Extracto
Antecedentes
Es bien sabido que el uso clínico de los fármacos quimioterapéuticos está restringido por las reacciones adversas graves y drogas resistencias. Por lo tanto es necesario encontrar una estrategia para aumentar la eficacia anti-tumor específico de fármacos quimioterapéuticos. La apigenina, un tipo de flavonoides, se ha informado que poseen actividades contra el cáncer con muy baja citotoxicidad con el tejido normal.
Metodología /Principales conclusiones
Nuestros resultados de ensayo de viabilidad celular, Western-Blots y TDT dUTP nick fin de etiquetado-biotina (TUNEL) ensayo demostró mediada por los efectos sinérgicos pro-apoptóticos de una dosis baja de apigenina y paclitaxel en líneas celulares de cáncer humano. Para analizar el mecanismo subyacente, examinamos especies reactivas de oxígeno (ROS) tinción después las células se trataron con una combinación de apigenina y paclitaxel, o cada uno de ellos solo. Los datos de citometría de flujo mostró que superóxidos pero no la reducción de peróxidos acumulados en células HeLa tratado con apigenina o una combinación de apigenina y paclitaxel. La apigenina y la apoptosis de las células HeLa paclitaxel inducida que está relacionada con el nivel de ROS en las células. Además, evaluó la actividad y el nivel de proteína superóxido dismutasa (SOD). Apigenina inhibe significativamente la actividad de SOD, pero no alteró el nivel de proteína SOD lo que sugiere que la apigenina promueve la acumulación de ROS a través de la supresión de la actividad enzimática de SOD. La adición de Zn
2 +, Cu
2 + y Mn
2 + a lisados de células inhibidas efectos de apigenina sobre la actividad SOD. Al mismo tiempo, los datos de la caspasa-2 sobre-expresión y experimentos abatidos demostraron que la caspasa-2 participó en la apigenina y apoptosis de las células HeLa paclitaxel inducida.
Conclusiones /Importancia
Tomados juntos, nuestro estudio demostró que la apigenina puede sensibilizar las células cancerosas a la apoptosis inducida por paclitaxel a través de la actividad de SOD suprimir, que luego dio lugar a la acumulación de ROS y la escisión de la caspasa-2, lo que sugiere que el uso combinado de la apigenina y paclitaxel era una manera eficaz de reducir el dosis de paclitaxel tomada
Visto:. Xu Y, Xin Y, Diao Y, Lu C, J Fu, Luo L, et al. (2011) Efectos Sinérgicos de apigenina y paclitaxel sobre la apoptosis de células cancerosas. PLoS ONE 6 (12): e29169. doi: 10.1371 /journal.pone.0029169
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Julio, 2011; Aceptado 22 de noviembre de 2011; Publicado: December 21, 2011
Derechos de Autor © 2011 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81072433 y 31071000), Jiangsu Mayor Naturaleza Fundación de Ciencias de la Educación Superior (Nº 07KJA18026) y un proyecto financiado por el Programa de Desarrollo Académico prioridad de instituciones de educación superior de Jiangsu. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la quimioterapia es uno de los tratamientos más ampliamente empleadas para el cáncer. Sin embargo, muchos fármacos quimioterapéuticos pueden producir efectos secundarios desagradables, especialmente cuando se toma en dosis altas. Uno de los fármacos quimioterapéuticos, paclitaxel, un inhibidor de la mitosis, pueden dar lugar a reacciones de hipersensibilidad [1], neutropenia [2], la neurotoxicidad [3], trastorno del ritmo cardíaco [4] y otros efectos tóxicos diverso [5], lo cual empeora seriamente la la calidad de vida de pacientes con cáncer y los resultados en la reducción de la dosis y la interrupción del tratamiento. Por tanto, es importante para disminuir los efectos secundarios adversos de los agentes quimioterapéuticos en el tratamiento clínico del cáncer. Además, la resistencia a fármacos en la terapia clínica a menudo interfiere con la eficacia de los agentes quimioterapéuticos.
