Extracto
La activina y TGF comparten SMAD cánceres de colon y de señalización pueden inactivar ya sea vía solo o simultáneamente. Los efectos diferenciales de la activina y TGF señalización en el cáncer de colon no se han disecado previamente. Un objetivo clave de aguas abajo de la señalización de TGF es el p21 inhibidor CDK2 (p21
CIP1 /WAF1). Aquí, evaluamos los efectos de activina-específica sobre la regulación de p21 y funciones resultantes. Encontramos que TGF es un inductor más potente de supresión del crecimiento, mientras que la activina es un inductor más potente de la apoptosis. Además, la supresión del crecimiento y la apoptosis por ambos ligandos dependen de SMAD4. Sin embargo, la activina regula a la baja la proteína p21 de forma independiente SMAD4 en conjunción con el aumento de la ubiquitinación y la degradación proteasomal para mejorar la migración, mientras que TGF regula al alza de p21 en una forma dependiente de SMAD4 a afectar a la detención del crecimiento. la supresión del crecimiento inducida por la activina y la muerte celular dependen de p21, mientras que la migración inducida por la activina es contrarrestado por la p21. Además, los cánceres primarios de colon muestran una expresión diferencial de p21 en consonancia con su
ACVR2 /TGFBR2
el estado del receptor. En resumen, nos informan de p21 como activina objetivo diferencialmente afectados /TGF y mediador de las funciones-ligando específico en el cáncer de colon, que puede ser explotada para la futura estratificación del riesgo y la intervención terapéutica
Visto:. Bauer J, JC Sporn , Cabral J, Gómez J, B Jung (2012) Efectos de la activina y TGF sobre p21 en el cáncer de colon. PLoS ONE 7 (6): e39381. doi: 10.1371 /journal.pone.0039381
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: 21 de mayo de 2012; Publicado: 26 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Bauer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de el Servicio de Salud Pública de Estados Unidos DK074019 a BJ, los Institutos nacionales de Salud de subvención R01CA141057 y P30 CA060553 ARRA a BJ, las Enfermedades digestivas UCSD Centro de Investigación para el Desarrollo DK080506 a BJ, y el Robert H. Lurie Centro de cáncer Integral subsidio de apoyo P30 CA060553 a BJ. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
activina es un miembro de la superfamilia TGF que regula la diferenciación celular, la proliferación y la apoptosis en muchas células epiteliales y mesenquimales [1]. De manera similar a TGF, activina utiliza dos tipos de receptores de la superficie con intracelular SMAD2, 3 y 4 para la transducción de señal. receptor de activina 1 (ACVR1B) y activina receptor 2 (ACVR2) son proteínas transmembrana con actividad de unión a ligando extracelular y la actividad serina /treonina quinasa intracelular. ACVR2B no sustituye las funciones de señalización y de ACVR2 [2].
En particular,
fue encontrado ACVR2
mutado en la mayoría de los cánceres colorrectales con inestabilidad de microsatélites de alta frecuencia (MSI-H) , principalmente debido a un desplazamiento del marco en el a
8 vías del exón 10 [3], [4]. Restauración de la señalización de la activina, se produce la supresión del crecimiento, detención del crecimiento y la inducción de la migración cuando
ACVR2
se complementa [5]. Hemos demostrado anteriormente alta frecuencia de
ACVR2
mutaciones en muestras de cáncer de colon MSI-H en relación con la pérdida de la expresión de la proteína ACVR2 [6] y mostró que la pérdida de ACVR2 se asocia con tumores de colon más grandes y pobres grado histológico [7 ]. Tanto
ACVR2
y
TGFBR2
mutaciones comúnmente ocurren simultáneamente en los cánceres MSI [6], y las líneas celulares también pueden perder tanto TGF y la señalización activina [8]. Curiosamente, ambos receptores se inactivan con menor frecuencia en los cánceres de colon del SMS, que tienden a tener un peor pronóstico que los cánceres de colon MSI-H [9], y las dos vías pueden ser dirigidos de manera independiente. Hasta la fecha, se sabe poco acerca de la contribución específica de la señalización de activina al desarrollo del cáncer de colon y metástasis y, específicamente, cómo TGF y activina efectos de señalización difieren a pesar de señalización intracelular SMAD idénticos.
