Extracto

Antecedentes

Cromosoma Región de mantenimiento 1 (CRM1) es un exportador nuclear y su inhibidor tiene actividad antitumoral en diversos tipos de cáncer. Este estudio evaluó la eficacia terapéutica del nuevo inhibidor de CRM1 KPT-185 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Métodos

líneas celulares de cáncer fueron tratados con KPT-185 para evaluar los cambios en la viabilidad celular, el ciclo celular, la apoptosis y la expresión de proteínas. Los ratones NOD-SCID que llevaban xenoinjertos celulares de cáncer fueron tratados por vía oral con KPT-276, un análogo clínico de KPT-185, para examinar la eficacia y los efectos secundarios de KPT-276 in vivo.

Resultados

KPT-185 redujo significativamente la viabilidad de las seis líneas celulares de NSCLC en un tiempo y manera dependiente de la dosis, incluyendo inhibidor del factor de crecimiento epidérmico receptor tirosina quinasa (EGFR-TKI) H1975 -resistant y líneas celulares H1650GR. Además, KPT-185 indujo estas células de NSCLC para detener en la fase G1 del ciclo celular y la apoptosis causada de una manera dependiente de la dosis. tratamiento KPT-185 también redujo los niveles de proteína CRM1 en seis líneas celulares de cáncer, y la reducción podría ser completamente abolida por el bortezomib inhibidor del proteasoma. KPT-185 activado caspasa 3, 8, y 9, pero la expresión de survivina inhibida en células de NSCLC. En un modelo de xenoinjerto de células H1975 ratón, el crecimiento del tumor se inhibió de manera significativa por la administración oral KPT-276, y no había pérdida de peso corporal significativa de ratón u otros efectos secundarios.

Conclusiones

El estudio actual demostrado los efectos antitumorales de KPT-185 en las células NSCLC, incluyendo líneas celulares de cáncer de EGFR-TKI-resistentes. Estudios adicionales evaluar la actividad antitumoral de KPT-185 en un ensayo clínico para los pacientes con CPNM

Visto:. Wang S, Han X, Wang J, Yao J, Shi Y (2014) Efectos antitumorales de una novela Mantenimiento cromosoma Región 1 (CRM1) inhibidor de células no pequeñas células cancerosas de pulmón in vitro y en xenoinjertos tumorales de ratón. PLoS ONE 9 (3): e89848. doi: 10.1371 /journal.pone.0089848

Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América

Recibido: 18 Agosto, 2013; Aceptado 28 de enero de 2014; Publicado: 4 Marzo 2014

Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción
cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en. el mundo, lo que representa 1,3 millones de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo cada año [1]. Histológicamente, aproximadamente el 85% de los pacientes con cánceres de pulmón son no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [2], la mayoría de los cuales se diagnostican en una fase avanzada de la enfermedad y no elegibles para la cirugía curativa. El tratamiento paliativo incluye quimio y radioterapia y, más recientemente, la terapia de orientación, tal como el factor de crecimiento epidérmico inhibidores de la quinasa del receptor-tirosina (EGFR-TKI) gefitinib, erlotinib, y icotinib. Estas terapias han mejorado la supervivencia de pacientes con NSCLC [3]; Sin embargo, los pacientes que inicialmente responden a los tratamientos EGFR-TKI eventualmente desarrollan resistencia adquirida. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos agentes terapéuticos con baja toxicidad y mejores resultados para los pacientes con NSCLC.