especies reactivas de oxígeno (ROS), incluyendo, peróxido de radical superóxido de hidrógeno (H
2O
2), radical hidroxilo, óxido nítrico, y varias especies de óxido nítrico derivado de reactivos nitro (RNS) se forman como subproductos naturales del metabolismo normal de oxígeno en las células y tejidos humanos. Debido a su carácter altamente reactivo, tienden a participar en reacciones no deseadas que causan daño a las células y en última instancia conducir a enfermedades. Las células cancerosas presentan una mayor glucólisis en combinación con una tasa reducida de la respiración y estas alteraciones en el metabolismo se han demostrado estar asociados con el estrés oxidativo mejorada [6] - [8]. Un estado redox celular elevada podría estimular la formación de tumores a través de la creación de un entorno de proliferación celular mejorada, la inducción de daño en el ADN, y apagar las funciones de supresión de tumor [9], [10]. El crecimiento del tumor y la migración podrían ser inhibidos
in vitro fotos: por alteración del medio ambiente alrededor de las células tumorales a una mayor reducción de uno. En oposición a esto, un estado redox celular elevada también apoyaría aumento de la apoptosis, lo que inhibe la formación de tumores. Por lo tanto, en células de cáncer, el estado de alta redox podría mejorar su tolerancia a las tensiones ambientales y fármacos quimioterapéuticos. Las células tumorales expresan un mayor nivel de MnSOD indicar un mal pronóstico [11], [12]. Se ha demostrado que las ROS tiene la capacidad potencial para procesar la caspasa-2 [13], [14], que es una caspasa iniciadora llevó a permeabilización de la membrana mitocondrial [15] y es también un miembro importante en la apoptosis amplificación de la señal de bucle [16]. Además, los estudios anteriores en la caspasa-2 ratones noqueado han demostrado que la activación de caspasa-2 se relaciona con ROS acumulación [17]. tasa de apoptosis reducida también se detectó en
caspasa-2
- /-.
ovocitos [18]
La apigenina (4 ', 5, 7-trihidroxiflavona) está ampliamente contenida en muchas frutas y vegetales. Recientemente, se ha informado de que la apigenina tenía un potencial de efectos antitumorales en varias líneas celulares de cáncer humano con baja citotoxicidad y actividad mutagénica. [19] - [21]. La apigenina podría aumentar la acumulación intracelular de ROS y tenía el potencial pro-oxidante [22], [23] y disminuir la actividad de SOD en células de cáncer de pulmón [24].
En el presente trabajo, hemos demostrado que la apigenina podría sensibilizar a las células cancerosas a la apoptosis inducida por paclitaxel a través de la supresión de la actividad de SOD y lleva a la acumulación de ROS y la escisión de la caspasa-2, lo que sugiere el uso combinado de la apigenina y paclitaxel fue eficaz para la terapia del cáncer.
Materiales y métodos
cultivo de células y transfección
línea celular de carcinoma epitelial cervical humano HeLa, A549 epiteliales de pulmón humano línea celular de carcinoma, línea celular de carcinoma de hepatocitos humanos negroide Hep3B, y las células embrionarias de riñón humano (293A) HEK293A obtuvieron del Instituto de bioquímica y Biología celular, Academia de Ciencias de china (Shanghai, República Popular china), se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (Invitrogen) que contiene 10% de suero bovino fetal (Hyclone) y antibióticos (100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) con un 5% de CO
2 a 37 ° C. La transfección transitoria se realizó con un método de fosfato de calcio modificado o usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. En todos los casos, la cantidad total de ADN se normalizó por los plásmidos de control vacías.
Los anticuerpos, regentes y construcciones de ADN
Anticuerpo monoclonal de ratón contra la etiqueta Flag se adquirió de Sigma. anticuerpos policlonales de conejo contra la polimerasa poli ADP-ribosa (PARP), caspasa-3 y β-actina se obtuvieron de Cell Signaling Technology. Ratón anticuerpo policlonal contra la caspasa-2 vino de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos policlonales de conejo contra la caspasa-3 escinde vinieron de Bioworld Technology, Inc. anticuerpo monoclonal de ratón contra anticuerpos SOD1 y policlonales de conejo contra SOD2, Endo G y el AIF se obtuvieron de Abcam. Caspasa-2 inhibidor de benciloxicarbonil-Val-Asp (OMe) -Val-Ala-Asp (OMe) -fluorom etil cetona (z-VDVAD-fmk) se obtuvo de Calbiochem. reactivos de detección de ROS (CM-H
2DCFDA y dihydroethidium (DHE)) y apoptosis de detección Regent (FITC-anexina V y tampón de yoduro de propidio) eran de Molecular Probes ™ (Invirogen). Dimetil sulfóxido era de Amresco. Apigenina, paclitaxel y DETC se adquirieron de Sigma.
pcDNA3.1-flag-caspase2 (WT) y pRNAU6-caspase2 se construyeron mediante el uso de técnicas estándar. pcDNA3.1 se digirió con XhoI y KpnI. Los cebadores (sentido: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sentido: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG) fueron diseñados para generar pcDNA3.1-bandera-caspase2 (WT).
