Extracto
El efecto de las nanopartículas de oro en las células de cáncer de pulmón todavía no está claro. En este estudio, se investigó la actividad de la citotoxicidad y la invasión de células de células de cáncer de pulmón después del tratamiento con nanopartículas de oro y demostramos que las pequeñas nanopartículas de oro pueden ser endocitosis por las células de cáncer de pulmón y que facilitan la invasión celular. El crecimiento de las células A549 se inhibió después del tratamiento con nanopartículas de oro 5 nm, pero la invasión de células aumentó. Endocitosis nanopartículas de oro (tamaño, 10 nm), en particular promovieron la actividad de invasión de las células 95D. Todos estos efectos de las nanopartículas de oro no se observaron después del tratamiento con partículas mayores (20 y 40 nm). La actividad invasión mejorada puede estar asociada con el aumento de la expresión de metaloproteinasa de la matriz 9 y molécula de adhesión intercelular-1. En este estudio, se obtuvo evidencia del efecto de nanopartículas de oro sobre la actividad de la invasión de células de cáncer de pulmón in vitro. Por otra parte, metaloproteinasa de la matriz 9 y la molécula-1 de adhesión intercelular, moduladores clave de la invasión de células, se encontró que ser regulada por las nanopartículas de oro. Estos datos también demuestran que las respuestas de la A549 y 95D células a nanopartículas de oro tienen una notable relación con sus propiedades fisicoquímicas únicas dependientes del tamaño. Por lo tanto, este estudio proporciona una nueva perspectiva para la investigación de la biología celular en nanomedicina
Visto:. Liu Z, Wu Y, Z Guo, Liu Y, Shen Y, Zhou P, et al. (2014) Efectos de la internalizado nanopartículas de oro con respecto a la citotoxicidad y la invasión actividad en las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (6): e99175. doi: 10.1371 /journal.pone.0099175
Editor: G. Hidayatullah Munshi, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Febrero, 2014; Aceptado: 12-may de 2014; Publicado: 5 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias de China (No.81270428 y 81300999). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
estudios previos identificaron que las nanopartículas de oro (Au-NPS) muestran poca citotoxicidad a pesar de su absorción eficiente en las células humanas por endocitosis [1], [2], lo que los candidatos adecuados para la nanomedicina. Además de su biocompatibilidad, el hecho de que son fáciles de sintetizar, caracterizar y modificar la superficie contribuyó a atraer mucha atención en diversas aplicaciones biomédicas. Au-PN han sido investigadas como vehículos de administración de fármacos y la terapia fototérmica y herramientas de imágenes moleculares para biodiagnóstico potencial [3], [4]. estrategias terapéuticas basados en nanopartículas para el tratamiento del cáncer se basan principalmente en la administración de agentes quimioterapéuticos para inducir apoptosis [5]. Las principales razones para el uso de nanopartículas como vehículos de suministro terapéutico son para habilitar funcionalidades multimodales, como las imágenes o la dirección específica, para aumentar la permeabilidad del tejido y la acumulación del fármaco específico del sitio, y para reducir los efectos secundarios en los tejidos sanos [6]. Actualmente, Au-PN se utilizan en diferentes aplicaciones biomédicas: no sólo pueden ser utilizados como andamios para la administración de fármacos cáncer cada vez más potente, pero también pueden servir como agentes de transfección para la terapia génica selectiva y agentes antineoplásicos como intrínsecas [7] - [9] . Dreaden et al. [8] han demostrado que dirigidos Au-PN son capaces de alterar el ciclo celular, incluyendo la división celular, la señalización y la proliferación.
A pesar de la aplicación generalizada de Au-PN, una clara comprensión de cómo los sistemas biológicos responder a las nanopartículas es de vital importancia, y la caracterización de las propiedades físico-químicas dependientes del tamaño únicas de la Au-PN es un componente crítico. Un estudio previo demostró que el tamaño de la superficie de Au-PN juega un papel importante en su efecto terapéutico [10]. Au-NPs de diámetro muy pequeño (& lt; 2 nm) pueden penetrar en las células y los compartimientos celulares tales como el núcleo y ser extremadamente tóxicos [11]. Por ejemplo, se encontró que los esférica Au-NPs con un diámetro de 1,4 nm inducir necrosis y daño mitocondrial en diversas líneas celulares a través de mecanismos de estrés oxidativo, que puede estar asociado con su actividad catalítica bien conocida en ese tamaño [12]. Un estudio reciente realizado por Connor et al. [1] informó de que cantidades significativas de mayor Au-PN (por ejemplo, 18 nm de diámetro) penetran en las células, pero que estos Au-NPs no son inherentemente tóxicos para las células humanas. Chithrani et al. [13] estudiaron la relación entre las células Au-NP y HeLa y sugirió que Au-NPs entró en las células a través de endocitosis mediada por receptor en un tamaño de umbral de aproximadamente 50 nm. Dado que no existen normas de seguridad, sin embargo, el efecto de Au-NP en células todavía requiere más estudio.
