-CD4 ( 11830, ratón IgG2a), anti-CD97 (VIM3b, ratón IgG1), anti-CD13 (WM15, ratón IgG1), anti-CD87 (62022, ratón IgG1), anti-CD115 (2-3A3-1B10, IgG2a de rata), anti-CD116 (4H1, ratón IgG1), anti-TLR2 (T2.5, ratón IgG1), anti-TLR4 (HTA125, ratón IgG2a), anti-HER2 /neu (Neu 24,7, ratón IgG1), y anti-cMYC ( 9E10, IgG1 de ratón). controles de isotipo correspondiente, IgG2a de ratón (G155-178) y el ratón IgG1 (MOPC-21), se utilizaron. Las muestras de células fueron tratadas con el reactivo de FcR-bloqueo (Miltenyi Biotec) durante 10 min, se tiñeron con los mAb conjugados con fluorocromo durante 30 minutos, y se lavaron 3 veces con PBS /FCS (2%). muestras de células teñidas se analizaron mediante un FACScan (Becton Dickinson) citómetro de flujo.
Zymosan ensayo de fagocitosis
Las suspensiones celulares en DMEM /10% FCS se añadieron a placas de cultivo de 48 pocillos (2 x 10
5 células /pocillo en 200 l) y se incubaron a 37 ° C durante 2 horas para permitir que las células se adhieran a las placas. Se añadieron partículas de zymosan A marcados con FITC (Molecular Probes) a los pocillos (2 × 10
6 partículas /pocillo en 200 l). Después de incubación durante el periodo indicado, las células se observan microscópicamente (Axio Observador Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) y se recogieron por tratamiento con tripsina /EDTA para el análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FACScan.
Construcción de vectores de expresión
un clon de plásmido que contiene ADNc para un fragmento de la región variable de cadena sencilla (scFv) específico para HER2 /neu humana fue un regalo de Lieberman (Addgene plásmido#10794) [26]. La secuencia de scFv a un vínculo PCR a secuencias de nucleótidos para una etiqueta cMYC (EQKLISEEDL) y un fragmento C-terminal de ratón Fc? RI. El fragmento de ADN que codifica la proteína se clonó primero en pENTR-D-TOPO (Life Technologies) y posteriormente se transfiere a un vector de expresión de mamífero pCAG-IRES-Puro, que es impulsado por el promotor de CAG, e incluye un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) -puromycin
N-acetil-transferasa
casete del gen. ADNc de IFN-α humano, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TRAIL, y FAS-ligando fueron proporcionados por el Centro NITE de Recursos Biológicos (Kazusa, Japón), Kazusa Centro de Investigación de la DNA (Kazusa, Japón), o RIKEN BRC (Tsukuba, Japón). Un vector de lentivirus, CSII-EF, y construcciones de empaquetamiento se generaron por H. Miyoshi (RIKEN BRC) y sus colegas [27]. Los fragmentos de ADNc se insertaron en el plásmido CSII-EF junto con fosfotransferasa IRES-higromicina para generar construcciones de expresión lentiviral. lentivirus recombinante se produjo y purificó por un método descrito previamente [21].
Generación de iPS-ML que expresan scFv
Un vector plásmido (pCAG-IRES-Puro) que codifica anti-HER2 scFv era introducido en células iPS humanos por electroporación y seleccionada usando puromicina (5 mg /ml). clones establemente transfectadas se aislaron mediante un método descrito previamente [21]. Posteriormente, los clones de células iPS que llevan el constructo scFv anti-HER2 se colocaron en la cultura de la diferenciación para generar iPS-MC /anti-HER2. El IPS-MC que expresan scFv específico para HER2 fueron transducidas con vectores de lentivirus para cMYC más IMC1, o cMYC más EZH2, para generar iPS-ML. El método para generar y mantener iPS-ML se ha informado anteriormente [25].
