Extracto
En este estudio nos centramos en las proteínas sensibles a la gravedad de dos líneas celulares de cáncer de tiroides humana (ML-1; RO82-W-1), que fueron expuestas a un clinostat 2D (Clino), una máquina de azar de posicionamiento (RPM) y a la normalidad 1
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-condiciones. Después de un período de tres (3d) - o de siete días de cultivo (7d) en los dos dispositivos, encontramos ambos tipos de células en crecimiento en tres dimensiones dentro de esferoides multicelulares (MCS) y también células adherentes (AD) al matraz de cultivo restantes, mientras 1
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-control sólo cultivos formaron monocapas adherentes, a menos que la parte inferior de la placa de cultivo fue cubierto por agarosa. En este caso, las citoquinas IL-6 e IL-8 facilitaron la formación de MCS en ambas líneas celulares utilizando la técnica de superposición de líquido al 1
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. ML-1 en las células cultivadas en el RPM o las cantidades liberadas CLINO de IL-6 y MCP-1 en el sobrenadante, que fueron significativamente elevados en comparación con 1
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-Controles. La liberación de IL-4, IL-7, IL-8, IL-17, eotaxina-1 y VEGF aumentó en función del tiempo, pero no fue influenciada significativamente por las condiciones de gravedad. Después de 3d en el RPM o la clino, una acumulación de F-actina alrededor de la membrana celular fue detectable en células de AD de ambas líneas celulares. IL-6 y IL-8 estimulación de células ML-1 para 3d y 7d influyeron en los contenidos de proteína de ß
1-integrina, talina-1, Ki-67, y beta-actina dependiente de la dosis en células adherentes. El contenido de ß
1-integrina se redujo significativamente en AD y muestras de MCS en comparación con 1
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, mientras que Talin-1 se expresa en mayor MCS que las poblaciones de AD. El marcador de proliferación Ki-67 fue elevado en las muestras de AD en comparación con 1
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y muestras de MCS. El contenido de ß-actina de las células R082-W-1 se mantuvo sin cambios. células ML-1 mostraron ningún cambio en la ß-actina en cultivos de RPM, pero una reducción en las muestras CLINO. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la microgravedad simulada influye en la liberación de citocinas en las células del cáncer de tiroides folicular y la producción de ß
1-integrina y Talin-1 y predice un efecto idéntico en condiciones de microgravedad reales.
Visto : Svejgaard B, Wehland M, Ma X, Kopp S, Sahana J, Warnke E, et al. (2015) Efectos comunes en las células cancerosas ejercida por un posicionamiento de la máquina al azar y un clinostat 2D. PLoS ONE 10 (8): e0135157. doi: 10.1371 /journal.pone.0135157
Editor: Yoshiaki Taniyama, Osaka University Graduate School of Medicine, JAPÓN
Recibido: 31 Enero, 2015; Aceptado: July 19, 2015; Publicado: 14 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Svejgaard et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. los autores desean agradecer a la Agencia Espacial alemana (DLR; (DG) BMWi proyecta 50WB1124 y 50WB1524), la Agencia Espacial Europea (ESA, ESA-CORA-GBF-2011 -005 dispositivo proyecto Comparación; ESA-CORA-2013-001 GBF- proyecto TIROIDES 3) (DG) de la Universidad de Aarhus, Dinamarca (DG), la Universidad de Ratisbona (JG), y DGLRM (Programa compañero joven para la SE y GA) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
vuelos espaciales prolongados suelen causar problemas de salud nocivos en los seres humanos. Una serie de efectos del vuelo espacial han sido ampliamente estudiados en el pasado y revisado [1-4]. Algunos efectos pueden explicarse por la fisiología bien conocido; p.ej. la falta de tensión gravitacional sobre los resultados musculatura de la pierna en una rápida pérdida de hueso y músculo, y la falta del vector gravitacional causa problemas relacionados con el equilibrio y los movimientos del ojo [1]. Se ha demostrado que la anulación de la gravedad influye en los mecanismos moleculares de las células directamente [3]. Las células expuestas a la microgravedad real o simulada cambian su gen y la proteína de expresión comportamiento [5-7], aumentar la apoptosis [8, 9], retardar el crecimiento celular [10] y alterar el citoesqueleto [11 a 13]. Por otra parte, se detectaron agregados multicelulares, que se parecía a los órganos de la cual sus células habían sido derivados [14].