La caspasa-2
gen (NM_032982.2) se sintetizó por Invitrogen. pRNAU6 se digirió con Bam HI y Hind III, y los oligonucleótidos que hibridan recocido ACAGCTGTTGTTGAGCGAA para
caspasa-2
se ligó en el vector [25].
La viabilidad celular y ensayo de TUNEL
para evaluar la citotoxicidad paclitaxel inducida, colorimétrico citotóxica 96 ensayo de citotoxicidad no radiactivo (Promega) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se detecta mediante la medición de lactato deshidrogenasa endógena cuantitativamente.
fin de etiquetado nick dUTP-biotina (TUNEL) ensayo de TdT-mediada se realizó en células HeLa usando Kit Guava® TUNEL tal como se describe anteriormente [26]. Se detectaron las células en un sistema de guayaba EasyCyte ™, y los datos se analizaron mediante el uso de guayaba TUNEL Software (Guava Technologies, Hayward, CA, EE.UU.). Todos los ensayos se realizaron durante tres repeticiones.
Anexina V /PI ensayo
ensayo de anexina V /PI, mediante el uso de anexina V /PI doble tinción de las células no fijadas, distingue entre principios y finales de células apoptóticas apoptóticas /células necróticas. Tanto las células flotaban y unidas se suspendieron en 500 l de tampón de unión (HEPES 10, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM
2, 0,1% BSA). Se añadieron entonces Anexina V-FITC (5 l) y PI (5 l) en cada muestra. Después de 15 min de incubación en la oscuridad, el análisis de citometría de flujo se llevó a cabo usando el Sistema de guayaba EasyCyte ™. Para cada muestra se analizaron 5.000 células. Los datos fueron analizados mediante el uso de guayaba TUNEL Software (Guava Technologies, Hayward, CA, EE.UU.).
Se sembraron
ROS detección
p>
2DCFDA (5 M), durante 30 minutos. Las células se trataron posteriormente con apigenina (15 mM), paclitaxel (4 nM) o ambos de ellos por otros 30 minutos. ROS se detectó mediante el uso de una guayaba EasyCyte ™ y analizó con el software Pro guayaba Express (Guava Technologies, Hayward, CA, EE.UU.). DHE se detectó bajo una emisión dentro de 580 a 583 nm (PM1) y CM-H
2DCFDA se detectó bajo una emisión de 525 nm (PM3).
Aislamiento de mitocondrias y medición de potencial de membrana mitocondrial ( MMP)
mitocondria intacta fue separado de los componentes citosólica de células HeLa para su posterior análisis de proteínas, utilizando mitocondrias kit de aislamiento de Thermo-Pierce Dounce homogeneización y centrifugación diferencial se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.
potencial de membrana mitocondrial (MMP) de las células HeLa se midió utilizando el Kit de guayaba EasyCyte ™ MitoPotential (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. colorante a base de fluorescencia 5, 5 ', 6, 6' tetracloro-1, 1 ', 3, 3' -tetrethyl benzimidalyl carbocianina se utilizó yoduro de (JC-1) para evaluar los cambios de MMP. El colorante impermeant celular 7-AAD se utilizó para monitorizar simultáneamente los cambios de permeabilidad de la membrana celular. Las células teñidas se analizaron en un sistema de guayaba EasyCyte ™.