Durante la carcinogénesis humana o la progresión del cáncer, las células malignas adquieren la capacidad de exportar las proteínas nucleares que puedan influir en la eficacia del tratamiento. Estas proteínas incluyen supresores de tumores y los reguladores de la apoptosis celular, se requiere la localización nuclear de que para su función adecuada [4]. Cromosoma mantenimiento región 1 de proteínas (CRM1 o llamado XPO1) es un miembro de la importin β superfamilia de receptores de exportación nuclear (carioferinas). Por otra parte, CRM1 es el principal mediador de las exportaciones nucleares, pueden interactuar con señales ricos en leucina nucleares de exportación (Ness), y proteínas de transporte a través de complejos de poro nucleares al citoplasma [5] - [7], incluyendo EGFR, p53 y el factor nuclear de kappa luz del polipéptido potenciador del gen en las células B inhibidor, alfa (α-I? B) [8] - [10]. Si la actividad de exportación CRM1 mediada está bloqueada, función de la proteína puede ser alterado. Por lo tanto, los inhibidores de CRM1 se podrían utilizar como una nueva clase de orientación terapia contra el cáncer humano. De hecho, hasta la fecha, muchos inhibidores CRM1 de moléculas pequeñas se han desarrollado y con una elevada actividad anti-tumor, tales como leptomycin B (LMB), ratjadone, goniothalamin, N-azolylacrylates, y CBS9106 [11] - [15]. Estos inhibidores de moléculas pequeñas se unen covalentemente al residuo de cisteína (Cys528) en la ranura NES-unión de la proteína CRM1 [16] - [17]. Una fase I de ensayos clínicos de LMB se llevó a cabo, pero LMB no se recomienda para su posterior desarrollo clínico debido a la alta toxicidad y falta de eficacia [18]. A partir de entonces, una serie de análogos de LMB se ha informado con toxicidad reducida [19].

Más recientemente, otra clase de inhibidor de CRM1 ha sido identificado, incluyendo KPT-185 y KPT-276 (Karyopharm Terapéutica Inc .; Boston , MA, EE.UU.). Estos inhibidores son selectivamente inhibidores de la exportación nuclear (SINE), y se han demostrado ser eficaces para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas, leucemia mieloide aguda, linfoma de células del manto, lo que resulta en la inhibición del crecimiento significativo y la apoptosis de las células tumorales sin grave toxicidad [20] - [22]. Mientras tanto, los niveles de proteína CRM1 son elevados en tejidos de cáncer de pulmón en comparación con tejidos pulmonares normales. Por lo tanto, en este estudio, hemos explorado la eficacia terapéutica de estos inhibidores de CRM1 novela-como las drogas (es decir, KPT-185 y KPT-276) en células de NSCLC
in vitro
y
in vivo
es de esperar que proporcionar nuevos penetración en estos fármacos para la terapia futura diana del NSCLC.

Materiales y Métodos

líneas celulares y reactivos

El NSCLC humano líneas celulares A549, H1650, H1975 , H2228, y HCC827 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). La línea celular H1650 resistentes a gefitinib (H1650GR) se estableció en nuestro laboratorio mediante la exposición de la célula a concentraciones crecientes de gefitinib durante 10 meses. La línea celular resultante H1650GR era resistente a gefitinib
in vitro gratis (IC
50 & gt; 30 M). Las líneas celulares de NSCLC se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina 100 U /ml, y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.).

KPT-185 y KPT-276 fueron proporcionados por Karyopharm Terapéutica. El bortezomib se obtuvo de Selleck Químicos LLC (Houston, TX, EE.UU.). El pan-inhibidor de caspasas Z-VAD-FMK se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra EGFR, GAPDH, escindido con la caspasa-3, caspasa-8, escindido con la caspasa-9, poli- (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), survivina, y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) contra IgG de conejo y IgG de ratón se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). Por otra parte, los anticuerpos contra CRM1, el factor nuclear kappa luz promotor de gen del polipéptido de las células B (NF-kB), y I? B-α se obtuvieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Todos los demás reactivos y productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).

viabilidad de las células de ensayo

células de NSCLC se sembraron a una densidad de 6.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche. En el día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco que contiene diluciones en serie de KPT-185 (hasta 10 mM) o dimetilsulfóxido (DMSO) como control. En placas duplicadas, las células NSCLC fueron expuestos a KPT-185, gefitinib, o KPT-185 plus gefitinib. Después de que las células crecieron durante un máximo de tres días, la viabilidad celular se midió utilizando un título de la célula 96® acuoso celular no radiactivo Proliferación de ensayo (Promega, Fitchburg, WI, EE.UU.). El reactivo se añadió a las células y se incubó adicionalmente durante 3 h. A continuación, la absorbancia se midió a 490 nm con un lector de micro-placa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Los datos se resumieron como porcentaje de las células no tratadas (control de DMSO).