En los últimos años se puso de manifiesto que los estudios sobre el comportamiento de las células cancerosas en el espacio podrían apoyar la investigación del cáncer en la Tierra [15]. Ahora bien, es interesante comparar las distintas funciones de las proteínas en la adaptación celular a las condiciones ambientales modificadas (microgravedad). Nos caracteriza diversas líneas de células de cáncer de tiroides humanos cultivados bajo condiciones de microgravedad real y simulada con el objetivo de encontrar posibilidades de reducir la agresividad de células de cáncer [16-18]. Desde experimentos en microgravedad reales posibilidades de vuelo espacial es decir, son raros y costosos [16], una gran parte de los estudios se realizó mediante dispositivos destinados a simular la microgravedad en la Tierra [3, 19]. Sin embargo, cada dispositivo afecta a las células no sólo mediante la prevención de la sedimentación, sino también por las características de su modo de funcionamiento, que incluyen hipergravedad transitoria o vibración [20]. Por lo tanto, se consideró que algunas observaciones hechas en las células cultivadas en un dispositivo de simulación de microgravedad pueden no ser debido únicamente a la prevención de la sedimentación celular, sino también debido a los efectos específicos del dispositivo [18]. Por otra parte, también se observó que los efectos son específicos para los tipos definidos de las líneas de células de la tiroides [21]. Con el fin de investigar la influencia de la gravedad alterada en el nivel celular, se estudiaron diferentes células de cáncer en diferentes dispositivos de simulación de microgravedad de acuerdo con protocolos comparables. Antes de la caracterización de células, humanos tiroides FTC-133, ML-1, y HTU-5 se cultivaron en el posicionamiento de la máquina Random (RPM, Fig 1A) [17], pero sólo FTC-133 células en el RPM y el 2D de rotación rápida -Clinostat (Clino, la figura 1B) [18] y en el espacio [16, 22, 23]. Los experimentos revelaron varios aspectos y apuntaron a las proteínas y citoquinas como principales objetivos de los efectos de la microgravedad [3, 19, 22, 23]
Un citoesqueleto:. Aleatoria posicionamiento de la máquina (RPM) y B:.-2D clinostat
en este estudio se investigó el efecto de la microgravedad simulada utilizando el RPM y los dispositivos CLINO en dos líneas de cáncer de tiroides folicular humanos de células (ML-1, RO82-W-1) de manera paralela ya sea para tres (3d) o siete (7d) días, respectivamente, se cuantificaron las citocinas antes seleccionadas y proteínas del citoesqueleto. Para evaluar el posible papel de las citocinas IL-6 e IL-8 para la expresión de proteínas seleccionadas en células de cáncer de tiroides, se estudió el impacto de la aplicación de IL-6 y IL-8 en Ki-67, SS
1- integrina, talina-1, y las proteínas beta-actina en células adherentes ML-1. Por otra parte, nos hemos centrado en el papel de las citoquinas IL-6 e IL-8 en ML-1 y la formación de esferoides RO82-W-1, utilizando la técnica de superposición de líquido por debajo de 1
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-condiciones [24]. Las citoquinas y las proteínas del citoesqueleto, cuya liberación o expresión se vio alterada, respectivamente, se discuten con respecto a sus funciones específicas en el cáncer de tiroides.
Métodos
Las líneas celulares
ML-1 línea celular.
las monocapas de ML-1 en las células de cáncer de tiroides folicular [25] se cultivaron en cualquiera de las RPM o la clinostat. La línea de células ML-1 derivado de un tumor recurrente de un carcinoma folicular de tiroides (estadio pT4) pobremente diferenciado de una mujer de 50 años de edad [25]. La línea celular tiene un tiempo de duplicación de 4 días. Las células toman la glucosa, la secreción de tiroglobulina, tiroxina, triyodotironina y y son tumorigénicas en ratones desnudos.
UCLA RO82 W-1-línea celular.
La línea celular RO82-W-1 era establecido por Estour
et al
. en 1989 [26]. La línea celular se adquirió de Sigma-Aldrich Chemie (Munich, Alemania). Esta línea celular derivada de la metástasis de un carcinoma folicular en una paciente. Aunque el tumor primario de RO82-W-1 tiroglobulina liberado (Tg) en la circulación, la captación de I131 era menos de 2% [26]. células RO82-W-1 son Tg-positivas y también son tumorigénicas en ratones nude [26].
Los dos líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 a 37 ° C y 5% de CO
2. El medio fue suplementado con 100 mg /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina y 10% de FCS (todos Biochrom, Berlín, Alemania).