Ensayo de la actividad superóxido dismutasa
La actividad enzimática de SOD en células HeLa se midió mediante el uso de kits comerciales de acuerdo con el protocolo del fabricante. En este ensayo, la sal de tetrazolio se utilizó para la detección de los radicales superóxido generados por la xantina oxidasa y la hipoxantina. Para medir la actividad de MnSOD, lisados celulares se centrifugaron a 10.000 xg para separar MnSOD de CuZnSOD, y CuZnSOD se inhibió en presencia de cianuro de potasio.
análisis RT-PCR
se extrajo
ARN total mediante el uso de alta Kit Aislamiento de ARN Pure (Roche) de acuerdo con el protocolo descrito por el fabricante. RT-PCR se llevó a cabo utilizando la transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen) con los cebadores indicados (
caspasa-2
, sentido: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sentido: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG; GAPDH, sentido: CATATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC, anti-sentido: GAATTCTTACTCCTTGGAGGCCATGTGG). PCR se realizó a Tm de 58 ° C durante 30 ciclos en mezcla de reacción de 25 ml individual de cada proteína. Productos de PCR fueron resueltos en geles de agarosa al 1% y se tiñeron con bromuro de etidio. El mantenimiento de la casa gen GAPDH se utilizó como control.
El análisis de Western-blot
Los lisados celulares se centrifugaron (15.000 g) a 4 ° C durante 15 minutos. Se realizó el análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [27]. Los complejos antígeno-anticuerpo se visualizaron por el sistema de imágenes LI-COR Odyssey infrarrojos de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando anticuerpos IRDye800 fluoróforo conjugado (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).
Determinación de la sinergia
La combinación de fármacos se determinó por el método de Chou-Talalay. La IC se calculó mediante la ecuación de Chou-Talalay, que tiene en cuenta tanto la potencia (IC
50 o D
m) y el fuerte de la curva dosis-efecto (valor m) [28], [29 ]. El isobolgram clásica (IC = 1) viene dada por: (A)
En los denominadores, (D
x)
1 y (D
x)
2 son las las concentraciones de D
1 (apigenina) y D
2 (paclitaxel) utilizados solos que dan la inhibición x%, mientras que en los numeradores, (D)
1 y (D)
2 son las dosis de apigenina y paclitaxel se utiliza en combinación que isoeffectively inhibir x%. CI & lt; 1, CI = 1, y CI & gt;. 1 sugieren sinergia, aditivo y antagonismo, respectivamente
A partir de la ecuación del efecto mediano de Chou y Chou et al. [29], [30], el (D
x)
1 y (D
x)
2 pueden ser fácilmente calculados. (B)
Aquí D
m es la mediana de la dosis-efecto, que obtiene de la anti-registro de los X-intersección de la gráfica del efecto mediana, X-log (D) versus Y = log [f
a /(1-f
a)] o D
m = 10
- (ordenada en el origen) /m, y m es la pendiente de la gráfica del efecto medio. cálculo automatizado de m, D
m, D
x, y los valores de CI también se permite con el software de la computadora.
El análisis estadístico
Los datos se representan como media ± desviación estándar. Se aplicó la prueba t de Student para analizar la significación estadística de la varianza comparación pareada. En todos los análisis, P & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativa
Resultados
El tratamiento de combinación con paclitaxel de apigenina mejora significativamente la citotoxicidad de las células cancerosas humanas
Desde la toxicidad de paclitaxel es. acoplado a su actividad antitumoral y apigenina se ha informado que tienen actividad antitumoral con baja toxicidad, lo primero que observamos los compañeros de efectos de paclitaxel comcination con la apigenina. células HeLa fueron tratadas con varias dosis de la apigenina, paclitaxel o ambos y a continuación, se detectaron las viabilidades celulares. Como se muestra en la Fig. 1A y B, tanto apigenina y paclitaxel la posología inducidos dependiente citotoxicidad con reducción de aproximadamente el 29% de la viabilidad celular inducida por la apigenina a la dosis de 25 mM (Fig. 1A) y la reducción de 24% inducida por paclitaxel a una dosis de 10 nM (Fig. 1B) respectivamente. Cuando se trataron células HeLa con 15 apigenina M y 4 paclitaxel nM, se detectó más de un 50% de disminución de la viabilidad celular, sin embargo, se observó menos de 20% de disminución de la viabilidad celular en las células tratadas con apigenina o