La modificación genética de células iPS-ML /scFv para expresar factores adicionales
IPS-ML se transdujeron con vector lentiviral que codifica IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, el ligando Fas, o TRAIL. Para seleccionar las células que expresan de forma estable los transgenes, las células se cultivaron en un medio que contiene higromicina (0.5~2 mg /ml). Para cuantificar la producción de citoquinas transgenes derivados y ligando de Fas, se cultivaron las células iPS-ML transfectadas (1 × 10
5 células /pocillo en 200 l) en placas de 96 pocillos de cultivo de fondo plano de 24 horas, y la concentración de las citocinas y FAS-ligando en el sobrenadante del cultivo se midió usando kits de ELISA comprado de Endogen o R & amp; D Systems. expresión de TRAIL se examinó mediante análisis de citometría de flujo.
Análisis de la sensibilidad de células cancerosas a las citoquinas
NUGC-4 o células MIAPaCa-2 se cultivaron (4 × 10
5 células /pocillo en 1 ml) en placas de cultivo de 24 pocillos en presencia o ausencia de 10 ng /ml recombinante IFN-α, IFN-β, IFN-γ, o TNF-α por 24 horas. Posteriormente, se recuperaron las células y se tiñeron con FITC marcado Anexina-V (Biovision, Mountain View, CA) y se analizaron en un citómetro de flujo FACScan. Luciferase-expresión de las células cancerosas se cultivaron (5 × 10
3 células /pocillo en 200 l) en placas de cultivo de 96 pocillos (B & amp; W Isoplate, Wallac) en presencia de 10 ng /ml recombinante IFN-α, IFN -β, IFN-γ, o TNF-α. Tres días más tarde, se añadió solución de sustrato de luciferasa (SteadyLite Plus, Perkin-Elmer) (50 l /pocillo), y la luminiscencia se midió en un lector de microplacas (TriStar, BertholdTech, Bad Wildbad, Alemania).
Análisis de la actividad antitumoral de IPS-ML
in vitro
NUGC-4 células (5 × 10
3 células /pocillo) que expresa luciferasa se cultivaron con o sin IPS- ML (2,5 × 10
4 células /pocillo) en placas de 96 pocillos de cultivo de fondo plano (B & amp; W Isoplate, Perkin-Elmer). Después de un cultivo de 3 días, /pocillo de solución de sustrato de luciferasa se añadió 50 l, y la luminiscencia se midió en un lector de micro-placa.
Análisis de la infiltración de iPS-ML en tejidos de cáncer en ratones SCID
experimentos con ratones fueron aprobados por el comité de investigación animal de la Universidad de Kumamoto. la proteína de fluorescencia verde (GFP) expresando NUGC-4 células (5 × 10
6 células /ratón) se inyectaron en la cavidad peritoneal de ratones SCID. Después de 15 días, iPS-ML se marcaron con PKH26 (Sigma), siguiendo las instrucciones del fabricante, y fueron por vía intraperitoneal (i.p.) se inyecta en los ratones (3 × 10
6 células /ratón). Los ratones fueron sacrificados el día siguiente y se sometieron a análisis de fluorescencia para detectar la ubicación de macroscópicamente NUGC-4 tumores e IPS-ML en un NightOwl II (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). NUGC-4 /GFP se detectó con 475 nm de excitación y 520 nm de emisión filtros, e IPS-ML se detectó con 550 nm de excitación y 600 nm de emisión filtros PKH26-etiquetado. Para el examen microscópico, los tejidos de cáncer en el epiplón mayor se retiraron, se fijaron en paraformaldehído al 4% /PBS, y embebidos en Tissue-Tek octubre compuesto (Sakura Finetechnical, Tokio, Japón). Las secciones de tejido de espesor 20-m se realizaron en un criostato y se analizaron en un microscopio de fluorescencia (Axio Observador Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
Análisis de la actividad anti-tumor de iPS-ML
in vivo
ratones SCID fueron ip inyectados con las células cancerosas (5 × 10
6 células /ratón). En el día 3 o 4, los ratones se sometieron a análisis de imágenes de luminiscencia para examinar establecimiento tumor. Posteriormente, los ratones con tumores establecidos se dividieron al azar en grupos de tratamiento y de control. Los ratones en el grupo de tratamiento fueron inyectados con iPS-ML según el horario indicado, y el crecimiento de células de cáncer se controló en los ratones por análisis de imágenes de luminiscencia. La magnitud del crecimiento del cáncer se determinó por el cambio de los recuentos totales de luminiscencia para cada ratón.