Debido a que ambas líneas de células foliculares de tiroides humano malignas habían retenido la capacidad de sintetizar Tg , que representan modelos valiosos para el estudio de carcinomas foliculares humanos.
Cell Culture Procedimiento
24 horas antes de los experimentos, las células de ambos tipos se sembraron en matraces o bien deslizantes (Thermo Scientific, Roskilde, Dinamarca) con una superficie cada vez mayor de 9 cm
2 para el Clino o en frascos T25 (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) con una zona de cultivo de 25 cm
2 para la RPM. fueron asignados al azar a las células para cada tipo de frascos de cultivo para ser cultivada como controles de tierra estáticos (1
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innecesaria cualquier condición) o en uno de los dispositivos. imágenes de contraste de fase fueron capturados. Las imágenes morfológicas para W-RO82-1 células se dan en la Fig 2. clino y los experimentos se realizaron RPM en incubadoras individuales a 37 ° C, y los controles de tierra siempre se mantuvieron al lado de los experimentos en la misma incubadora respectiva, descansando bajo estática 1
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-condiciones. Las células de ambos tipos se recogieron después de días 3d y 7d
A:. Células de cáncer folicular de tiroides cultivadas durante 3d en estática 1
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. Las células proliferaron como monocapa 2D. B: RO82-1 W-células se incubaron durante 3d en el RPM. Las flechas muestran los agregados 3D (esferoides multicelulares; MCS). Los insertos muestran natación esferoides 3D en el sobrenadante. C: AM de forma sobre la Clino después de 3 días. D: células cultivadas durante 7 días en el Clino 1 RO82-W. Las flechas muestran esferoides 3D. El inserto muestra un esferoide flotando en el sobrenadante. E: RO82-W-1 células cultivadas durante 7 días a estático 1
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-Condiciones crecer, así como una monocapa confluente. F: 7 días de edad MCS formada en la RPM (flechas) se pudo detectar y células RO82-W-1 adherentes
Efectos de IL-6 y IL-8 en adherente ML-1. Las células cultivadas en 1
g CD - condiciones
células ML-1 a partir de material congelado se cultivaron en matraces T75 en medio RPMI 1640 hasta que llegaron a subconfluencia (3-5 días). Después se subcultivaron las células en 5 T175 y tan pronto como llegaron a subconfluencia que se subcultivaron de nuevo en 20 matraces T175. Después de conseguir subconfluentes, las células se trataron con medio RPMI vehículo 1640 o con 0,03 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /ml de IL-6 o 1 ng /ml, 10 ng /ml, 45 ng /mL o 100 ng /ml de IL-8 concentraciones, respectivamente [27-29]. También se aplica para el grupo de IL-6 0,03 ng /ml y la IL-8 de 45 ng /ml, debido a que estas concentraciones fueron puestos en libertad en el sobrenadante por las células ml-1 después de 7 días.
10 frascos T175 ( 2 T175 sin IL-6 o IL-8 y 8 T175 con diferentes concentraciones de IL-6 o IL-8) se cultivaron en el incubador (1
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) para 3D, y otro conjunto de 10 T175 para 7d
.
Después 3d 7d o el medio en los frascos de cultivo ha sido descartada, se rascaron las células en 10 ml de DPBS y se centrifuga por 6000 rpm durante 15 minutos. Se retiró el sobrenadante, el sedimento se disolvió en 1 ml de DPBS y se centrifugó de nuevo por 6,000 rpm durante 15 minutos. Los pellets fueron utilizados inmediatamente para la extracción de proteínas, Western blot de beta-actina, ß
1-integrina, Talin-1 y Ki-67 y después de la densitometría [17,19]. Los resultados se dan en la figura 3.
análisis de transferencia Western y se dan los datos densitométricos. A, C: beta-actina, 3d y 7d; B, D: SS
1-integrina, 3d y 7d; E, G: Ki-67, 3 y 7 días; F, H: Talin-1, 3 y 7 días. IL-6 dosis: 0,03 ng /ml; 1 ng /ml; 10 ng /ml y 100 ng /mL. La dosis ng 0.03 /ml es la cantidad máxima de IL-6 liberada por las células ML-1 en el sobrenadante y se mide por MAP (columnas gris oscuro). IL-8 dosis: 1 ng /ml; 10 ng /ml; 45 ng /ml y 100 ng /mL. La dosis de 45 ng /ml es la cantidad máxima de IL-8 liberada por las células ml-1 en el sobrenadante y se mide por el MAP (columnas gris oscuro).