La invasión y la metástasis son importantes características patológicas de las células cancerosas. capacidad invasiva es el rasgo más importante que distingue a lesiones benignas de las malignas [14]. De hecho, las células tumorales invasoras pueden escapar de la resección quirúrgica y serán responsables de la recurrencia del tumor. A pesar de los avances en la cirugía, la quimioterapia, y radioterapia, la recaída es casi inevitable en la presencia de una diseminación metastásica agresiva [15], [16]. El proceso de invasión y metástasis incluye la proliferación celular, la disociación de las lesiones primarias, la degradación y la permeación en la matriz extracelular (ECM), la migración en la sangre o la linfa corriente, la adhesión y el crecimiento en un órgano secundario [17]. Los informes anteriores han descrito que molécula de adhesión intercelular-1 metaloproteinasa (ICAM-1) y de la matriz 9 (MMP-9) están implicados en la adhesión de células de cáncer, la invasión y la migración, que contribuyen a la metástasis del cáncer [18]. Estos factores han sido considerados como biomarcadores de pronóstico para la progresión del cáncer de pulmón [19]. Otros estudios sobre los efectos de Au-NP en la expresión de estas proteínas son necesarios.
Desde la citotoxicidad no puede ser el único efecto que las nanopartículas pueden inducir, en este estudio, nos centramos en la proliferación celular, la actividad de la invasión, y la expresión de proteínas, todos los cuales se puede ver afectada por la presencia de Au-NPs. Para investigar la importancia del tamaño de las partículas en nanomedicina, elegimos cuatro tamaños diferentes de Au-NP (es decir, 5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm) para un análisis en profundidad de este sistema.
Por último , optamos por estudiar estos efectos en dos líneas celulares de cáncer de pulmón humano (es decir, A549 y 95D) ya que el cáncer de pulmón es uno de los principales tumor maligno en china y tiene cada vez mayor incidencia en la mayoría de las ciudades. En 2010, había aproximadamente 600.000 nuevos casos de cáncer de pulmón en China [20]. Las tasas de morbilidad siguen aumentando rápidamente debido a la grave contaminación del aire [21]; Sin embargo, el conocimiento de las interacciones biológicas y las respuestas de Au-PN con células de cáncer de pulmón humano es muy limitado. Por otra parte, para obtener una comprensión fundamental de los procesos involucrados, nos pareció que era importante centrarse inicialmente en los efectos de las nanopartículas sobre las células cancerosas individuales, y no en órganos completos, en los que otros factores pueden complicar la interpretación de los resultados. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación era proporcionar una base importante para la aplicación de Au-NP en la terapia del cáncer de pulmón.
Métodos
Preparación y Caracterización de Citrato de casquillo Au-PN
Au-NP (5 nm y 10 nm) se sintetizaron utilizando una solución de ácido tánico /citrato, en la que el ácido tánico desempeña el papel de un agente reductor y actos de citrato como agente estabilizador [22]. Para cada síntesis, se requieren dos soluciones iniciales: (a) 1 ml de 1% (w /v) HAuCl
solución 4, que se añadió a 79 ml de agua; y (b) una mezcla que consiste en 4 ml de 1% (w /v) de solución de citrato, 0,7 ml o 0,1 ml de ácido tánico al 1%, y agua (para conseguir un volumen final de 20 ml). Tanto (a) y (b) las soluciones se calentaron a 60 ° C en baño de agua y (b) se añadió entonces solución de (a) bajo agitación constante. El Au-NPs resultante se enfrió a temperatura ambiente (RT) para experimentos posteriores.