p21 (también conocido como p21
CIP1 /WAF1) es un inhibidor de quinasa detención del ciclo celular de control dependiente de ciclina través de la inhibición de CDK1 y 2 y es un regulador maestro de múltiples vías de supresores de tumores a través de tanto dependiente de p53 y mecanismos independientes [10]. Es un conocido gen diana de TGF en el cáncer de colon [11], y se ha asociado con la detención del crecimiento activina inducida en células de cáncer plasmacítica y de mama [12], [13], pero los efectos de la activina en p21 en células de cáncer de colon como no se han evaluado las consecuencias así como aguas abajo.
en este estudio, hemos explorado los mecanismos de TGF y activina sobre la regulación de p21 y los consiguientes efectos funcionales de los mismos en los cánceres de colon. Se encontró que a pesar de señalización Smad intracelular idénticos, TGF y activina regulan p21 a través de diversos mecanismos que son funcionalmente relevante en el cáncer de colon que conduce a más apoptosis o la reducción en la supresión del crecimiento dependiente de la activina /TGF señalización de estado con p21 como diana regulados diferencialmente.
resultados
En presencia de SMAD4, TGF es un inductor más potente de supresión del crecimiento Mientras que la activina es un inductor más potente de la apoptosis
Para probar y comparar los efectos de la activina y TGF sobre el crecimiento celular, que utiliza líneas celulares de cáncer de colon en diferente estado de SMAD4 como se describe en otro lugar [22], [23] además de SMAD4 caída. El
ACVR2
/
TGFBR2 /SMAD4
tipo salvaje de microsatélites estables de colon línea celular de cáncer de FET y
ACVR2 /TGFBR2
tipo salvaje /
SMAD4
-null SW480 células de cáncer de colon fueron tratados con activina o TGF y el crecimiento celular se evaluó. Como un control adicional, SMAD4 fue derribado a través de siRNA en células FET que fueron tratadas y analizadas en consecuencia. Mientras tanto activina y tratamiento TGF condujeron a la supresión del crecimiento significativo en
SMAD4
FET de tipo salvaje, el efecto fue más pronunciado después del tratamiento con TGF. En cambio, ni ligando era de supresión del crecimiento en ausencia de SMAD4 en
ACVR2 /TGFBR2
tipo salvaje /
SMAD4
células de cáncer de colon SW480 -null o siguientes SMAD4 caída en
SMAD4
FET células de tipo salvaje (Figura 1A).
A) Después de
ACVR2 /TGFBR2 /SMAD4
tipo -wild FET, las células FET siguiente transitoria caída SMAD4, y
ACVR2 /TGFBR2
-wild tipo /
SMAD4
células SW480-null fueron tratados con vehículo (control), activina o TGF durante 24 horas, se evaluó la actividad metabólica mediante ensayo de MTT crecimiento. Supresión del crecimiento se produjo sólo en presencia de SMAD4 siguiente tanto activina y tratamiento TGF (*** p & lt; 0,001). Además, TGF condujo a un aumento significativo en la supresión del crecimiento en comparación con la activina (*** p & lt; 0,001). B) Para determinar la tasa de apoptosis, un ensayo de TUNEL se realizó en
SMAD4
tipo -wild FET,
SMAD4
-KD FET, y
SMAD4
células SW480-null tratados con vehículo de control (C), activina (A), o TGF (T). La apoptosis se determinó por TUNEL-etiquetado de los cuerpos apoptóticos. C) La normalización [% apoptótica cuerpos /núcleos] reveló que activin- y la apoptosis inducida por TGF produjo principalmente en
SMAD4
tipo -wild FET y no en
SMAD4
-KD FET o
SMAD4
SW480 -null células de cáncer de colon. En las células que expresan SMAD4, activina induce apoptosis en un grado mayor que TGF (* p & lt; 0,05). D) Los fragmentos de ADN intracelulares marcadas con BrdU, indicativo de la apoptosis, se determinaron 24 horas después del tratamiento activina o TGF de
SMAD4
células de cáncer de colon de tipo FET -wild, células FET con EK p21, las células FET con SMAD4 KD y
SMAD4
células de cáncer de colon SW480 -null. Aumento de la fragmentación de ADN se observó después de activina y tratamiento TGF sólo en las células de tipo salvaje SMAD4, con activina inducir más fragmentación en comparación con TGF. En presencia de SMAD4, p21KD conducir a un aumento basal en la apoptosis, pero el plomo tratamiento activina para no la inducción de la apoptosis. SMAD4 knockdown como resultado la pérdida de la apoptosis en las células FET similar a los efectos observados en el