Liquid-superposición técnica
esferoides tumorales multicelulares se produjeron con la ayuda de la técnica de los líquidos de recubrimiento [24]. las células del cáncer de tiroides de la línea de células ML-1 y la línea celular de UCLA RO82-W-1 cosechado de crecimiento adherente monocapas confluentes se sembraron en placas de ensayo de 96 pocillos múltiples de agarosa recubiertas de (Nunc GmbH, Wiesbaden, Alemania) a una concentración de 4000 células /200 l de medio RPMI 1640 y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO
2. Las células se estimularon con vehículo, IL-6 (1 ng /ml, 10 ng /ml y 100 ng /ml) y IL-8 (1 ng /ml, 10 ng /mL y 45 ng /ml). Después de la captura de imágenes en 3D y 7D y los resultados presentados en la Figura 4.
A1-A7: Fase de contraste de imágenes microscópicas tomadas después 3d. células ml-1 cultivadas en pozos de agarosa recubierta, tratados con vehículo o con diferentes dosis de IL-6 o IL-8, respectivamente. A8: esferoide 3 días de edad y adherentes células ML-1 en la Clino. B1-B7: Fotos tomadas después 3d. células RO82-W-1 de cáncer de tiroides cultivaron en pozos de agarosa recubiertas de, tratados con vehículo o diferentes dosis de IL-6 o IL-8, respectivamente. B8: esferoide 3 días de edad y adherentes RO82-W-1 en las células de la Clino. C1-C7: las fotografías tomadas después de 7d. células ml-1 cultivadas en pozos de agarosa recubierta, tratados con vehículo o con diferentes dosis de IL-6 o IL-8, respectivamente. B8: esferoide 7 días de edad y adherente población de células ML-1 después de la incubación en el clino 2D. D1-D7: imágenes de contraste de fase tomadas después 7d. células RO82-W-1 de cáncer de tiroides cultivaron en pozos de agarosa recubiertas de, tratados con vehículo o diferentes dosis de IL-6 o IL-8, respectivamente. D8:. 7 días de edad, MCS y adherente RO82-W-1 en las células después del cultivo en el Clino
Al azar de colocación de máquinas
La RPM se adquirió de ADS, ex Dutch Space , Leiden, Países Bajos (figura 1A). Su construcción y la función se describió anteriormente por van Loon [30]. Se compone de dos marcos giratorios independientes dentro de la otra. En nuestros experimentos, el RPM se hizo funcionar en modo "aleatorio" (60 ° /s), en el que se cambia la dirección de forma continua y al azar. Con el tiempo, el vector de gravedad de la Tierra es anulado. Durante los experimentos, el RPM se cargó con hasta 15 T25 cm
2 frascos que fueron fijados a la placa de tierra de la máquina. En efecto, todos los matraces residían dentro de una distancia de 7,5 cm desde el centro de rotación. En la velocidad relativamente baja (60 ° /s) de la RPM, la fuerza centrífuga experimentada por las células, incluso en los puntos más alejados del centro de rotación se supone que es despreciable [30].
2D clinostat
el dispositivo clino 2D (fabricado por DLR, Colonia, Alemania, Fig 1B) se compone de seis brazos que permiten la rotación de las muestras alrededor de un eje perpendicular a la fuerza de gravedad [31]. Cada brazo giratorio se cargó con 4 frascos de diapositivas, para un total de 24 frascos por corrida. Por Clino, el vector de gravedad es al azar por el giro rápido y constante. Se tuvo mucho cuidado para asegurarse de que todos los matraces fueron seleccionados para clinorotation libre de burbujas de aire que de otra manera inducir el movimiento del fluido caótico. El clino 2D rotación constantemente a 60 rpm genera aceleraciones residuales dentro de la distancia de 3 mm alrededor del centro de rotación en el orden de 0.012
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, mientras que las células situadas en más experiencia distancia de hasta 0.036
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[18, 31]. Aunque el umbral relacionadas con la gravedad de las células cancerosas de la tiroides es desconocido, sólo las células que se ubican dentro de la distancia de 3 mm alrededor del eje de rotación fueron cosechadas para el análisis, lo que significa que estas células habían experimentado una aceleración residual muy baja.
Las medidas de pH
El pH se midió con un Metrohm 827 sin medidor de pH más de 1 hora después de la terminación experimento. Todas las mediciones se llevaron a cabo dos veces, y las muestras se mantuvieron en tubos Eppendorf cerrada hasta de medición para evitar reacciones con los gases atmosféricos.