Síntesis de 20-nm y 40 nm-Au-NPs estabilizados por iones citrato se realizaron utilizando el método de reducción de citrato clásico [23] . Para cada síntesis, 100 ml de 0,01% HAuCl solución
4 se calentó a ebullición. Se añadieron volúmenes seleccionados (4,5 ml o 1,0 ml) de solución de citrato de 1% y la ebullición se continuó hasta que el color de la solución se convirtió en rojo rubí. La solución de citrato de Au-NP-capsulado se enfrió hasta la temperatura ambiente de forma natural
La morfología de la Au-PN se observó mediante microscopía electrónica de transmisión. (TEM; JEM-2100EX, JEOL, Tokio, Japón) a un voltaje de aceleración de 200 kV. Los espectros ultravioleta-visible (UV-Vis) se adquirieron con un espectrofotómetro Shimadzu UV-3600 en el rango de 300-1100 nm.
Cell Culture
células A549 y 95D (Shanghai Institutos para Biológica Ciencias, la Academia de Ciencias de china) se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% (v) de suero v /bovino fetal (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (todos de GIBCO, Invitrogen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Las células se pre-cultivaron en el medio durante la noche y después se trató con o sin solución /mL Au-NPs 50 g de un adicional de 48 h. Las células fueron cosechadas por la tripsina-ethylenediamintetraacetic ácido (EDTA; GIBCO, Invitrogen) desprendimiento en la fase de crecimiento logarítmico y se centrifugaron. Las células se volvieron a suspender en DMEM con FBS al 10% para el subcultivo u otros usos.
La captación y TEM Estudios
La captación de Au-PN también se examinó mediante TEM. Antes de la exposición a las Au-PN, las células A549 y 95D células se sembraron a una concentración de 1 × 10
6 células por placa en una placa de cultivo de 100 mm (Corning, EE.UU.) que contiene el medio de cultivo y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 para 24 h. A continuación se añadieron las Au-PN. Después de la exposición a Au-NPs durante 48 h, las células se fijaron en 3,7% (v /v) de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 min a TA. Posteriormente, las células se prepararon para el análisis de TEM de la siguiente manera: las células se fijaron en 1% (w /v) de tetróxido de osmio durante 2 h, se deshidrataron en una serie graduada de 30%, 50%, 70%, 80% y 90% de etanol , y se trató tres veces con 100% de etanol durante 15 min cada uno. Las muestras fueron luego incorporados en una mezcla de resina en óxido de propileno se polimerizó a 80 ° C. Los cortes ultrafinos para TEM se prepararon utilizando un cuchillo de diamante y las muestras se analizaron mediante un microscopio electrónico de transmisión.
Ensayo de viabilidad celular
A549 y 95D células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una baja confluencia (2000 células /pocillo), se dejó unir durante toda la noche, y se trató con Au-NPs (control, 5 nm, 10 nm, 20 nm, y 40 nm). Después de 24 h, 48 h, y 72 h, un reactivo de ensayo de viabilidad celular (recuento de células kit-8, Kaiji, Nanjing) se añadió a cada pocillo y se incubaron durante 1, 2, 3, y 4 h, respectivamente. valores de absorbancia a 450 nm se registraron utilizando un lector de placas de microcultivo (BioRad) y la viabilidad de las células expresan como un porcentaje del control sin tratar (100% de viabilidad celular). El efecto de la Au-NPs con diferentes tamaños en la viabilidad de las células se midió por triplicado, y los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Detección de apoptosis por anexina V /yoduro de propidio (PI) tinción
las células en la fase de registro se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células por pocillo, se incubó a 37 ° C en un CO
2 incubadora, y se deja unieran durante la noche. Después del tratamiento con Au-NPs (control, 5 nm, 10 nm, 20 nm, y 40 nm) durante 48 h, la apoptosis y la necrosis se analizaron con la anexina V-PI (BD Biosciences) kit de detección de apoptosis siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron usando un instrumento BD FACS CantoII (BD Biosciences).
Análisis de citometría de flujo del ciclo celular
Las células se recogieron usando tripsina al 0,25% con una solución de 1 mM EDTA y se fijaron para 12 h en etanol al 70% a 4 ° C. Las células fijadas se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 min para eliminar el etanol a fondo. Después, las células se lavaron dos veces con 3 ml de PBS, se resuspendieron en 1 ml de solución de tinción PI, y se incubaron durante 15 min a TA. La solución de tinción consistió en 20 mg /ml PI y 0,2 mg /ml RNasa A en PBS. Las muestras se analizaron posteriormente usando un instrumento BD FACS CantoII (BD Biosciences). Veinte mil eventos se obtuvieron de cada muestra. Los porcentajes de células en la fase G0 /G1, S y G2 /M fases del ciclo celular se determinaron utilizando el software ModFit (BD Biosciences).