SMAD4
células SW480-null (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001)
. inducción de la apoptosis
a continuación, comparamos de cualquiera ligando en presencia y ausencia de SMAD4 o p21. Activina induce apoptosis en un grado mayor que TGF y la apoptosis sólo se produjo en presencia de SMAD4 (Figura 1B, C). SMAD4 dependencia /p21 se confirmó mediante un ensayo de apoptosis alternativa determinar BrdU-etiquetado de los fragmentos de ADN intracelulares. La apoptosis se incrementó después de la activina y el tratamiento TGF en células FET positivo SMAD4, con activina inducir un mayor grado de apoptosis. No se observó la inducción de la apoptosis, ya sea con ligando en
SMAD4
células SW480-null o células FET siguientes SMAD4 caída paralela a los experimentos TUNEL (Figura 1 B, C). desmontables p21 en
SMAD4
células FET tipo salvaje dio como resultado la pérdida de la inducción de la apoptosis (Figura 1D).
En conclusión, estos datos sugieren que aunque la activina y TGF comparten la señalización intracelular SMAD, cada favorece distinta efectos fisiológicos aguas abajo a dosis consistentes. Además, se muestra que tanto la supresión del crecimiento y la apoptosis inducida por cualquiera de ligando son SMAD4-dependiente.
activina Regula p21 nuclear en forma independiente
SMAD4
Uno de los conocidos de crecimiento de supresión de genes diana TGF es p21, que se regula positivamente después del tratamiento TGF en células de cáncer de colon FET [11]. El efecto de la activina en p21 en el cáncer de colon no se ha evaluado. Para analizar los efectos aguas abajo de la señalización de la activina SMAD4 dependiente, se determinó la expresión de p21 después del tratamiento activina comparación con el tratamiento TGF. Contrariamente a los efectos de TGF previamente conocidas en p21, no encontramos aumento de la transactivación p21 y sólo un modesto incremento en la transcripción después del tratamiento activina, en presencia de SMAD4, mientras que TGF marcadamente inducida tanto transactivación p21 específico y la transcripción cuando SMAD4 estaba presente (Figura 2A). Con respecto a la expresión de la proteína p21, se encontró que en contraste con TGF, el tratamiento activina disminuyó p21 nuclear total y con independencia de la presencia de SMAD4, mientras que p21 citosólica se mantuvo relativamente constante (Figura 2B). A fin de analizar la regulación de la proteína p21 por la activina, se realizó un curso de tiempo que muestra que después de una ligera regulación al alza inicial, la proteína p21 está regulada negativamente por 24 horas después del tratamiento activina (Figura 2C, dos carriles de la derecha adyacentes).
)
SMAD4
tipo -wild FET y
SMAD4
células de cáncer de colon SW480-null fueron tratados con vehículo (control), activina o TGF durante 24 horas. transactivación p21-específica se determinó usando un ensayo de luciferasa dual con PWWP-luc y pRL-TK (panel izquierdo) y los niveles de mRNA de expresión de p21 fueron cuantificados por qPCR y normalizado a L19 (panel derecho). Aunque TGF notablemente inducida tanto la transactivación p21-específico y la transcripción en presencia de SMAD4, no se encontraron aumento de transactivación de p21 y sólo un modesto incremento en la transcripción tras el tratamiento activina en presencia de SMAD4 (* p & lt; 0,05). B)
SMAD4
tipo -wild FET y
SMAD4
células SW480-null fueron tratados con vehículo de control (C), activina (A), TGF (T), o una combinación de ambos ligandos (a + T) durante 24 horas antes de la lisis para proteína total, nuclear, y la preparación citoplasmática. Histona H3, α-tubulina, y GAPDH se utilizaron como controles de carga para las fracciones respectivas. Mientras TGF aumentó notablemente los niveles de p21 en las tres fracciones en la línea celular positiva SMAD4 solamente, activina induce una disminución de la proteína p21 nuclear y total en células SMAD4-positivos y negativos (panel izquierdo). El análisis densitométrico de las manchas reveló cambios estadísticamente significativos en los niveles de p21 (panel derecho) (ns = no significativo, * p & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). C) upregulation inicial de la proteína p21 es seguido por regulación a la baja por 24 h después del tratamiento activina.