Resultados
Caracterización de iPS humanas de células derivadas de la proliferación de células mieloides
previamente establecido un procedimiento para generar células mielomonocítica con la proliferación de la capacidad (iPS-ML) mediante transducción mediada por lentivirus de cMYC además IMC-1 en células mieloides derivadas de células iPS humanas (iPS-MC) [25]. iPS-ML creció sobre todo en suspensión de una manera M-CSF-dependiente. Expresaron varios fabricantes de macrófagos, y fueron heterogéneos en la morfología y en la expresión de algunas de las moléculas de la superficie celular (Fig. 1A, B).
A. Una imagen de contraste de fase de células iPS en vivo-ML en una placa de cultivo (superior) y una imagen de IPS-ML teñidas con May-Giemsa en un portaobjetos de vidrio (inferior) se muestran. B. expresión de la superficie celular de moléculas marcadoras de macrófagos CD11b, CD14, CD4, CD13, CD33, CD36, CD87, CD97, CD115, CD116, TLR2, TLR4 y en iPS-ML se analizó por citometría de flujo. Se muestran los perfiles de tinción del mAb específico (líneas gruesas) y un control de isotipo mAb (área gris). C. iPS-ML en placas de cultivo se añadieron con zymosan partículas marcadas con FITC. se muestran de contraste de fases (superior) y las imágenes de fluorescencia (inferior) después de una incubación de 90 min. D. Después de una incubación de 40 min en presencia o ausencia de zymosans, se recogieron las células utilizando tripsina /EDTA y después se analizó en un citómetro de flujo. se muestran los porcentajes de células con alta intensidad de fluorescencia que indican zymosan intracelular. Por supuesto se muestra E. Tiempo para la fagocitosis. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de ensayos por duplicado.
Para analizar la capacidad fagocítica de IPS-ML, hemos observado al microscopio la cultura iPS-ML después de añadir zymosan partículas marcadas con FITC. Después de una incubación de 90 min, se detectaron señales de fluorescencia en la mayoría de las células, lo que indica que la mayoría de la iPS-ML ingerido zymosan partículas (Fig. 1C). Aproximadamente el 60% de la IPS-ML contenía partículas de zymosan después de 40 minutos de incubación con zymosan partículas marcadas con FITC, tal como se evaluó mediante análisis de citometría de flujo (Fig. 1D). Un curso de tiempo para la fagocitosis se muestra en la Figura 1E.
La actividad anti-cáncer de IPS-ML que expresa anti-HER2 scFv
in vitro
Un antígeno relacionado con el cáncer en
, HER2 /neu, se expresa en varios tipos de cánceres humanos, incluyendo cáncer de mama y cáncer gástrico [28]. Decidimos examinar el efecto anticancerígeno de IPS-ML que expresa anti-HER2 scFv contra una línea celular de cáncer gástrico HER2-expresión, NUGC-4 (Fig. 2A). Con este fin, hemos generado iPS-ML expresan de forma estable anti-HER2 scFv (IPS-ML /anti-HER2) (Fig. 2B). iPS-ML /anti-HER2 se genera a partir de iPS-MC derivado de un clon de células iPS introducido con un vector de expresión para scFv anti-HER2 por un método descrito previamente [21]. Nosotros examinamos de forma esporádica y confirmó la expresión del scFv por IPS-ML /anti-HER2.