Invasion Ensayo
Para el ensayo de invasión , insertos de cultivo de células que cuelga (8,0-micras de tamaño de poro) fueron pre-recubierto con 50 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences) en la superficie superior. Las células se pre-cultivaron en el medio durante la noche y después se trató con o sin solución /mL Au-NPs 50 g para adicional de 48 h, a continuación se recogieron las células y 2,5 × 10
5 células se sembraron en 200 l DMEM suplementado con 0,2% de albúmina de suero bovino (BSA) en la parte superior de la cámara. La parte inferior del pocillo se añadieron con 750 l de DMEM que contenía 5% de FBS. El ensayo de invasión se llevó a cabo durante 48 h en la incubadora de cultivo celular
.
Las células se fijaron mediante la sustitución del medio de cultivo en la parte inferior y superior de la cámara con 4% de formaldehído disuelto en PBS. Después de la fijación durante 15 min a RT, las cámaras se lavaron en PBS y se tiñeron con 0,2% de cristal violeta durante 10 minutos. Después de lavar las cámaras de cinco veces por inmersión en un gran vaso de precipitados lleno de dH
2O, las células (ahora de color azul) en la parte superior de la membrana de Matrigel se eliminaron por el uso de varios Q-tips. Se eliminaron las células hasta que no haya más de tinte azul podría ser eliminado con los bastoncillos de algodón. A continuación, las células que quedaban eran los que habían invadido y había llegado a la parte inferior de la membrana.
También cuantificamos las células de invasión utilizando el QCM ™ 24 pocillos invasión celular Ensayo fluorométrico (Millipore) con ECMatrix-revestido inserta, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo proporciona un sistema eficiente para la evaluación cuantitativa de la invasión de las células tumorales a través de un modelo de membrana basal. células A549 y 95D se hicieron crecer durante 2 d en medio completo, ya sea en ausencia (control) o en presencia de Au-NP (5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm). Al final del tratamiento, las células se suspendieron en medio libre de suero y se sembraron (2,5 × 10
5 células /250 mu l) en cada inserción de una cámara de la placa de paredes múltiples. Serum (10%) se añadió al medio libre de suero en la cámara inferior como quimioatrayente. Después de un período de incubación de 48 h a 37 ° C, las células no invasoras se eliminaron de la parte superior de los insertos. A continuación, los insertos se colocaron en un pocillo que contiene una solución limpia pre-calentado desprendimiento de las células y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Los insertos se retiraron de los pocillos, y se añadió solución de tampón de lisis /colorante para el medio que contiene las células separadas por 15 min a TA. Las mezclas se leen con un lector de placas de fluorescencia (Bio-Tek, Synergy HT) usando un conjunto de filtros 480/520-nm. Las medidas de fluorescencia se informaron como valores unitarios de fluorescencia relativa (RFU).
cuantitativa con transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR)
El ARN total se aisló de tratados y tratados con Au-NP A549 y 95D células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen Life Technology). La transcripción inversa de reacción (RT) se realizó utilizando 1 g de ARN total, que fue a transcripción inversa en ADNc usando cebador oligo dT, y luego QRT-PCR se llevó a cabo utilizando el SYBR Green Mix (Applied Bio-Systems). Las secuencias de los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes: ICAM-1, ACACTAGGCCACGCATCTGAT hacia adelante, AGCATACCCAATAGGCAGCAA inversa; MMP-9, GGCTACGTGACCTATGACATCCT avance, retroceso TCCTCCCTTTCCTCCAGAACA; gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC avance, retroceso GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT. PCR se llevó a cabo a 95 ° C durante 30 s, a 60 ° C durante 30 s, y 1 min a 70 ° C durante 35 ciclos. El método comparativo Ct se utilizó para calcular la abundancia relativa de ARNm y los resultados para la expresión del gen diana se compararon con los de expresión de GAPDH. Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes.