SMAD4
células Tipo FET -wild fueron tratados con activina o vehículo (control) y se recogieron en diversos puntos temporales para la cuantificación de la expresión de proteína p21. GAPDH se utilizó como control de carga y expresión relativa se calculó por medio de densitometría. D) Mientras que la regulación positiva inducida por TGF de p21 era SMAD4 dependiente, regulación a la baja activin inducida por p21 se observó todavía en la ausencia de SMAD4.
SMAD4
células Tipo FET -wild fueron tratados con vehículo (CNT), activina o TGF en presencia de cualquiera de scramble se determinaron siRNA (SC) o SMAD4 siRNA (KD) y los niveles totales de p21. GAPDH se utiliza como carga y lisado de células C32 como control positivo p21.
Para confirmar que los efectos del ligando p21 en dependían directamente sobre SMAD4, derribaron SMAD4 en
SMAD4 sobre Wild escriba células de cáncer de colon FET utilizando siRNA. Se encontró que la expresión basal de p21 en las células FET disminuyó con SMAD4 desmontables (Figura 2D, carril 3), que corrobora la importancia de la vía SMAD4 para el mantenimiento de altos niveles de p21 en esta línea celular [11]. En consonancia, la regulación positiva inducida por TGF de p21 fue abolida con la pérdida de SMAD4 (Figura 2D, carril 7). Como era de esperar, la regulación a la baja de p21 por la activina no se vio afectada por la ausencia de SMAD4 (Figura 2D, carril 5), que es consistente con nuestro análisis de transferencia de Western de los niveles de p21 en FET y células SW480 (Figura 2B) que muestran la regulación negativa de p21 en el línea celular positiva y negativa SMAD4. Por lo tanto, la señalización SMAD4 parece ser necesario para los procesos que dependen de la expresión de alto p21, pero prescindible para los procesos asociados con la baja o disminución de los niveles de p21.
supresión del crecimiento inducida por Activina depende de la expresión de p21, y SMAD4 /Señalización p21 puede contrarrestar la activina inducida SMAD4 independiente de Migración
a continuación, hemos tratado de determinar el papel funcional de p21 en la supresión del crecimiento inducida por la activina y la viabilidad celular. Hemos encontrado que la pérdida de p21 a través de siRNA desmontables resultó en la abolición de la supresión del crecimiento inducida por activina en
SMAD4-
células de tipo salvaje, lo que indica que la supresión del crecimiento activina /inducida por SMAD4 es p21-dependiente (Figura 3A). Además, la pérdida de p21 no sólo dio lugar a supresión de la muerte celular activin inducida, sino también a un aumento en el número de células que sugieren un beneficio de supervivencia con la pérdida de p21 (Figura 3B). Estas observaciones ponen de relieve la importancia del eje /p21 SMAD4 en la supresión del crecimiento mediada por la activina y la muerte celular. Las células FET
A) se trataron con scramble (SC) o p21 siRNA (KD). Supresión del crecimiento se evaluó por el ensayo MTT-metabólica después del tratamiento de activina. Activina indujo inhibición del crecimiento celular en presencia de p21, pero el efecto se invirtió en ausencia de p21 (* p & lt; 0,05). B) la viabilidad total se redujo en SMAD4 cánceres de colon de tipo salvaje después del tratamiento activina en presencia de p21. FET células fueron tratadas con cualquiera scramble o siRNA p21. La viabilidad celular se evaluó mediante tinción con azul de tripano después del tratamiento activina. Trypan células positivas azules después del tratamiento activina se redujeron en presencia de p21, pero aumentaron después de caída p21 (*** p & lt; 0,001). C) activina (A) induce la migración celular en líneas celulares de SMAD4-positivas y SMAD4-negativos. migración celular se induce en
SMAD
células de tipo FET 4-salvajes y
SMAD4
células SW480-null después del tratamiento activina, pero inducción más pronunciada de la migración se ve en la ausencia de SMAD4. La pérdida de p21 conduce a un aumento en la migración basal en las células que expresan SMAD4 (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). desmontables D) p21 aumenta el efecto pro-migratoria general de activina en células FET. La pérdida de p21 en ausencia de SMAD4 no aumentar aún más la inducción migratoria (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01)