ciclo celular y la apoptosis por citometría de flujo ensayo

Después de tratar las células con CPNM con KPT-185 durante 48 h, se tiñeron con propidio yoduro de memoria intermedia (PI) tinción (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE.UU.) durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se midió por citometría de FACS (BD Biosciences, NJ, EE.UU.). Los histogramas de ADN se analizaron utilizando el software de análisis de ciclo celular ModFit LT (verificar Software House). Se detectó

apoptosis de la célula con un 488 anexina V /Dead Cell Apoptosis Kit Alexa Fluor (Invitrogen) según las instrucciones del kit. En pocas palabras, después de tratar con KPT-185 durante 48 h, se recogieron las células de ambos suspensión y la adherencia y co-incubaron con anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) y PI, a continuación, se mide por citometría de FACS (BD Biosciences). El porcentaje de anexina V y PI células negativas se determina en base a los gráficos de puntos de FITC y PI.

El aislamiento de ARN y QRT-PCR

El ARN celular total fue aislado utilizando el RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, NRW, Alemania) y luego transcrito de forma inversa en ADNc utilizando la primera III-strand sistema de síntesis para la RT-PCR (Invitrogen superíndice) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de cDNA se amplificaron aún más por PCR en tiempo real con los siguientes cebadores sintéticos (Invitrogen): CRM1, 5'-GCCTCACTGAGATTGCTGGT-3 'y 5'-TGAAGGGCCTCCATAAGAGT-3'; y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 'y 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'. Las condiciones de PCR se establecieron en una mezcla de reacción que contiene 20 l de ADNc (2 l), cebadores (400 nM cada uno, 1 l) y SYBR verde Master Mix (2 ×, 10 l) (Invitrogen). cDNA se amplificó en un sistema en tiempo real PCR Lightcycler480 (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) con los siguientes ciclos: 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 60 s. Todas las muestras se analizaron por triplicado y se repitieron tres veces. Los niveles relativos de expresión de CRM1 se normalizaron a GAPDH utilizando el método 2-ΔΔCT.

extracción de proteínas y Western blot

Después de tratar las células con KPT-185 durante 48 h, las células se lavaron dos veces con solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron con el tampón NE-PER (Pierce Biotechnology, Waltham, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El sobrenadante (lisado de células enteras) se cuantificó y luego a electroforesis utilizando sodio electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato (SDS-PAGE). Las proteínas se transfirieron entonces a una membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), utilizando electrotransferencia. Después de eso, las membranas se bloquearon con 5% de leche seca desnatada en solución salina tamponada con Tris más Tween 20 (TBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente y después se incubaron con un anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. Al día siguiente, las membranas se lavaron con TBS-T tres veces y se incubaron adicionalmente con un conjugado de anticuerpo secundario-HRP a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar con TBS-T de nuevo, se detectaron las bandas de proteínas con el sustrato de detección Immobilon occidental HRP (Millipore). Las imágenes positivas se registraron con un instrumento de quimioluminiscencia (ProteinSimple, Santa Clara, CA, EE.UU.).

inmunofluorescencia microscopía

La localización y expresión de CRM1, EGFR, I? B-α, NF-kB y p53 se detectaron en la presencia y ausencia de KPT-185 por microscopía de inmunofluorescencia. células de NSCLC se trataron con KPT-185 durante 48 h y se fijaron durante 30 min con paraformaldehído al 4%. A continuación, las membranas celulares fueron permeabilización por tratamiento con Triton X-100 (0,1% w /v) en PBS durante 15 min. Después de bloquear con tampón de bloqueo compuesta de suero normal de cabra al 5% durante 1 h, las células se trataron con anticuerpo primario durante 1 h. Después de lavar con PBS, las células se trataron durante 1 h con un anticuerpo conjugado con FITC secundario y DAPI. fotomicrográficos imágenes se registraron utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón).