Proteína cuantitativos Ensayos
expresión de la proteína MMP9 en el sobrenadante y las células lisado se midió utilizando un kit de perla magnética Panel MMP 2 basado en la tecnología Luminex. Brevemente, los anticuerpos de captura MMP9 (Millipore) se conjugaron a perlas Luminex (perlas región 33). anticuerpos de detección MMP9 (Millipore) se conjugaron con biotina a través del servicio personalizado proporcionado por Millipore. Las células se lisaron en tampón de lisis MAP MILLIPLEX (Millipore) y se diluyeron con un volumen igual de tampón de ensayo de células MAP MILLIPLEX (Millipore). perlas de anticuerpo de captura MMP9 se diluyeron en 25 l de tampón de ensayo de células MILLIPLEX MAPA y se añadieron a una placa magnética (Millipore). A continuación, 25 l de lisado celular o sobrenadante de cultivo celular diluido se transfirió a cada pocillo de la placa sólida y se incuba durante 2 h a TA con agitación. Después de la incubación, las perlas se lavaron dos veces con tampón de lavado, y se añadieron 25 l de anticuerpos de detección en cada pocillo y se incubaron durante 1 h a TA con agitación. Después de eso, se añadieron 25 l de MILLIPLEX MAP estreptavidina-ficoeritrina (Millipore) y se incubaron durante 30 min a TA con agitación. Finalmente, se añadió fluido de revestimiento después del lavado, y la señal se leyó usando un 3D ™ Luminex FLEXMAP.
Análisis de Western Blot
Para el análisis de transferencia de western, A549 y 95D células se sembraron en frascos de cultivo y se trató con Au-NPs (control, 5 nm, 10 nm, 20 nm, y 40 nm). Después de 48 h, 5-10 × 10
se cosecharon y se lisaron con tampón de lisis enfriado en hielo 6 células. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirió electroforéticamente a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con leche en polvo no grasa 5% durante 2 h y se incubaron durante la noche a 4 ° C con conejo-MMP-9 anticuerpo anti (1:1000, Abcam), de conejo anti-ICAM-1 anticuerpo (1:500, Cell la señalización), o el ratón anticuerpo anti-GAPDH (1:10000, Abmart). GAPDH se usó como el control de limpieza de genes y los niveles de expresión de la MMP9 y ICAM-1 se normalizaron con respecto a GAPDH. Las proteínas se detectaron con rábano picante anti-conejo o anti-ratón anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y se visualizaron con reactivos de quimioluminiscencia se suministran con el kit ECL (BioRad, EE.UU.). Las bandas inmunorreactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada y cuantificaron utilizando un generador de imágenes moleculares XRS ChemiDoc (BioRad).
Análisis estadístico
analiza GraphPad Prism 5 estadístico se utilizó el software en todos los análisis estadísticos realizados en este estudio ( GraphPad Prism versión 5.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego California, EE.UU.). Todos los resultados han sido presentados como media ± desviación estándar (DE). Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA), seguido por de Dunnett
t
-test para la comparación con el grupo control. Las diferencias se consideraron significativas a P & lt;. 0.05
se utilizaron
Resultados
Síntesis y Caracterización de Au-PN
Au-PN sintetizado con el método de reducción de citrato y sin ninguna otra modificación para todos los estudios y que están aquí se hace referencia a las nanopartículas como no modificados. Para determinar la relación entre el tamaño y la función biológica de las nanopartículas, se utilizó Au-NPs de cuatro tamaños diferentes (5, 10, 20, o 40 nm) y los caracterizó por TEM y UV-Vis espectros (Figura 1). Las partículas se mostró a ser todas las esferas con distribuciones de tamaño estrechas. Las altas densidades de electrones de Au-PN, así como la homogeneidad de su forma y tamaño hacen que sean muy evidentes en el microscopio electrónico de transmisión.
Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de Au-PN con un diámetro de (A ) 5 nm, (B) 10 nm, (C) 20 nm, o (D) 40 nm. Los recuadros muestran imágenes de alta resolución. Las barras de escala, 20 nm y 100 nm (como está marcado). E: espectros UV-vis de la Au-PN con 5-nm, 10 nm, 20 nm y 40 nm de diámetro
Internalización de Au-PN
. para investigar si Au-NPs con diversos tamaños cruzaron la membrana celular y en el que encuentra, se incubaron las células A549 y 95D durante 48 h en presencia de Au-NP (5, 10, 20, y 40 nm) en medio de cultivo celular completa . La Figura 2 muestra la internalización de la diferente tamaño Au-NPs. La mayor parte de las partículas se encontraron en vesículas unidas a la membrana o en la región perinuclear dentro de las células.
imágenes de TEM con un aumento de 200-nm que muestran la internalización de 25 mg /ml Au-NPs con varios tamaños (5 nm , 10 nm, 20 nm, y 40 nm) en) A549 (A y (B) células 95D después de 48 h de tratamiento.