De acuerdo con ello, hemos probado el papel de la p21 en la migración activin inducida por. la evaluación de la movilidad celular en presencia y ausencia de SMAD4. Se encontró que la activina aumento de la migración de las células negativas SMAD4 positivos y SMAD4 (Figura 3C), que aboga por una vía independiente de la regulación de la migración SMAD4. Esta técnica ha sido apoyada por los resultados similares en la señalización de TGF para las que se mostró un fuerte efecto pro-migratorias y SMAD4-independiente [20], [22]. Como tratamiento de la activina se asoció con una disminución en los niveles de p21 así un aumento en la migración, esperábamos que la pérdida de p21 por caída mejoraría la migración de línea de base, así como la migración después de activina tratamiento en SMAD4 células intactas, si el p21 restante era al menos parcialmente implicados en la lucha contra la migración inducida por activina. Consistente con esta hipótesis, se muestra una tasa de migración basal aumentado en SMAD4 células siguientes desmontables p21 (Figura 3C), así como la migración global más pronunciada por tratamiento activina (Figura 3D). Expresar
Se han encontrado, además, que las células basales la migración fue mejorada por activina tratamiento en ausencia de cualquiera de p21 o SMAD4 en células FET SMAD4-positivos, pero que desmontables de p21 no tuvo ningún efecto adicional sobre la migración cuando SMAD4 estaba ausente, como en células SW480 (Figura 3D). Para TGF, se encontró que la migración celular se mejoró independientemente de la presencia de p21 (Figura 2B, Figura S1D). Esto apoya de nuevo que los efectos de p21 mediada siguientes tratamiento activina dependen de SMAD4 y que p21 actúa aguas abajo de SMAD4 por sus efectos anti-proliferativos y anti-migratorias (Figura 4). Además, esto sugiere que, en el caso de TGF, algunas señales promigratory pueden pasar por alto SMAD4 como postulado anteriormente [22] p21 eludir y sus efectos inhibidores. En resumen, se deduce que la p21 puede contrarrestar la migración aguas abajo de SMAD4 y que la regulación negativa de p21 puede ser responsable de algunos de los potenciales pro-migratoria de la señalización de la activina. Por lo tanto, la regulación diferencial de p21 puede estar en el centro de los efectos funcionales distintos de activina y TGF.
Tratamiento activina conduce a la ubiquitinación de p21 y la inhibición del proteasoma Suprime activina inducida por p21 regulación a la baja
Para diseccionar el mecanismo de disminución de la proteína p21 mediada activin, se evaluó la ubiquitinación de p21 después del tratamiento activina y su dependencia de la proteasoma (Figura 5A, B). Para ello, se comparó la ubiquitinación de p21 tras la activina y tratamiento TGF. En contraste con TGF, el tratamiento inducida por activina p21 polyubiquitination (Figura 5A). El tratamiento con MG-132 inhibidor proteasomal abrogada disminución proteína p21 inducida por activina, (Figura 5B), la invocación de la degradación mediada por ubiquitina proteasomal en downregulation p21 activin inducida. Esto es similar a la degradación de la proteína p21 inducida por UV [24], pero distinta de la degradación de p21 basal proteasomal [25], que no emplea ubiquitinación.
A)
ACVR2 /TGFBR2 /SMAD4
células tipo FET -wild se fueron pretratadas durante 30 minutos con inhibidor proteasomal MG-132 y luego tratados con vehículo (control), activina, TGF durante 24 horas y la ubiquitinación de p21 total se evaluó a través de inmunoprecipitación de p21 y Blot con una específica de ubiquitina anticuerpos (panel superior) y reblotting de p21. Múltiples bandas indicativas de polyubiquitination sólo se observaron después del tratamiento activina. B) Activina inducida downregulation p21 depende de la proteasoma.