Ratón NSCLC ensayo de xenotrasplante de células

Cuatro semanas de edad las mujeres diabéticos no obesos-inmunodeficiencia combinada severa (NOD -SCID) los ratones fueron adquiridos por el Instituto de Zoología de la Academia china de Ciencias, y por vía subcutánea en la región inocularon en el costado con una suspensión de células H1975 (5.0 × 10
6 células). volúmenes de los tumores se midieron tres veces por semana y se calcularon utilizando la siguiente fórmula: volumen (mm
3) = (anchura (mm))
2 x longitud (mm) /2. Una vez que el crecimiento del tumor fue estable (tamaño promedio de 100 mm
3), los ratones se asignaron al azar en 3 grupos y oralmente tratados con vehículo (Pluronic F-68 /PVP-K29 /32), gefitinib (100 mg /kg qd durante 3 semanas) o KPT-276 (100 mg /kg 3 veces a la semana durante 3 semanas) [22]. Curvas de crecimiento de xenoinjertos de células tumorales fueron generados por el trazado de los tamaños tumorales relativos medios +/- SE. cambios de peso corporal (medido tres veces por semana) se expresaron como una proporción con respecto al peso justo antes del tratamiento inicial. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro de una sola dimensión del tumor alcanzó 15 mm o después de la pérdida de 10% de su peso corporal. La importancia de estas diferencias entre los diferentes grupos se evaluó utilizando una prueba de ANOVA. Los niveles de proteína de CRM1, EGFR y survivina en los tumores de xenoinjertos se detectaron mediante inmunohistoquímica. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de Cancer Institute /Hospital de la Academia China de Ciencias Médicas.

Resultados

La inhibición de la viabilidad de las células NSCLC por KPT-185

Para evaluar la actividad anti-tumor de la CRM1 inhibidor KPT-185, se realizaron ensayos de viabilidad celular en seis líneas celulares de NSCLC humanos. Las células se trataron con diluciones seriadas de KPT-185 de 1 nM a 10 mM para 2 y 3 días. Los datos mostraron que KPT-185 redujo la viabilidad celular de NSCLC en una dosis y tiempo dependiente, con una CI
50 de 1,3 nM a 46 mM (Figura 1A-F). En este estudio, cada línea celular CPNM representa un subtipo molecular diferente del NSCLC. Curiosamente, KPT-185 igualmente inhibió la viabilidad de las células H1975 y H1650GR EGFR-TKI-resistentes y células HCC827 EGFR-TKI sensibles, lo que indica que KPT-185 puede ser un buen candidato para el control eficaz de los cánceres de pulmón EGFR-TKI-resistentes . Además, nuestros datos muestran que no hubo un efecto sinérgico entre KPT-185 y el tratamiento de EGFR-TKI (gefitinib) sobre la inhibición de la viabilidad de las células tumorales (Figura 1G & amp; H).

Seis líneas celulares de cáncer fueron tratados con KPT-185 durante 48 h o 72 h. La viabilidad celular fue suprimida por KPT-185 de una manera dosis-y dependiente del tiempo (A~F). KPT-185 inhibió la viabilidad celular en H1975 (G) y las células HCC827 (H) en comparación con el efecto del tratamiento con gefitinib EGFR-TKI. (N = 3).

La inducción de la detención del ciclo celular CPNM por KPT-185

Para determinar si la reducción de la viabilidad celular después del tratamiento KPT-185 se asocia con cambios en la célula la distribución del ciclo en las células NSCLC, que analiza los ciclos celulares en las células NSCLC después de 24 h de tratamiento con KPT-185. En comparación con las células de control, el tratamiento KPT-185 detenido células de NSCLC en la fase G1 del ciclo celular. Sin embargo, este hallazgo no se produjo en células H2228 que no era sensible al tratamiento KPT-185 (Figura 2).

Las células fueron detenidas en la fase G1 del ciclo celular en KPT-185 células sensibles. (N = 3).