paclitaxel, respectivamente (Fig. 1C). Se llevó a cabo el cálculo de Chou-Talalay para confirmar los efectos sinérgicos de la apigenina y paclitaxel en células HeLa. El índice de combinación (CI) fue de 0,3918 ± 0,0436 a la dosis de 15 apigenina M y 4 nM paclitaxel que indica efectos sinérgicos de la apigenina y paclitaxel. Estos resultados indican un aumento significativo de la citotoxicidad cuando apigenina y paclitaxel se administraron a las células HeLa simultáneamente. También se muestra en la Fig. 1C, combinación de apigenina con paclitaxel indujo a los resultados similares en las células cancerosas distintas de las células Hela incluyendo Hep3B y células A549. Sin embargo, 15 apigenina mu M, 4 nM paclitaxel o su combinación no dio lugar a citotoxicidad para las células HEK293A respectivamente (Fig. 1C). Estos datos sugirieron que había efectos sinérgicos de la apigenina y paclitaxel para matar específicamente células cancerosas
A, las células HeLa se trataron con concentraciones aumentadas de apigenina (0-100 mM) durante 24 horas. Se midió la vitalidad de la célula. El experimento se repitió por tres veces de forma independiente y los datos se muestran como media ± desviación estándar. B, las células HeLa se trataron con concentraciones aumentadas de paclitaxel (0-50 nM) durante 24 horas. vitalidad celular se detectó y se analizó como se describe en A. C, HeLa, A549, Hep3B y células HEK293A se sometieron a tratamiento con apigenina (15 M) combinación con paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. se detectó la vitalidad de la célula como se describe en A. D, las células HeLa se trataron con apigenina o paclitaxel, respectivamente, además, en otros grupos, se añadió a células HeLa apigenina 2 horas antes o después del tratamiento con paclitaxel, o apigenina y paclitaxel se añadieron a las células HeLa al mismo tiempo. TUNEL tinción se realizó y se detecta con un Kit Guava® TUNEL. Números representan el porcentaje de células TUNEL positivas. E, las células se dejaron sin tratar o tratadas como se describe anteriormente en D. En el momento indicado, las células se tiñeron con colorante de anexina V /PI. Los análisis se realizaron en 5.000 células de cada pista. F, células HeLa se trataron con concentraciones aumentadas de paclitaxel o apigenina respectivamente, o ambos de ellos durante 24 horas. A continuación, los lisados celulares se sometieron a transferencia de Western para determinar el nivel de proteína de la caspasa-3 y PARP. V representa vehículo (dimetilsulfóxido). * P & lt; 0,05 en comparación con el grupo no tratado; ** P & lt;. 0,01 en comparación con el grupo no tratado
Se ha informado de que tanto el paclitaxel [31], [32] y apigenina [21] pueden inducir apoptosis celular. A continuación verificamos si el uso de combinación de apigenina y paclitaxel podría inducir la apoptosis más aguda en células HeLa. En comparación con los grupos tratados con paclitaxel apigenina o de forma individual, grupos co-tratada apigenina y paclitaxel mostraron más células de tinción TUNEL positivas. Las tasas de células de tinción positiva TUNEL se incrementaron notablemente del 17,95% en el grupo tratado paclitacel y 19,65% del grupo tratado con la apigenina en torno al 40% en los grupos tratados con la combinación de ellos (Fig. 1D). Para cuantificar la apoptosis, el análisis FACS se llevó a cabo después de la tinción de células con FITC-anexina-V más yoduro de propidio (PI). Los datos mostrados en la Fig. 1E indicó que el número de células supervivientes se redujo gradualmente después de co-tratamiento con apigenina y paclitaxel y sólo menos del 60% fueron sobrevivido 24 horas después del tratamiento apigenina y paclitaxel
.
Puesto que la activación de las caspasas es una razón importante para la apoptosis , que hemos detectado aún más las divisiones de la caspasa-3 y PARP mediante Western blot. Como se muestra en la Fig. 1F, tanto las divisiones de la caspasa-3 y PARP se han mejorado de manera significativa por la apigenina /paclitaxel co-tratamiento en comparación con la apigenina o tratamiento con paclitaxel solo. Estos resultados confirmaron que la apigenina /paclitaxel co-tratamiento indujo una muerte apoptótica significativa de células HeLa que sugieren que el uso de combinación de apigenina y paclitaxel produciría un efecto anti-tumor mejor que el uso de apigenina o paclitaxel solo.