SMAD4
células Tipo FET -wild se pretrataron durante 30 minutos con inhibidor proteasomal MG-132 seguido de tratamiento con vehículo (control) o activina durante 24 horas y en comparación con las células tratadas en consecuencia, sin la inhibición proteasomal. expresión de p21 fue evaluada y mostró inhibición de la regulación a la baja de p21 tras el tratamiento activina en conjunción con la inhibición proteasomal.
p21 nuclear se pierde en un subgrupo de cánceres primarios de colon con Intacto
ACVR2
a continuación, evaluamos si la alteración de la activina /TGF señalización afectada localización de p21 en cánceres primarios de colon. Se determinó la presencia frente a la pérdida de expresión de p21 nuclear en 56 muestras de cáncer de colon primario de diversos subtipos genómicos, y correlacionado estos datos con la activina y estado del receptor de TGF (Tabla 1). Se encontró que un gran subconjunto de los cánceres de colon mostró pérdida de p21 nuclear, y que esta pérdida se asoció con la preservación de ACVR2 (Tabla 1 y Figura 6), lo que sugiere disminución de la señalización a través del eje /p21 SMAD4, pero activina intacta la señalización SMAD4-independiente . Lo opuesto fue el caso para TGFBR2: Preservación de TGFBR2 se asoció con p21 nuclear persistente (Tabla 1). Estos datos son consistentes con nuestra
in vitro
resultados de la regulación positiva TGF /SMAD4 dependiente de p21 y la activina /no SMAD4 dependiente de regulación a la baja de p21.
Cincuenta y seis cánceres de colon se tiñeron para ACVR2, TGFBR2 y p21. se muestran ejemplos representativos para la tinción de p21: tejido de colon normal con tinción nuclear (panel izquierdo), muestra de cáncer de colon con tinción nuclear p21 mantenido (panel central), y la muestra de cáncer de colon con la pérdida de la tinción de p21 nuclear (panel derecho)
.
Discusión
en los cánceres de colon MSI-H, tanto TGF y la señalización de la activina se abrogan debido a mutaciones de cambio en el receptor de tipo II [26]. La pérdida de estas dos vías de señalización puede ser beneficioso y aditivo para el crecimiento del tumor [20], [27], pero el efecto diferencial sobre la migración sigue siendo poco clara. TGF activina y utilizan las mismas proteínas intracelulares (SMAD Smad2 /3 y SMAD4) para transmitir su señal. Ambas vías específicas de ligandos son comúnmente inactivados en los cánceres de colon MSI-H, para los que anteriormente se observó mayor que el 50% de solapamiento entre la
ACVR2
y
TGFBR2
mutaciones [6]. Curiosamente, se inactivan con menor frecuencia en los cánceres de colon del SMS, que tienden a tener un peor pronóstico que los cánceres de colon MSI-H [9], y las dos vías pueden ser dirigidos de manera independiente. Aquí nos muestran que mientras que la activina y TGF tanto puede inducir la supresión del crecimiento y la apoptosis en diversos grados, sino que también aumentan la migración, compartiendo así en supresora de tumores, así como propiedades promotor del cáncer. La puesta a punto de estos efectos opuestos, así como la regulación diferencial de TGF frente activin señalización es probable que un proceso importante en la carcinogénesis de influir en el destino de las células cancerosas. Este artículo explora principalmente los efectos diferenciales y la regulación de la activina y TGF señalización en el cáncer de colon.