La inducción de la apoptosis de las células NSCLC por KPT-185

Dado que el tratamiento KPT-185 inducida por la detención del ciclo celular NSCLC en la fase G1 del ciclo celular, determinado si KPT-185 indujo apoptosis de las células NSCLC. De hecho, nuestros datos muestran que el tratamiento KPT-185 durante 48 h aumentó los niveles de tinción con anexina V de una manera dependiente de la dosis, lo que indica la apoptosis de células (Figura 3A). Por otra parte, el tratamiento KPT-185 inducida por las células H1975 para someterse a la apoptosis, pero gefitinib no tener un efecto. Mientras tanto, tanto KPT-185 y gefitinib indujo apoptosis en células HCC827 (Figura 3B, 3C y amp; 3D). Además, el tratamiento de células con KPT-185 y gefitinib no dio como resultado un efecto sinérgico sobre la apoptosis de células.

Las seis líneas celulares de cáncer se trataron con KPT-185 y luego la apoptosis de las células tumorales se evaluó por citometría de flujo ensayo . Los datos indicaron una inducción dependiente de la dosis de apoptosis de las células después de 48 h de tratamiento (A). KPT-185 apoptosis inducida en H1975 (B) y las células HCC827 (C) en comparación con el tratamiento gefitinib EGFR-TKI. Se mostró una información representativa de ensayo de la apoptosis en células H1975 (D). (N = 3).

regulación a la baja de CRM1 y otras proteínas en las células NSCLC por KPT-185

A continuación, se analizó el efecto de KPT-185 sobre la regulación de CRM1expression en células de NSCLC. El nivel de proteína CRM1 se redujo notablemente después del tratamiento con KPT-185 en las seis líneas celulares de cáncer en comparación con las células control (Figura 4A). Sin embargo, los niveles de CRM1 mRNA fueron mayores en H1975, células HCC827 y H1650GR después del tratamiento con KPT-185 que la de las células control (Figura 4B), lo que indica que la reducción de la proteína CRM1 por KPT-185 no estaba en el nivel transcripcional. a continuación, se investigó si la reducción-KPT-185 expresión de la proteína CRM1 se debió a la activación de la ruta de ubiquitina /proteasoma. células H1975, HCC827, y H1650GR fueron tratados con KPT-185 en presencia o ausencia de bortezomib (10 nM; inhibidor del proteasoma) durante 48 h. En presencia de bortezomib, la reducción de la proteína CRM1 por KPT-185 fue casi bloqueado (Figura 4C), lo que sugiere que el agotamiento de CRM1 inducida por KPT-185 requiere la activación de la vía de la ubiquitina /proteasoma. a continuación, se evaluaron los niveles de varias proteínas que se muestran a ser exportados por CRM1, tales como EGFR, p53, y I? B-α. tratamiento KPT-185 también redujo la expresión de EGFR en las seis líneas celulares de NSCLC (Figura 4D & amp; Figura S1). Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en los niveles de NF-kappa B y I? B-α en estas células, pero I? B-α y NF-kB se acumuló en el núcleo en el grupo de tratamiento KPT-185 en comparación con el grupo control (Figura 4D, 4E & amp; Figura S1). Curiosamente, después del tratamiento con KPT-185, el nivel de p53 se upregulated en las células A549, que tienen un p53 de tipo salvaje, mientras que la proteína p53 se downregulated y confinado al núcleo en H1975 células, que tienen una proteína p53 mutada (Figura 4D & amp; 4E). Mientras tanto, no hubo ningún cambio en los niveles de proteína p53 tanto en el HCC827 y H2228 células, y la proteína p53 no era detectable en las células H1650 y H1650GR (Figura 4D) guía.
Las seis líneas celulares de cáncer se trataron con KPT- 185 de 48 h. La expresión de la proteína CRM1 se había reducido regulado (A & amp; E), mientras que los niveles de mRNA fueron CRM1 hasta reguladas (B, N = 3). En la presencia del inhibidor del proteasoma bortezomib, la reducción de la proteína después del tratamiento CRM1 KPT-185 fue casi bloqueada en H1975, células HCC827, y H1650GR (C). la expresión de EGFR se downregulated después del tratamiento KPT-185. Los niveles de proteínas NF-kB y I? B-alfa no se vieron afectados significativamente. KPT-185 upregulated p53 de tipo salvaje en células A549, downregulated p53 mutante en células H1975, y no hubo ningún efecto en la celda HCC827 y H2228. Además, p53 no se detectó en las células H1650 y H1650GR (D & amp; E, 400 ×).