Fase microscopía de contraste
El microscopio Axiovert 25 (Carl Zeiss Microscopy, LLC, EE.UU.) se utilizó para la observación visual de la morfología de las células. analiza
Western blot
análisis de transferencia Western, inmunotransferencia, y densitometría se realizó de acuerdo con protocolos de rutina [32-37]. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para cuantificar los antígenos: Anti-beta-actina, y anti-Talin-1 se utilizaron a una dilución de 1: 1000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EE.UU.); así como anti-integrina beta
1 anticuerpo (Epitomics, Burlingame, EE.UU.); Ki-67 fue adquirido de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, TX, EE.UU. (dilución 1: 500); el anticuerpo unido a HRP secundario se utilizó a una dilución de 1: 4000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EE.UU.). Se utilizó
Las membranas fueron analizados utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda estadounidenses:; (1:10 dilución de 000 ABR-Affinity BioReagents, oro, EE.UU.) como control de carga gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. , MD, EE.UU.;. http://rsb.info.nih.gov/ij/), para la cuantificación densitométricos de las bandas
F-actina tinción
F-actina fue visualizado por tinción con rodamina-faloidina (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.), según lo publicado anteriormente [36, 37]. Las muestras fueron montadas con Vectashield (Vector, Burlingame, CA, EE.UU.) y se analizaron microscópicamente. Las muestras teñidas F-actina fueron examinados utilizando un Zeiss 510 META invertida microscopio confocal de barrido láser (Zeiss, Alemania), equipado con un Plan-Apocromático 63 × 1,4 objetiva. Longitudes de onda de excitación y emisión fueron: λexc = 488 nm y λem = ≥505 nm para FITC. Posteriormente, las muestras se analizaron con la ayuda del programa de análisis de imágenes Scion Image (versión 1.63 MacOs, Scion Corporation, EE.UU.).
Mediciones de citoquinas por la tecnología de múltiples análisis de perfiles
La liberación de citocinas se investigó a través de múltiples análisis de perfiles (MAP) como se describe anteriormente [18, 22]. Para cada condición, se recogieron cinco sobrenadantes después de 72 h y se almacenaron a -80 ° C hasta el ensayo. El MAP se llevó a cabo por la empresa Myriad RBM (Austin, Texas, EE.UU.), determinaron las citocinas Humana de la MAP selecciones A y B.
medición de citoquinas por análisis de inmunoabsorción enzimática
IL-6, IL-8 y MCP-1 proteínas liberadas de W-RO82-1 en las células en los sobrenadantes de cultivo celular durante RPM y CLINO experimentos se detectaron por ELISA comprado de amp I +; D systems [38]. Las pruebas ELISA se han realizado de acuerdo con los protocolos suministrados por el fabricante.
Evaluación Estadística
SPSS 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para la evaluación estadística. El Mann-Whitney-U-Test se realizó para comparar 1 g y las condiciones de s-g, así como las células y las células MCTS s-g adherentes s-g. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
Las células de las líneas celulares de cáncer de tiroides folicular ML-1 y RO82-W-1 se cultivaron durante 3d y 7d en la RPM, en la Clino 2D y en condiciones de laboratorio estática normal 1
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-condiciones. Hasta el séptimo día, el pH se mantuvo en el rango normal, independientemente de si las células se cultivaron en el RPM, bajo 1
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o en la clino. Sin embargo, las células se mantuvieron en crecimiento en una monocapa sólo si el cultivo se realiza bajo 1
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, mientras que, cuando se cultivan en condiciones de gravedad alterados, las células se dividieron en dos poblaciones de los cuales uno comprende células restantes adherente, mientras que el otro contenida células formadoras de 3D agregados similares a las descritas para las células de FTC-133 [18].
Hemos recibido resultados similares con las células RO82-W-1 y ML-1. Ambos tipos de células proliferadas como las células RO82-W-1 se muestran en la figura 2 como una monocapa adherente (Fig 2A y 2E) y como esferoides multicelulares en la RPM (Figura 2B y 2F) y la clino (Fig 2C y 2D). No hubo diferencias en cuanto a número de esferoides de cada línea celular que surgió en cualquiera de las RPM o la Clino. Ambos dispositivos suministran esferoides de diferentes tamaños (máx. De diámetro 0,4 mm) en ambos puntos de tiempo, como se muestra en la figura 2B, 2C, 2D y 2F. El desprendimiento de células de AD comenzó temprano y desprendimiento de las células y la formación de esferoides se produjo también después de 7d.