ROS producido por la apigenina es esencial para la apigenina /paclitaxel inducida por apoptosis de las células HeLa
mientras tanto flavonoides incluyendo apigenina fueron ampliamente reconocidos como los antioxidantes, sus propiedades pro-oxidantes también se han reportado [33]. Especulamos los efectos anticancerígenos de la combinación de apigenina /paclitaxel podrían estar relacionados con la producción de ROS en células HeLa inducidas por la apigenina. Por lo tanto, observamos los niveles en células HeLa tratadas con la apigenina, paclitaxel o ambos. Dos colorantes ROS-específicos, DHE y CM-H
2DCFDA muestran especies superóxido y H
2O
2 en las células diana, respectivamente [24]. CM-H
2DCFDA se oxida principalmente por los peróxidos de hidrógeno (H
2O
2) y un radical hidroxilo, DHE se oxida por aniones superóxido (O
2
-). Las células HeLa se tiñeron con DHE y CM-H
2DCFDA seguido por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 2, DHE específica ROS aumentó (Fig. 2A), mientras que CM-H
2DCFDA específica ROS redujo (Fig. 2B) en células HeLa tratadas con apigenina dentro de los 30 minutos. Ningún cambio se detectó en las células tratadas con paclitaxel solo. Una tendencia similar y un cambio más significativo en el estado de ROS 'se observaron en las células tratadas con la combinación de la apigenina y paclitaxel en comparación con las células tratadas con apigenina solo (Fig. 2). tinción DHE observado en estos experimentos dio como resultado de la oxidación por especies superóxido que sugieren que la especie apigenina aumento de la superóxido relacionados ROS en células HeLa.
A, las células HeLa se trataron con apigenina (15 M) solo o junto con paclitaxel (4 nM), para los períodos indicados. Se añadió DHE (5 M) en cultivos celulares 30 minutos antes del tratamiento. tinción de DHE en las células se detectó y se analizó por Guava Sistema EasyCyte ™. tinción de DHE en las células no tratadas se utilizaron como control negativo. B, CM-H
2DCFDA (5 M) tinción se realizó y analizó como se describe en A.
A continuación se evaluó si la apoptosis inducida por el paclitaxel apigenina /dependía de la acumulación de ROS. N-acetil-L-cisteína (NAC), un eliminador de ROS y aprobado, se ha utilizado para antagonizar el efecto de ROS. El tratamiento previo de las células HeLa con 100 mM NAC suprime eficazmente la generación de especies superóxido (Fig. 3A) y significativamente inhibió la apoptosis celular inducida por la apigenina y paclitaxel co-tratamiento (Fig. 3B). Los datos anteriores sugieren que ROS eran esenciales para la apigenina /apoptosis de las células HeLa paclitaxel inducida.
Las células se recogieron entonces y se detectaron por Guava Sistema EasyCyte ™ como se describe en la Fig. 2A. B, las células HeLa fueron tratados con NAC (100 mM) durante 2 horas y después se incubó con la apigenina (15 M) y paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. apoptosis celular se midió por el ensayo de TUNEL como se describe en la Fig. 1.
La apigenina induce la acumulación de ROS a través de la supresión de la actividad de la SOD
Hemos observado que después de las células HeLa fueron tratados con apigenina, la abundancia de especies superóxido aumenta mientras que H
2O
2 se redujo. Teniendo en cuenta SOD era una enzima celular que puede convertir el superóxido en H
2O
2, especuló que la apigenina podría reducir la actividad de SOD y por consiguiente llevado a la acumulación de especies superóxido. Luego investigó el efecto de la apigenina en el nivel de proteínas, así como la actividad enzimática de SOD. Se observó una supresión significativa de ambos CuZnSOD (SOD1) y la actividad MnSOD (SOD2) en células HeLa dentro de los 30 minutos después de la apigenina o apigenina /paclitaxel, pero no tratamiento con paclitaxel (Fig. 4A). Sin embargo, no hubo cambio aparente observada en el nivel de proteínas de CuZnSOD y MnSOD después de la administración de apigenina (Fig. 4B). Por consiguiente, era evidencia de que la apigenina suprime la actividad SOD y por lo tanto induce la acumulación de ROS.