La inducción de la activación de caspasas en células de NSCLC por KPT-185

Para aclarar aún más los eventos moleculares subyacentes por los cuales KPT-185 apoptosis inducida en células de NSCLC, se analizó la activación y la disociación de caspasas, PARP y survivina después de tratar las seis líneas celulares de cáncer con KPT-185 durante 48 h. Nuestros datos muestran que, en comparación con las células de control, las caspasas-8, -9 y -3, y PARP se activaron o escindido, mientras que la survivina, un inhibidor de la apoptosis, se downregulated en células de NSCLC tratados por KPT-185 (Figura 5A). a continuación, se trataron las células H1975 con 100 mM del inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMK durante 2 h antes del tratamiento KPT-185. Se encontró que la apoptosis de células H1975 inducida por KPT-185 fue inhibida completamente por Z-VAD-FMK (Figura 5B).

Las seis líneas celulares de cáncer se trataron con KPT-185 durante 48 h. Las caspasas-8, -9 y -3 y PARP se activaron o troceados, pero se regulados hacia abajo survivin (A). En presencia del inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMK, la apoptosis inducida por KPT-185 se bloqueó completamente en H1975 (células B, N = 3).

Efecto de KPT-276 de células de NSCLC in vivo

a continuación, evaluaron los efectos de la CRM1 inhibidor KPT-276 (el equivalente a la clínica KPT-185) en células de NSCLC
in vivo
. En primer lugar, trasplantaron células NSCLC H1975 con un EGFR-TKI mutación de resistencia en ratones NOD-SCID. Después se establecieron xenoinjertos de tumores, los ratones se les administró por vía oral con vehículo, gefitinib, o KPT-276 tratamientos. Se encontró que el tratamiento KPT-276 el crecimiento del tumor inhibió significativamente cuando se compara con el vehículo o grupos de xenoinjerto de tumor gefitinib tratados (
P
& lt; 0,05; Figura 6A). Los ratones toleran el administrado por vía oral KPT-276 (100 mg /kg) tratamientos, como se indica por una pérdida de peso 6,64% de media (Figura 6B). Además, los efectos secundarios de la quimioterapia similar, como la diarrea, no se observaron. Los niveles de proteína de CRM1, EGFR y survivina en los tumores de xenoinjertos se detectaron mediante inmunohistoquímica. La expresión de CRM1 se downregulated, y CRM1 se limita a núcleo en grupo de tratamiento KPT-276 en comparación con el grupo de tratamiento de control y gefitinib (Figura 6C). La expresión de EGFR y survivin se downregulated en grupo de tratamiento KPT-276 en comparación con el grupo de tratamiento de control y gefitinib (Figura S2).

células NSCLC H1975 fueron trasplantadas en ratones NOD-SCID. Los ratones con un xenoinjerto de células NSCLC establecido se administraron por vía oral con vehículo, gefitinib, o KPT-276. el crecimiento de xenoinjertos de células tumorales se evaluó durante 30 días. curvas de crecimiento del tumor mostraron una supresión estadísticamente significativa del crecimiento de células H1975 in vivo en comparación con el tratamiento con vehículo o gefitinib (
P
& lt; 0,05; A). Ratones administrados por vía oral KPT-276 (100 mg /kg, tres veces a la semana durante tres semanas) toleró bien el tratamiento (B). El nivel de proteína CRM1was detectó en xenoinjertos de tumores por inmunohistoquímica (C, 400 ×).