A. Se analizó la expresión de HER2 /neu en NUGC-4 células de cáncer gástrico humano. Se muestran los perfiles de tinción de anticuerpos anti-HER2 MAB (línea gruesa) y un anticuerpo de control de isotipo correspondiente (área gris). B. expresión de la superficie celular de anti-HER2 scFv en iPS-ML (iPS-ML /anti-HER2) se detectó por tinción con un anticuerpo anti-cMYC-tag. C. luciferasa que expresan NUGC-4 células (5 × 10
3 células /pocillo) se cultivaron solo o co-cultivan en una placa de cultivo de 96 pocillos con iPS-ML (1 x 10
4 células /pocillo ) con o sin anti-HER2 expresión scFv. El número de vivos NUGC-4 células se midió por la actividad de luciferasa después de cultivo de 3 días. Los datos se indican como la media + SD de ensayos por duplicado.
En un primer momento se evaluó el efecto de la IPS-ML /anti-HER2 contra NUGC-4 células
in vitro
. introducidos-luciferasa de luciérnaga NUGC-4 células fueron co-cultivadas con células iPS-ML con o sin anti-HER2 expresión de scFv. Hemos observado que las iPS-ML células vivas reduce NUGC-4, y que la expresión de anti-HER2 scFv en IPS-ML mejorado el efecto inhibidor contra el crecimiento de células NUGC-4 (Fig. 2C).
Acumulación y la infiltración de IP inyectada IPS-ML en los tejidos tumorales
hemos querido evaluar si iPS-ML tuvo un efecto terapéutico sobre el cáncer peritoneal diseminada. la infiltración de macrófagos se observa con frecuencia en muestras clínicas de tejido de cáncer de [1]. Hemos examinado si o no i.p. administrados iPS-ML se infiltró en los tejidos de cáncer pre-establecidos en la cavidad peritoneal de ratones.
Para este fin, NUGC-4 humana células de cáncer gástrico que expresan GFP, establecidas a partir de una lesión metastásica peritoneal de un tipo difuso gástrico ip paciente de cáncer, se inyectaron en ratones SCID. Después de 15 días, se inyectaron células iPS-ML marcado con colorante fluorescente roja PKH26. Hemos inyectado simultáneamente el activador de plasminógeno tisular recombinante (tPA) en la cavidad peritoneal del ratón, esperando que el tPA promueve la infiltración de iPS-ML en los tejidos tumorales. Los ratones fueron sacrificados en el día siguiente, y se diseccionaron para determinar la ubicación de la inyectados iPS-ML por análisis de fluorescencia
análisis de fluorescencia macroscópica detección de GFP (excitación /emisión: 475/520 nm). Indicó que NUGC-4 los tumores localizados principalmente en el epiplón mayor (Fig. 3A). IPS-ML inyectados detectados por PKH26 de fluorescencia (excitación /emisión: 550/600 nm) también se localizaron principalmente en el epiplón mayor, lo que demuestra que las iPS-ML acumula de manera eficiente en los tejidos tumorales. una clara acumulación de tales iPS-ML en el epiplón mayor no se observó cuando iPS-ML se inocularon en los ratones sin tumores establecidos (datos no mostrados).
A. NUGC-4 células que expresan GFP (5 × 10
6 células /ratón) se inyectaron en la cavidad peritoneal de ratones SCID. Después de 15 días, IPS-ML marcado con fluorescente PKH26 se inyectaron por vía intraperitoneal en los ratones (3 × 10
6 células /ratón). Los ratones se sacrificaron el día siguiente y se sometieron a análisis de imágenes de fluorescencia para determinar la localización de los tumores NUGC-4-GFP (excitación /emisión: 475/520 nm) y PKH26-iPS-ML (excitación /emisión: 550/600 nm ). Se aislaron B. tejidos tumorales en el epiplón mayor de los ratones, y se hicieron 20-m de espesor secciones congeladas. Las secciones se analizaron en un microscopio de fluorescencia, y una imagen fusionada con fluorescencia verde indica NUGC-4 células /GFP y la fluorescencia roja que indica PKH26 manchados de iPS-ML se muestra. C, D Las secciones de tejido se hicieron mediante un procedimiento similar como para B, excepto que no se usó tPA. Una vista a mayor aumento de la región rodeada por un recuadro de puntos en C se muestra en D.