Aquí nos muestran que en las células de cáncer de colon, a pesar de la señalización Smad idéntica aguas abajo, activina y TGF tienen efectos opuestos sobre el p21 inhibidor de CDK2 resultante en la normativa específica de cada vía. Aunque TGF tiene un efecto up-regulador fuerte en p21, la señalización de la activina da lugar a una ligera disminución en los niveles de proteína p21. Curiosamente, ambos ligandos inducen SMAD4 dependiente de p21 mediada por la supresión del crecimiento celular y la muerte celular, sin embargo, TGF parece ser un inductor más potente de supresión del crecimiento, mientras que activina por otro lado es un inductor más potente de la apoptosis. Como se ha descrito anteriormente, tanto TGF y activina mejorar la migración de células [20], [22]. Cabe destacar, que ahora muestran que los efectos pro-migratoria de activina se regula de forma independiente y Smad4 describe por primera vez un aumento concomitante en la ubiquitinación y la degradación proteasomal p21. Por lo tanto, mientras que la supresión del crecimiento inducida por la activina es dependiente de p21, la migración inducida por activina se acompaña de los niveles de p21 reducidos e independiente de SMAD4. Si bien se sabe que la degradación de la proteína p21 inducida por UV es ubiquitinin dependiente de [24], basal degradación de p21 a través de la proteasoma no es [25]. datos recientes implican ERK2 en la mediación de nuclear a cambio citosólica y la consiguiente degradación ubiquitinin mediada por p21 [28]. Una variedad de ubiquitina ligasas para incluir Ecto y Pitufo-1 se han encontrado para dirigirse tanto a TGF-Smad dependiente e independiente de señalización [29]. La ubiquitina ligasa específica responsable de la ubiquitinación de p21 mediada por la activina no se ha determinado hasta la fecha.
aumento o disminución de los niveles de p21 podría conducir una celda hacia la activación preferente de cualquiera vía de señalización de la SMAD4-dependiente o independiente y vice versa, modulando así la respuesta celular en general. En conclusión, p21 parece ser un jugador importante para la regulación diferencial de las vías SMAD4-dependientes e independientes controlados por la activina y TGF (Figura 4).
De hecho, parece que tanto la activina y TGF SMAD y no señalización SMAD producen al mismo tiempo y que el efecto neto es el resultado de la dominancia dependiente del contexto relativo de un ligando y /o vía dada. La regulación diferencial de p21 puede ser un mecanismo importante para el control y la señalización preferencial afinar dependiente o independiente de la SMAD con potencial relevancia pronóstica. La pérdida de la señalización de Smad se ha asociado con un aumento de la migración y la pérdida de supresión del crecimiento en el cáncer de colon [22], y que ahora mostrar un posible mecanismo en el cáncer de colon en los que la señalización Smad puede ser evitado a través de la señalización de la activina preferencial, presentando una explicación para la pro efectos -migratory y pro-proliferativos que acompañan a la señalización Smad perdido.
p21 juega un papel complejo en el cáncer. Tumor propiedades supresoras de p21 se han descrito en el contexto de la inducción de la detención del crecimiento, la diferenciación y la senescencia y estudios en diferentes tipos de cáncer mostró que la expresión de p21 se correlaciona con un diagnóstico favorable [10]. Consistente con el hallazgo anterior, varios estudios en el cáncer de colon revelaron una asociación entre la regulación a la baja de p21 y la metástasis así como una pobre supervivencia [30], [31], [32] [33] Sin embargo, algunos informes apuntan hacia un doble papel en varios cánceres con aumento de p21 se correlaciona con un peor pronóstico [34], [35].
a continuación, se presenta un número sustancial de cánceres primarios de colon con la pérdida de p21 nuclear, que se correlaciona con la presencia de ACVR2 y ausencia de TGFBR2 . Esto está en línea con nuestra
in vitro
de datos en las que mostramos regulación a la baja de p21 en el marco de una mayor señalización SMAD4 independiente inducida por la activina. También es consistente con el concepto de una regulación al alza ausente de p21 después de la abrogación del eje de TGF /SMAD4, que pueden ser explicados por desmontables de SMAD4, como en nuestros experimentos, sino también por la ausencia de TGFBR2, como se ve en las muestras de cáncer. Las consecuencias funcionales que se esperaría de disminución de los niveles de p21 en relación con la preservación de ACVR2 y la pérdida de TGFBR2 sobre la base de nuestros datos se han mejorado la migración a través de señalización SMAD4 independiente y la pérdida de la supresión del crecimiento a través del eje TGF /SMAD4 /p21. Independiente del efecto sobre la supresión del crecimiento, que es lo único que se ha encontrado que es un marcador pronóstico débil en muchos tipos de cáncer [36], el estado de los receptores ACVR2 + /TGFBR2- asociado con la pérdida de puntos de p21 nucleares a un cáncer de pro-metastásico y por lo tanto más agresivo fenotipo. Esto es consistente con los hallazgos anteriores que muestran que la pérdida de p21 se asocia con un peor resultado en varios tipos de cáncer [10]. Mientras que otras vías de señalización pueden dirigir la localización de p21, nuestros datos establecen la base para una evaluación adicional de la activina y el estado del receptor de TGF en asociación con la localización de p21 para la predicción de la evolución y respuesta al tratamiento en el cáncer de colon.