Discusión

En este estudio, hemos explorado la eficacia terapéutica de los inhibidores de CRM1 similares a fármacos novedosos en el CPNM células
in vitro
y
in vivo
. Los resultados mostraron que el SINE CRM1 inhibidor KPT-185 reducción de la viabilidad de células NSCLC y las inducidas a experimentar apoptosis de una manera dependiente de la dosis. KPT-185 también exhibió una actividad anti-tumor fuerte en líneas celulares de NSCLC EGFR-TKI-resistentes. Por otra parte, KPT-185 también induce la detención del ciclo celular en la transición G1 /S de control en las líneas KPT-185-sensibles células NSCLC, los niveles regulados hacia abajo de CRM1 y la proteína EGFR, p53 acumulado, I? B-α y NF-kappa B en el núcleo, y caspasas-8 activados, 3, y 9 proteínas en células de NSCLC. La administración oral de KPT-276 inhibió significativamente el crecimiento del xenoinjerto de tumor en ratones NOD-SCID-H1975 de rodamiento, que eran resistentes al tratamiento con EGFR-TKI. Lo más importante, los ratones tolera el tratamiento KPT-276 con una mínima pérdida de peso corporal y sin toxicidad grave. Otros estudios evaluarán los mecanismos moleculares subyacentes de la actividad antitumoral KPT-185 en un ensayo clínico para los pacientes con CPNM.

De hecho, estudios recientes han demostrado que la sobreexpresión CRM1 se asocia con la progresión tumoral y mortalidad en varios cánceres humanos [23]. Por ejemplo, Zhang mostró que CRM1 siRNA llevó a proteína desmontables y la viabilidad de células de linfoma de células del manto reducida (MCL), y Sines inducida CRM1 translocación de proteínas CRM1 en el núcleo, donde se había reducido regulado su expresión [22]; Por lo tanto, estos datos parecen ser opuesto a los antiguos inhibidores de CRM1 [13], [14], [24], [25]. En el presente estudio, hemos demostrado que KPT-185 redujo la viabilidad celular CPNM, la apoptosis inducida, y detuvieron a las células NSCLC en la fase G1 del ciclo celular. Estos datos son consistentes con estudios previos sobre los inhibidores de CRM1 en diferentes cánceres humanos [13], [14], [22] - [25]. Nuestros datos actuales muestran, además, que el inhibidor SINE KPT-185 el regulado los niveles de proteína en las células NSCLC CRM1 través de la degradación del proteasoma inducida por KPT-185 de la proteína CRM1. Por lo tanto, un posible mecanismo citotóxico de los inhibidores de CRM1 es a través de la vía ubiquitina /proteasoma, la reducción de la exportación de proteínas supresoras de tumor (TSP) desde el núcleo hasta el citoplasma, tales como p53, I? B-α y NF-kB. Etchin et al. Además, demostró que los inhibidores de CRM1 podría obligar a la ranura de la proteína CRM1 que usualmente ocupada por la NES, y bloquear la exportación de proteínas CRM1 dirigida [21].

Una serie de estudios han demostrado que la activación de NF-kB es esencial para mantener la viabilidad de las células tumorales, y la inhibición de la actividad de NF-kB por sí solo es suficiente para inducir la muerte celular [26], [27]. Sin embargo, en nuestro estudio, no se observó ningún cambio significativo en la NF-kB y los niveles de expresión de I? B-alfa en las células NSCLC después del tratamiento KPT-185, pero I? B-α y NF-kB se acumuló en parte en el núcleo de KPT-185 grupo de tratamiento. CRM1 se conoce para exportar p53 de tipo salvaje desde el núcleo al citoplasma de las células cancerosas a través de sus NES C-terminal, lo que permite la degradación eficiente de p53 por los proteasomas. En nuestro estudio, encontramos que la inhibición de la actividad de CRM1 por KPT-185 de p53 impedido de salir del núcleo, lo que resulta en la acumulación de p53 nuclear y la estabilización en las células NSCLC A549 p53 gran tipo. En H1975 células, que tienen un p53 mutante, el tratamiento KPT-185 el regulado los niveles de p53 y p53 limita a núcleo. Además, los niveles de p53 eran estables tanto en las células H2228 HCC827 y, lo que sugiere que la apoptosis en estas células es independiente de p53. Sorprendentemente, p53 no era detectable en las células H1650 y H1650GR. La línea celular H1650 ha sido previamente descrita como una línea de células que incorporan tipo mutante de p53 [28].