A continuación, serán aislados y examinados al microscopio los tejidos tumorales. En la sección de tejido se muestra en la Figura 3B, PKH26-etiquetado iPS-ML se infiltró en el nido de NUGC-4 células que expresan GFP. Experimentos similares se llevaron a cabo sin inyección de tPA, y mayor análisis de ampliación de las secciones de tejido muestra claramente la infiltración de iPS-ML en el tejido del cáncer (Fig. 3C, D). Estos resultados indican que iPS-ML infiltrado de manera eficiente en los tejidos de cáncer, cuando i.p. inyectada en ratones portadores de cánceres establecidos en la cavidad peritoneal.
No hay actividad anticancerígena de IPS-ML que expresa anti-HER2 scFv
in vivo
A continuación examinó el efecto de IPS-ML /anti-HER2 contra NUGC-4
in vivo
. NUGC-4 células de luciferasa que expresan se inocularon en la cavidad peritoneal de ratones SCID (5 × 10
6 células /ratón). Después de 3 días, el injerto de células de cáncer en los ratones se examinó por análisis de bioluminiscencia, y ratones portadores de células de cáncer se dividieron aleatoriamente en grupos de tratamiento o de control. De 4 a 8 días, se inyectó a los ratones del grupo de tratamiento diario con IPS-ML /anti-HER2 (2 × 10
7 células /ratón). En el día 10, los ratones se sometieron a análisis de bioluminiscencia de nuevo para examinar la progresión del cáncer.
Como se muestra en la Figura S1, NUGC-4 tumores en los ratones tratados con iPS-ML creció más rápidamente que en el los ratones de control. Más bien un incremento del crecimiento NUGC-4 de las células cancerosas en este
in vivo
modelo, aunque estadísticamente no significativa. Esto puede ser porque iPS-ML /anti-HER2 se vieron afectados por el microambiente del cáncer de adquirir un fenotipo pro-cáncer.
Sensibilidad de NUGC 4 células a las citoquinas y las moléculas de destrucción celular
para hacer iPS-ML capaz de superar el microambiente del cáncer y para ejercer efectos anticancerígenos
in vivo
, hemos determinado para modificar aún más iPS-ML /anti-HER2 expresar moléculas adicionales. Las citoquinas, tales como IFN, son conocidos por inducir la muerte o inhibir el crecimiento de células de cáncer [29], [30]. Además, se sabe que estas citoquinas para potenciar la actividad anti-cáncer de los macrófagos [31] - [33].
Se analizó la sensibilidad de NUGC-4 células a recombinante IFN-α, IFN-β, IFN -γ, o TNF-α. Después de una incubación de 24 horas en presencia o bien de estos factores (10 ng /ml), se analizó la apoptosis mediante tinción de las células con marcado con FITC anexina-V. Se observó que todas las citocinas ensayadas indujeron ciertos niveles de NUGC-4 apoptosis de las células (Fig. S2A). Para examinar el efecto de reducir el número de vivos NUGC-4 células, se cultivaron NUGC-4 células de luciferasa que expresan durante 3 días en presencia de estos factores. Consistente con los datos de anexina-V-tinción, todas las citocinas ensayadas disminuyeron significativamente el número de vivos NUGC-4 células (Fig. S2B). En ambos ensayos, el IFN-β e IFN-γ mostraron el efecto más profundo.
Generación de IPS-ML /anti-HER2 expresión de moléculas adicionales
generaron vectores de expresión para los lentivirus y los IFN TNF-α, y los introdujo en IPS-ML /anti-HER2. Además, hemos introducido los vectores de expresión de lentivirus para "factores inductores de la apoptosis", FAS-ligando o TRAIL. Hemos sido capaces de generar iPS-ML transfectadas que producen citoquinas en más de 3 ng /24 horas /10
6 células, con excepción de IFN-γ (Fig. S3A). Podríamos generar transfectantes iPS-ML produciendo sólo un bajo nivel de IFN-γ, probablemente debido a la toxicidad de IFN-γ a IPS-ML. la superficie celular expresión de TRAIL en las iPS-ML transfectadas se confirmó mediante análisis de citometría de flujo (Fig. S3 B).