A, las células HeLa se trataron con apigenina (15 mM), paclitaxel (4 nM), o ambos de ellos durante 30 minutos . La actividad de SOD se midió con el kit de detección de SOD Cayman. El experimento se repitió de forma independiente por tres veces y los datos se muestra con la media ± S.D.. * P & lt; 0,05 en comparación con el grupo de control; ** P & lt; 0,01 comparado con el grupo control. B, las células HeLa se trataron con apigenina (15 M) y paclitaxel (4 nM) durante 30 minutos. Los lisados celulares se sometieron a la proteína de transferencia Western para determinar los niveles de SOD1 y SOD2. C, las células HeLa se trataron con apigenina (15 M) durante 30 minutos y se lisaron por sonicación. Los lisados celulares se incubaron con CuCl
2 (8 M), ZnCl
2 (8 M) y MnCl
2 (8 M) durante 30 minutos en hielo. La actividad de la SOD se midieron y se analizaron como se describe en A. D, las células HeLa se lisaron por sonicación y los lisados celulares se incubaron después con iones metálicos mencionados anteriormente para 30 minutos en hielo. se midió la actividad SOD como se mencionó anteriormente. * P & lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con apigenina; ** P & lt;. 0,01 en comparación con el grupo tratado con apigenina
Como resultados anteriores mostraron que la apigenina suprime la actividad de SOD, y se ha informado de que la apigenina podría formar complejos estables con iones metálicos
in vitro
[34], que determina así si apigenina podría formar complejos con iones metálicos y suprimir la actividad de SOD a través de la prevención de SOD de montar con sus cofactores. células HeLa se trataron con 15 mM apigenina durante 30 minutos y los lisados de células se incubaron con 8 M de ZnCl
2 (aq), CuCl
2 (aq) o MnCl
2 (aq), respectivamente, en de hielo durante otros 30 minutos. La actividad de SOD se midió usando el Cayman superóxido dismutasa Kit de ensayo como se describe en Material y Métodos. Como era de esperar, la apigenina suprimió significativamente las actividades tanto de CuZnSOD y MnSOD, pero la actividad aumentó después de CuZnSOD Cu
2 +, Zn
2 +, y Mn
2 + la exposición y la actividad de MnSOD también aumentó obviamente después de Mn
2 + exposición (Fig. 4C). Además, se observó ningún cambio significativo de la actividad de SOD cuando lisados de células fueron expuestas directamente a Cu
2 +, Zn
2 + o Mn
2 + sin tratamiento apigenina (Fig. 4D), lo que indica que estos metales iones no mejora los resultados basales SOD activity.These sugirieron que la apigenina suprime la actividad de SOD probablemente a través de la formación de una formación de complejos estables con los metales en las células [34], y apigenina podrían tener una mayor afinidad de unión a Mn
2 +.
reducción de actividad SOD es crítica en la apigenina /paclitaxel inducida por apoptosis
apigenina inhibe la actividad de SOD y la combinación de apigenina /paclitaxel fue más eficaz en la inducción de la apoptosis de las células cancerosas que cada uno de ellos solo. Con el fin de confirmar que la apigenina disminución inducida de la actividad de SOD fue crítico en la apoptosis desencadenada por la apigenina /paclitaxel co-tratamiento, se observó apoptosis inducida por paclitaxel después de bloquear la actividad de la enzima SOD. DETC (dietiltiocarbamato), un inhibidor bien aprobado tanto de CuZnSOD y MnSOD se aplicó en nuestro presente estudio [35]. Tan similar como la apigenina, DETC suprime la actividad de SOD y mejorada paclitaxel inducida por apoptosis, así (Fig. 5A). Estos datos sugirieron fuertemente que la reducción de la actividad de SOD por apigenina es crítica en la mejora de la apoptosis inducida por paclitaxel.