EGFR regula importantes procesos tumorigénicos, incluyendo la proliferación, resistencia a la apoptosis, la angiogénesis y la invasión, y con frecuencia se sobreexpresa durante el desarrollo y la progresión del NSCLC [29]. EGFR puede ser detectado en el núcleo y se exportan al citoplasma por CRM1. En nuestro estudio, hemos demostrado que la expresión de EGFR se redujo siguiente reducida-KPT-185 expresión CRM1 en las células NSCLC. Noske y col. [30] mostró la asociación inversa con la expresión de EGFR CRM1 en tejidos de cáncer de ovario. Los niveles de expresión de la proteína EGFR se redujeron después de la exposición de las células de cáncer de ovario a leptomycin B (LMB), lo que sugiere que CRM1 juega un papel en la transactivación intracelular de EGFR [30]. Por el contrario, Lo et al. aumento de los niveles de EGFR nuclear detectados después del tratamiento LMB en células de carcinoma epidermoide A431 humanos [31], lo que indica que el aumento de EGFR nuclear por LMB proporciona un mecanismo plausible por el cual las células lanzadera EGFR en la superficie celular a través del complejo de poro nuclear y en el compartimento nuclear.

survivina es un miembro de los inhibidores de la familia apoptosis y protege contra la apoptosis mediante la inhibición directa o indirectamente la activación de caspasas [32]. PARP es un sustrato de la caspasa y su activación conduce a la apoptosis. En nuestro estudio actual, KPT-185 fue capaz de activar las caspasas-8, -9 y -3, PARP, pero inhibir la survivina en los seis líneas celulares de NSCLC. Nuestros datos actual también demostró que KPT-185 fue capaz de inducir apoptosis tanto en células de NSCLC EGFR-TKI-sensibles y resistentes. Además, hemos encontrado que el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMK completamente impedido la apoptosis inducida por KPT-185 en células H1975. Nuestros resultados muestran que la apoptosis inducida por SINE fue dependiente de la activación de caspasas en líneas de células de NSCLC.

KPT-185 se ha demostrado que poseen propiedades farmacocinéticas inadecuados
in vivo
, por vía subcutánea o por vía oral. Sin embargo, KPT-276, estructuralmente relacionada con KPT-185, es adecuada para la terapia oral [22]. Mutka et al. LMB señalado que tiene efectos fuera de la meta contra las proteínas distintas de CRM1 y que estas fuera de objetivo efectos pueden contribuir a los efectos secundarios de LMB (~ 20% de pérdida de peso corporal) [33]. En nuestro estudio, hemos utilizado KPT-276 a una dosis de 100 mg /kg tres veces por semana durante tres semanas para el tratamiento de ratones con xenoinjertos de células tumorales de NSCLC. Se encontró que estos ratones tolerados (menos de 10% de pérdida de peso corporal) el tratamiento. Además, KPT-276 exhibió una alta actividad anti-tumoral en xenoinjertos celulares de NSCLC EGFR-TKI-resistentes. Estos resultados indican que KPT-276 puede ser un inhibidor de CRM1 útil para el tratamiento clínico de pacientes con NSCLC, especialmente para los pacientes de EGFR-TKI-resistente.

información de apoyo
Figura S1.
La localización y la expresión de EGFR, I? B-α, y NF-kB se detectaron en la presencia y ausencia de KPT-185 por microscopía de inmunofluorescencia. La expresión de EGFR se downregulated, y I? B-α y NF-kB se acumuló en el núcleo en el grupo de tratamiento KPT-185 en comparación con el grupo de control (400 ×)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089848.s001 gratis (TIFF)
figura S2.
Se detectaron los niveles de proteína de EGFR y survivina en xenoinjertos de tumores por inmunohistoquímica. La expresión de EGFR y survivin se downregulated en grupo de tratamiento KPT-276 en comparación con el grupo de tratamiento de control y gefitinib (400 ×)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089848.s002
(TIF)

Reconocimientos

Nos gustaría dar las gracias a la empresa Karyopharm Terapéutica Incorporated para proporcionar compuestos SINE KPT, y el Prof. Michael Wang y Zhang Liang de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Houston Texas, EE.UU., para la crítica
comentarios.
El estudio fue presentado como póster en 2013 AACR reunión anual en Washington DC, EE.UU. (Abstract#3444).