co-cultivadas El IPS-ML /anti-HER2 expresar moléculas anticancerosas adicionales con luciferase- expresando NUGC-4 células y se analizó el número de células vivas NUGC-4 basados en la actividad de la luciferasa después de 3 días (Fig. 4). iPS-ML /anti-HER2 expresar IFN-α, IFN-β, o TRAIL mostró un efecto más profundo para reducir NUGC-4 células de iPS-ML /anti-HER2, y los que expresan IFN-β eran los más potentes. iPS-ML /anti-HER2 expresar IFN-γ o TNF-α exhibió un efecto similar al iPS-ML /anti-HER2. La falta de aumento significativo de los anti NUGC-4-efecto por la transducción de IFN-γ puede ser debido a que la cantidad de IFN-γ producido por iPS-ML /anti-HER2 /IFN-γ era menor que el nivel de ejercer contra efecto: cáncer. En este experimento, la expresión forzada de FAS-ligando se debilitó inesperadamente contra la NUGC-4-efecto de IPS-ML /anti-HER2.
células NUGC-4 de luciferasa que expresan se cultivaron en una placa de cultivo de 96 pocillos (5 × 10
3 células /pocillo) con IPS-ML /anti-HER2 expresar IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, el ligando Fas, o TRAIL (2.5 × 10
4 células /pocillo). El número de vivos NUGC-4 células se midió por análisis de luminiscencia después de cultivo de 3 días. Los datos se indican como la media + SD de ensayos por triplicado.
El efecto terapéutico de los PI-ML /IFN-β en peritoneal diseminada células de cáncer gástrico NUGC-4 en ratones SCID
Con base en los resultados de
in vitro
experimentos, se analizó el
in vivo
anti-NUGC-4 efecto de IPS-ML /anti-HER2 que expresan IFN-α, IFN-β, o TRAIL. El tratamiento con ninguno de IPS-ML /anti-HER2 /IFN-α ni iPS-ML /anti-HER2 /TRAIL mostró claro efecto inhibidor sobre el crecimiento de células cancerosas
in vivo gratis (datos no mostrados). Por otro lado, iPS-ML expresar IFN-β exhibió un efecto significativo para inhibir el crecimiento del cáncer, como se describe a continuación.
En los experimentos mostrados en la Figura 5, el crecimiento de NUGC-4 tumores se monitorizó por bioluminiscencia análisis en días 4, 10 y 17 después de la inoculación de células de cáncer. Los ratones que llevan NUGC-4 tumores en el día 4 se dividieron en grupo de terapia o no-terapia (control). Los ratones de los grupos de terapia se inyectaron i.p. con IPS-ML /IFN-β o iPS-ML /anti-HER2 /IFN-βfrom día 4 (2 × 10
7 células /inyección /ratón, 3 inyecciones por semana). La Figura 5A muestra los datos de imagen de los análisis de la luminiscencia de los ratones. Figura 5B indica el cambio veces de la actividad de luminiscencia desde el día 4 de los grupos de control y tratamiento, lo que demuestra que el crecimiento tumoral fue inhibido por el tratamiento con IPS-ML /IFN-β o iPS-ML /anti-HER2 /IFN-β. IPS-ML /IFN-β e IPS -ML /anti-HER2 /IFN-β era equivalente efectiva, lo que indica que la expresión de anti-HER2 es prescindible para el efecto anticancerígeno de IPS-ML producción de IFN-β.
fueron inyectados NUGC-4 células de luciferasa que expresan en ratones SCID (5 × 10
6 células /ratón). En el día 4, los ratones se sometieron al análisis de imágenes de luminiscencia. Los ratones fueron inyectados en los días 4, 6, 8, 11, 13, y 15 con IPS-ML /IFN-β o iPS-ML /IFN-β /anti-HER2 (2 × 10
7 células /ratón para cada inyección, n = 5 para cada grupo). Como control, 8 ratones se dejaron sin tratar. Todos los ratones se sometieron a análisis de bioluminiscencia en los días 10 y 17. A. Las imágenes de luminiscencia se muestran. B. Para cada ratón, la señal de luminiscencia se calcula como un valor relativo, donde el recuento de fotones en el día 4 se define como 1. La media ± desviación estándar de factor de cambio desde el día 4 en los grupos de control y tratamiento se muestran.