Impacto de la IL-6 e IL-8 en células ml-1 crecido bajo 1
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-condiciones
IL-6 (0,03 ng /ml y 1 ng /ml) estimulación aumentó la cantidad de beta-actina y ß
1-integrina en células adherentes mL-1. Por otra parte, IL-8 (1, 10 y 45 ng /ml) aumentó el contenido de proteína beta-actina en estas células, mientras que las dosis más altas solamente (10-100 ng /ml) elevó el contenido de proteína de ß
1-integrina el plazo de 3 días (Fig 3A y 3B).
Después 7d, se encontró un aumento de la proteína beta-actina en todas las muestras tratadas con IL-6, así como en muestras tratadas con 1 y 10 ng /ml IL -8 (figura 3C). El ß
proteína 1-integrina fue inducida por 0,03 ng /ml, así como por 10 ng /ml de IL-6, mientras que sólo 10 ng /ml de IL-8 inducida por la cantidad de la proteína después de un día de estimulación 7 (Fig 3D).
Además, ambas citoquinas (IL-6 e IL-8, todas las dosis) indujo una elevación del contenido de proteína Ki-67 después de 3d (Fig 3E). Después 7d, todos IL-6 dosis, así como 1 ng /mL y 100 ng /ml de IL-8 aumentaron la cantidad de proteína Ki-67 en ML-1 en las células (Fig 3G). Por el contrario, el contenido de proteína talina-1 se redujo claramente por la IL-6 y IL-8 aplicación al medio. Las dosis bajas de IL-6 y todas las dosis de IL-8 fueron efectivos (Figura 3F) durante los 3 días-1
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-experiment. Otro resultado fue encontrado después de 7d. IL-6 estimulación resultó en un incremento de Talin-1 (Fig 3H). Un hallazgo similar se observó en muestras tratadas con IL-8 (1, 10 y 45 ng /ml) de la línea de células ML-1.
Estos experimentos definidos En primer lugar, el óptimo de IL-6 e IL-8 las dosis para la expresión de proteínas distintas en virtud de 1
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-condiciones y en segundo lugar, las dosis para poner a prueba su impacto en la formación de MCS usando el método de superposición de líquido (véase más adelante y en la figura 4).
impacto de la IL-6 e IL-8 en la formación de esferoides menores de 1
g
-condiciones
Después de 3d, células ml-1 sólo mostró agregados de células sueltas, cuando se cultiva en 1
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-condiciones de agarosa. 10 y 100 ng /ml de IL-6 y 1, 10 y 45 ng /ml de IL-8 tratamiento resultó en una mejor agregación de las células ML-1 a esferoides, cuando son cultivadas en los pocillos de agarosa recubiertas de (Liquid-overlay técnica) (Fig 4A1-4A7). RO82-W-1 en las células formaron grandes agregados irregulares después de un 3-día-incubación en pocillos de agarosa-revestido. Ambas citoquinas mejoran la formación de RO82-W-1 esferoides multicelulares utilizando el método de superposición de líquido (Fig 4B1-4B7).
Después de 7d, las células ML-1 mostraron agregados celulares formados irregulares en agarosa. Los grupos tratados con citoquinas contenían varios esferoides densos después de una semana de la estimulación (Fig 4C). Los esferoides ML-1 formado en la clino fueron similares a las esferoides de líquido de superposición tratados con 45 ng /ml de IL-8 (Fig 4C7 y 4C8).
Después 7d, las células RO82-W-1 crecieron en forma de esferoides multicelulares densos, así como células individuales que nadan en el sobrenadante en pocillos de agarosa-revestido. aplicación de citocinas al medio mejorado ligeramente el tamaño de los esferoides (Fig 4D1-4D7).