A, las células HeLa se incubaron con apigenina (15 mM) /paclitaxel (4 nM), o paclitaxel ( 4 nM) junto con o sin DETC 1 mM (un inhibidor de la SOD) durante 24 horas y después las células se sometió a ensayo de TUNEL como se describió anteriormente. B, las células HeLa fueron pretratados con NAC (100 mM) durante 2 horas, seguido por el tratamiento con apigenina (15 M) y paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. La escisión de caspasa-2 fue detectada por análisis de transferencia Western con el control de la β-actina. C, las células HeLa fueron pretratadas con z-VDVAD-fmk (25 mM), un inhibidor específico de la caspasa-2, y luego se trataron con la apigenina (15 M) y paclitaxel (4 nM) durante 24 horas. Los niveles de proteína de PARP escindida y procaspasa-3 se detectaron por análisis Western-blot. D, las células HeLa fueron pretratadas con z-VDVAD-fmk (25 M) durante 30 minutos y luego se trataron con la apigenina (15 M) y paclitaxel (4 nM) durante 8 horas. Las células fueron cosechadas y el potencial de membrana mitocondrial se detectó usando un kit de guayaba EasyCyte ™ MitoPotential y se analizaron por Guava Sistema EasyCyte ™. MMP se mostró como el recuento de células despolariza. El experimento se repitió por tres veces de forma independiente y los datos se muestran como media ± desviación estándar. ** P & lt; 0,01 en comparación con el grupo no tratado. E, células HeLa se incubaron con apigenina (15 M) y paclitaxel (4 nM) durante 24 horas, y después las células se sometieron a análisis RT-PCR. ARNm de GAPDH se utilizó como gen encargado de casa.
La activación de la caspasa-2 es importante para la apigenina /paclitaxel-desencadenó la apoptosis de células HeLa
vía mitocondrial juega un papel importante en ROS activa la apoptosis [36], [37] y la caspasa-2 ha sido considerada como la caspasa apical en mitocondrial bucle amplificación de la señal de la muerte [38], [39]. ROS inducida por la caspasa-2 de escisión y la retroalimentación de amplificación de la señal apoptótica también se han investigado [40]. Para examinar el efecto de la apigenina en ruta mitocondrial de la apoptosis, se detectó la caspasa-2 escisión precursor en apigenina tratados con células HeLa por análisis de western-blot. Co-tratamiento de las células HeLa con apigenina y paclitaxel mostró un nivel muy bajo de la caspasa-2 precursor. Cuando las células HeLa fueron pretratados con NAC, el nivel de precursor de la caspasa-2 se recuperó (Fig. 5B). La caspasa-2 inhibidor z-VDVAD-fmk redujo significativamente la escisión de la caspasa-3 y PARP en células HeLa tratadas con apigenina combinada con paclitaxel (Fig. 5C). MMP puede ser un evento causal en la precipitación de la apoptosis. Los datos en la Fig. 5D indicó que la apigenina pero no paclitaxel indujo un aumento de la despolarización de MMP que sugiere la importancia de la apigenina en apigenina /paclitaxel inducida por apoptosis de las células del cáncer. Como era de esperar, z-VDVAD-fmk inhibe el aumento de MMP en la apigenina y tratada /paclitaxel grupos apigenina (Fig. 5D). Higo. 5E demostraron que el tratamiento de la apigenina, paclitaxel o apigenina /paclitaxel no alteró el nivel de mRNA de la caspasa-2 que indica la apigenina /paclitaxel co-tratamiento sólo aumento de la activación de la caspasa-2.
Para confirmar la importancia de la caspasa 2 en la apigenina /permeabilización de la membrana mitocondrial paclitaxel-desencadenó la apoptosis y, llevamos a cabo la caspasa-2 sobre-expresión y experimentos golpee hacia abajo y midió FIA, Endo G y la liberación de citocromo c de la mitocondria en las células HeLa. El exceso de expresión de la caspasa-2 apigenina significativamente mejorada o apigenina aumento de AIF, Endo G /paclitaxel inducida y el citocromo c de la fracción de citoplasma y la disminución de AIF, Endo G y el citocromo c en la fracción mitocondrial (Fig. 6A). Como era de esperar, la caspasa-2 derribo dio lugar a la opuesta en la apigenina o apigenina paclitaxel inducida por cambios /de FIA, Endo G y citocromo c en las células HeLa (Fig. 6A). Además, como se muestra en la Fig. 6B, la sobre expresión de la caspasa-2 aparentemente aumento de apigenina /escisión paclitaxel inducida de la caspasa-3 y PARP y knock-down de la caspasa-2 inhibe tal efecto de apigenina /paclitaxel. A continuación se detectó la vitalidad celular para evaluar efecto mediado de la caspasa-2 en la apigenina /paclitaxel desencadena apoptosis de las células HeLa. El exceso de expresión de la caspasa-2 causado sobre 10% de disminución de la vitalidad de la célula tanto en los grupos de apigenina y co-tratamiento, y la caspasa-2 silencio aumentado significativamente la vitalidad celular.