Figura S4 muestra los resultados de experimentos similares para examinar comparativamente los efectos de la IPS-ML, IPS-ML /IFN-β, IPS-ML /anti-HER2, e IFN-β recombinante contra el cáncer NUGC-4
in vivo
. En consonancia con los datos mostrados en la Figura 5, el tratamiento con iPS-ML /IFN-beta suprimió significativamente la progresión del cáncer. Por otra parte, ambos IPS-LD y el IPS-ML /anti-HER2 en vez promueven el crecimiento del cáncer, aunque estadísticamente no significativa. La inyección de 400 ng pero no 200 ng /ratón /inyección de IFN-β recombinante en el mismo horario como la inyección iPS-ML mostraron algún efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral, aunque el efecto no fue estadísticamente significativa.
Colectivamente , simples iPS-ML no mostró efecto anticancerígeno
in vivo
. La modificación genética para producir IFN-β confiere una actividad significativa contra el cáncer de IPS-ML. Por otro lado, la expresión de anti-HER2 scFv no tuvo tal efecto.
El efecto terapéutico de los PI-ML /IFN-β contra el cáncer de páncreas en un modelo de xenoinjerto
A continuación examinó la efecto del tratamiento /IFN-β-ML iPS contra las células de cáncer de páncreas. Además de IFN-β recombinante a la apoptosis inducida MIAPaCa-2 células de cáncer de páncreas humanos y redujo el número de células vivas en
in vitro
experimentos (Fig. S5).
Se examinó el efecto de IPS-ML /IFN-β contra MIAPaCa-2 células
in vivo
. Podríamos establecer un modelo de cáncer peritoneal por vía intraperitoneal inyección de las células MIAPaCa-2 que expresan luciferasa en ratones SCID. En los experimentos mostrados en la Figura 6, 6 ratones fueron tratados con inyección de iPS-ML /IFN-β 3 veces por semana durante 2 semanas a partir de día 4; También se muestran los resultados de los ratones de control 8 sin tratamiento. Hemos observado que el tratamiento /IFN-β iPS-ML inhibió significativamente el crecimiento del tumor MIAPaCa-2 en comparación con los ratones de control. La disminución de la luminiscencia media contar del día 10 al día 17 del control (sin tratamiento) grupo debería haber sido debido al aumento de la ascitis causados por el cáncer, ya que se observó la ampliación progresiva del abdomen en los ratones de este grupo. Los resultados mostrados en la figura 6 sugieren que la terapia con iPS-ML /IFN-β es eficaz contra el cáncer de páncreas. I.p.
se inocularon MIAPaCa-2 células que expresan luciferasa en ratones SCID (5 × 10
6 células /ratón), y los ratones se sometieron a análisis de imágenes de luminiscencia en el día 3. Los ratones injertados con células de cáncer fueron divididos aleatoriamente en tratamiento (n = 6) y control (n = 8 grupos). Los ratones del grupo de tratamiento fueron inyectados con células iPS-ML /IFN-β (2 × 10
7 células /ratón para cada inyección) en los días 4, 6, 8, 11, 13 y 15. Todos los ratones fueron sometidos a análisis de bioluminiscencia en los días 10 y 17. las imágenes de luminiscencia se muestran en A. Para cada ratón, el cambio de señal de luminiscencia por ratón se calculó como un valor relativo, donde el recuento de fotones en día 3 se definió como 1. la media ± SD de las veces el cambio en los grupos de control y tratamiento se muestran en la B.
Discusión
infiltración de macrófagos se observa con frecuencia en muestras clínicas de cánceres sólidos, y estos macrófagos son llamados TAM. En el presente estudio, se observó que i.p. IPS-ML inyectados de manera eficiente acumulan y se infiltraron en los tejidos pre-establecidos de cáncer en la cavidad peritoneal de ratones SCID (Fig. 3).