Los esferoides de ambos tipos de células formadas después de IL-6 y IL-8 tratamiento mostraron una morfología similar que el MCS producido después de de incubación en el Clino (figura 4A8, 4B8, 4C8 y 4D8).
la liberación de citoquinas por las células ml-1
la medición de las citoquinas de la citocina humana selecciones MAPA a y B se detectó IL 4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-17, MCP-1, VEGF-a y eotaxina-1 en los sobrenadantes de los distintos cultivos celulares. Se midió aproximadamente 32 pg /ml de IL-4 e IL-7 en los sobrenadantes de cultivos de células de 3 días de edad, con independencia de si las células habían sido incubadas en el RPM, en el clino o en el estacionario 1
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-control. Después de un 7-día-exposición, los sobrenadantes de cultivo celular contenían alrededor de 47 pg /ml de IL-4 y aproximadamente 43 pg /ml de IL-7, independientemente de las condiciones de cultivo (Fig 5A y 5C). Un fenómeno similar se observó con respecto a IL-8 y VEGF-A. Acerca de 710 pg /ml de VEGF-A y 11.000 pg /ml de IL-8 se encontraron en los sobrenadantes de cultivos de 3 días de edad, con independencia de si las células habían sido incubadas en el RPM, en el clino o bajo estacionario 1
g
-condiciones. Después de un 7-día-exposición, VEGF-A e IL-8 concentraciones se mejoraron para alrededor de 3000 pg /ml VEGF-A y alrededor de 35.000 pg se detectaron /ml de IL-8, de nuevo sin diferencia significativa con respecto a las condiciones de cultivo (Fig 5D y 5F). En conjunto, la figura 5A, 5C, 5D y 5F muestran que el contenido de IL-4, IL-7, VEGF-A e IL-8 en los sobrenadantes de cultivo se han mejorado en los 7 días de muestras en comparación con el 3- día-muestras, mientras que una influencia significativa de la exposición de las células a la RPM o la clino no podía ser visto para estos 4 tipos de citoquinas
a:. IL-4, B: IL-6, C: IL- 7, D: IL-8, e: MCP-1, F: proteínas VEGF-a liberadas por las células ml-1 en el sobrenadante después de una de 3 y 7 días de la exposición a la RPM o la clinostat 2D, determinado por Multi Profiling -Analyte del sobrenadante. RPM: Random máquina posicionadora; Clino: 2D clinostat; * P & lt; 0,05
Por el contrario, la acumulación de IL-6 y MCP-1 en los diferentes sobrenadantes de cultivo claramente depende de las condiciones de cultivo. Una liberación de 27 y 33 pg /ml de IL-6 se encontró en los sobrenadantes de muestras RPM después de 3d y 7d de cultivo, respectivamente, mientras que una cantidad de 22,5 pg /ml de IL-6 se midió en relevante 1
g
-Controles (figura 5B). Del mismo modo, se encontró una concentración de 24 y 36 pg /ml de IL-6 en los sobrenadantes de las muestras después de un CLINO-día-experimento 7 de 3 y, respectivamente, mientras que sobre una cantidad de 25 pg /ml de IL-6 se midió en relevante 1
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-Controles (figura 5B). Además, los niveles de proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1) cambiar, cuando el cultivo de células se llevó a cabo en los dispositivos de simulación de microgravedad. En condiciones normales de gravedad, sobre 600 pg /ml de MCP-1 se encontraron después de 3 días y entre 700 y 750 pg /ml después de 7 días, mientras que las concentraciones de MCP-1 aumentó 750 a 950 pg /ml en el RPM y de 700 a 1000 pg /ml en el Clino (figura 5E).
Además de los seis citoquinas que se muestran en la figura 5 se investigaron en busca de citoquinas como se muestra en la Tabla 1. sin embargo, no se detectó más citocinas liberadas en el sobrenadante durante 3 días de cultivo celular bajo cualquier condición. La liberación de IL-17 y eotaxina era detectable en muestras cultivadas durante 7 días en la clino, en el RPM, así como en el suelo con diferencias significativas a concentraciones de alrededor de 1 pg /ml (IL-17) y 15 pg /ml (eotaxina) (Tabla 1).
la liberación de citoquinas por W-RO82-1 en las células
Se investigó la liberación de citoquinas seleccionados en el sobrenadante de W-RO82-1 en las células después de un 3-día-exposición a la RPM o los dispositivos CLINO. La cantidad de IL-6 fue significativamente elevado de 56,9 pg /ml a 75,2 pg /ml en el RPM (Fig 6A). Se obtuvo un resultado similar para IL-8 (Fig 6B). aumentos no significativos para ambas citocinas se midieron para las CLINO-muestras.