En resumen, nuestra datos muestran que TGF es un inductor más potente de supresión del crecimiento, mientras que la activina es un inductor más potente de la apoptosis. Además, la supresión del crecimiento y la apoptosis por ambos ligandos dependen de SMAD4 y p21. Sin embargo, la activina regula a la baja la proteína p21 nuclear total y de una manera independiente de Smad4 en conjunción con el aumento de la ubiquitinación y la degradación proteasomal asociados a la migración mejorada. TGF por otro lado aumenta la expresión de p21 nuclear de una manera dependiente de SMAD4 para afectar a la detención del crecimiento y puede p21 de derivación para afectar a la migración. Además, los cánceres primarios de colon muestran una expresión diferencial de p21 en consonancia con su
ACVR2 /TGFBR2
el estado del receptor. En conclusión, nos informan de p21 como activina objetivo diferencialmente afectados /TGF y mediador de las funciones-ligando específico en el cáncer de colon, que puede ser explotado para el futuro estratificación del riesgo y la intervención terapéutica.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Carolina del Norte hospitales. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras como parte de la fase de aprobación del IRB realizaron Carolina del Norte Estudio de Cáncer Colorrectal (NCCCS) como se indica a continuación. El estudio fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional de la Universidad de Northwestern (IRB#STU00020989). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes.
muestras de pacientes
Los tumores de colon se recogen de forma prospectiva en virtud de la aprobación del IRB como parte del Estudio de Cáncer Colorrectal de Carolina del Norte (NCCCS), una basada en la población, caso -Control de estudio comprende 503 pacientes [14], [15]. Para este estudio, se seleccionaron al azar 15 muestras de pacientes con un amplio tumor y el tejido normal. Para la verificación, se recogieron un adicional de 41 muestras de cáncer colorrectal consecutivos de la Universidad Northwestern en virtud de la aprobación del IRB institucional (IRB#STU00020989) (Tabla S1). Todos los tumores fueron fijados con formalina, embebido en parafina y se cortan en secciones de 5 micras.
líneas celulares de cáncer de colon
Se mantuvieron las células SW480 (ATCC, Manassas, VA) en Iscove modificado de Dulbecco y el FET células (generoso regalo de Michael Brattain, Universidad de Nebraska, Omaha, NE [16]) en medio F12 /Eagles Modificado de Dulbecco (ambos Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina G [100 U /ml] /estreptomicina [100 mg /ml] (Invitrogen). Las células se cultivaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2. Todas las células fueron suero de hambre durante 24 horas antes de la experimentación a la sincronización aproximada del ciclo celular. Las células fueron probados para la infección por micoplasma utilizando el conjunto de PCR Detección de Mycoplasma (Takara, Otsu, Japón) y autenticadas por un perfil de STR mediante el PowerPlex 1.2 del sistema (Promega, Madison, WI).
Los anticuerpos y reactivos
activina a se reconstituyó en PBS, TGFß1 en HCl 4 mM de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ambos de R & amp; D, Minneapolis, MN) y se usó a concentraciones finales de 25 ng /ml y 10 ng /ml como se describe anteriormente [17], [18], [19], [20]. MG-132 (Calchemie, Darmstadt, Alemania) se utilizó para la inhibición del proteasoma. Para los análisis inmunohistoquímicos, se utilizó un anticuerpo policlonal de cabra contra ACVR2 (1:50) (ab10595, Abcam, Cambridge, MA), así como anticuerpos monoclonales de ratón contra TGFBR2 (1:50) (ab78419, Abcam) y p21 (1: 150) (sc-817, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Para la transferencia Western, p21 (# sc-469) (1:250) (Santa Cruz, Biotechnology), α-tubulina (# 3873), la histona H3 (# 9715) (ambos Cell Signaling Technology, Danvers, MA), y GAPDH