La secreción de MCP-1 de las células RO82-W-1 fue mucho menor que la liberación de células ML-1 (figuras 5E y 6C ). Cultura de RO82-W-1 en las células de la RPM o la Clino mitigado por completo la liberación de MCP-1 (figura 6C)
A:. IL-6, B: IL-8 y C: MCP 1 proteínas liberadas por las células RO82-W-1 de cáncer de tiroides en el sobrenadante después de un 3-día-exposición a la RPM o la clino 2D, determinado por la técnica de ELISA. RPM: Random máquina posicionadora; Clino: 2D clinostat; * P & lt;. 0,05
Efectos de la microgravedad simulada en el citoesqueleto
Dado que los estudios anteriores han demostrado que las proteínas del citoesqueleto de diferentes tipos de células se ven gravemente afectados por la microgravedad [11-13, 37, 39-41], se realizó la tinción de actina F en las células cultivadas en el RPM y en la Clino 2D para 3D y 7d. Después de 3 días, una acumulación de F-actina a lo largo de la membrana celular exterior era visible en células ML-1, así como en las células cultivadas en el clino y la RPM (Fig 7) 1 RO82-W-. Después de 7 días, las células fueron completamente confluentes y overgrew entre sí. Un engrosamiento de la membrana externa se encontró bajo las dos condiciones (1
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y simulados de microgravedad), pero fue más pronunciada en el RPM y el clino
AC:. ML-1 3-día -experimentar. R: ML-1 células, 3d, 1
g
Condición: a células normales con normalidad citoesqueleto de actina F B: células ML-1, 3d, la acumulación de F-actina en la membrana celular externa (flechas amarillas ) después de la exposición-RPM. La flecha blanca señala el desprendimiento de agregados de células de la capa de células adherentes. C: células ML-1, 3d, capas más gruesas de F-actina en la membrana celular externa (flechas amarillas). D-F: ML-1 de 7 días de experimento. D: células ML-1, 7d, 1
g
innecesaria cualquier condición: las células normales confluentes con el citoesqueleto de actina F normal. E: Las células ML-1 cultivadas en el RPM para 7d reveló capas más gruesas de F-actina en la membrana externa (inserto). F: A 7-día-exposición de células ML-1 a la clino inducida por cambios similares del citoesqueleto de actina F. El inserto muestra fibras ticker F-actina en las membranas celulares. G-I: RO82-W-1 3-día-experimento. G: normales citoesqueleto de actina F de las células RO82-W-1. H: Formación de MCS (flechas amarillas) después de un 3-día-incubación en la RPM. Una acumulación de F-actina en la membrana celular externa es visible (flechas amarillas). I: RO82-W-1 se cultivaron durante 3d en el clinostat reveló una clara engrosamiento de las fibras F-actina (flechas). Insertar: AM de 3D. J-L: RO82-W-1 7-día-experimento. J: citoesqueleto de actina F de las células confluentes RO82-W-1 cultiva en 1
g
. K, L: la formación de MCS W-RO82-1 en las células después de rpm- (K) y Clino-exposición (L). Las flechas indican el MCS 3D y un engrosamiento de las fibras de actina F en las membranas externas.
análisis de Western blot de la β-actina en células ML-1 revelaron una disminución después de 7d clinorotation (figura 8A ), pero la proteína se mantuvo sin cambios después de 7d de RPM-exposición. La exposición de las células ML-1 a las RPM y clinostat inducida por una disminución significativa de β
1-integrina en AD y células MCS después 7d (Figura 8B). proteína Talin-1 se redujo significativamente en células de AD solamente, cuando se incubaron las células ML-1 en la clino (Fig 8C). Ki-67 proteína, una proteína nuclear, asociada con el proceso de proliferación celular, se elevó significativamente en células de AD en comparación con los MCS y 1
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-control células en ambos dispositivos (Fig 8D).
análisis de transferencia Western de AD: células ML-1 después de un 7-día-exposición en el RPM y clino. A: ß-actina, B: ß
1-integrina, C: talina-1 y D: Ki-67 proteínas. diferencias claras entre los dos dispositivos se encuentran a ß-actina. Western blot análisis de E-H: RO82-1-W células después de un 7 días de la exposición sobre la RPM y Clino. E: ß-actina, F: ß
1-integrina, G: Talin-1 y H: Ki-67 proteínas. No hubo ningún cambio en el contenido de beta-actina de RO82-W-1 células cultivadas en el RPM o la clino para 7d. La cantidad de ß
1-integrina y Ki-67 fue comparable a los cultivos ML-1 cultivadas en s-μ
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. * P & lt;.
0,05
No se encontró cambio en la beta-actina en W-RO82-1 en las células después de un 7 días de la cultura en la RPM o la Clino (figura 8E). El contenido de proteína de beta-actina se mantuvo constante.