Medición de la citotoxicidad de Au-NPs
a continuación, se buscó determinar el efecto de estos Au-PN sobre la proliferación de dos líneas diferentes de cáncer de pulmón de células, A549 y células 95D. El efecto citotóxico sobre los cuatro Au-NPs con diferentes diámetros se puso a prueba a la misma concentración. Nuestros resultados demostraron que 5 nm Au-NPs desempeñan un papel fundamental en la inhibición de la proliferación tanto de A549 y 95D células a las 48 h y 72 h (Figuras 3A y B). Au-NPs con diámetros de 20 nm y 40 nm exhiben eficacia notable de 24 h en adelante en la promoción de la proliferación de células A549, mientras que no se observó en la promoción 95D células (Figuras 3A y B). Au-NPs con un diámetro de 10 nm no tuvo efecto sobre la proliferación de ambos A549 y 95D células. La inhibición de la proliferación celular, el aumento de la apoptosis celular, y la detención de las células en el ciclo de G0 /G1 manifiesta la citotoxicidad de 5-nm Au-NPs. No hubo diferencia significativa (P & gt; 0,05) en la apoptosis y la distribución del ciclo celular para el 10-nm, 20 nm, y los grupos tratados con AuNP 40 nm (figuras 3C-H). Estos resultados indican que pequeñas Au-NPs puede ser citotóxico y que el diámetro no es el único factor que influye en la proliferación celular y la interacción entre Au-PN, que es un proceso muy complejo que merece investigación adicional
.
La célula líneas A549 (a) y 95D (B) en la fase de crecimiento logarítmico fueron expuestos a Au-NPs durante 24 h, 48 h, y 72 h. La viabilidad celular se calcula como el porcentaje de las células viables en comparación con los controles no tratados. Cada resultado representa la viabilidad media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Apoptosis (C-D) y el ciclo celular (E-H) el análisis de A549 y 95D células tratadas con diferente tamaño Au-NPs. Las barras de error indican valores de DE de cuatro experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt;. 0.001
Invasión Ensayo
Un modelo de membrana basal se utilizó para evaluar la actividad de la invasión de las células. Los resultados se presentan en la Figura 4. Nuestros resultados indican que la invasión de células se promovió significativamente después del tratamiento de A549 con 5-nm Au-NP y de 95D células con 10-nm Au-PN (P & lt; 0,05). En contraste, las células internalizadas con 20 nm o 40 nm-Au-NPs no se vieron afectados significativamente por la actividad de invasión (Figura 4). Estos resultados sugieren claramente que los efectos de la invasión fueron tamaño- de partículas y en función del tipo de células
.
Las imágenes representan células A549 (A) y células 95D (B) que han atravesado los poros de la cámara de invasión de Matrigel y las correspondientes resultados de intensidad de fluorescencia. * P & lt; 0,05. Las barras de error indican los valores de DE de tres experimentos independientes.
Efectos de Au-NP en la expresión de MMP9 e ICAM-1 en células de cáncer de pulmón
Para obtener una comprensión más profunda de este fenómeno, QRT-PCR se realizó para medir los niveles de mRNA de MMP9 y ICAM-1 después del tratamiento con Au-NPs. Los resultados mostraron que 5 nm y 10 nm-Au-NPs facilitan notablemente la expresión de ARNm de ICAM-1 en ambas líneas celulares (Figuras 5B y D, P & lt; 0,05). La expresión de mRNA MMP9 aumentó en 5 nm Au-NPs tratados con células A549 y 10 nm-Au-NP-tratada 95D células, pero las diferencias no fueron estadísticamente significativos (Figura 5A y C). A continuación realizó un experimento basado en Luminex en presencia de perlas magnéticas MMP9 para cuantificar la expresión de la proteína de MMP9 tanto en el lisado de células y sobrenadante de cultivo. Nuestros resultados ilustran que el tratamiento con 5-nm Au-NPs aumentó notablemente los niveles de MMP9 en el lisado de células A549, mientras que MMP9 se upregulated en particular en el lisado de células 95D mediante tratamiento con 10 nm Au-NP (Figuras 6 A- SEGUNDO). Las comparaciones con el nivel de MMP9 en el sobrenadante reveló que no hubo diferencia significativa (p & gt; 0,05). Entre el A549 tratada-Au-NP y Au-NP-sin tratar y 95D (Figuras 6 C-D)
resultados de la qRT-PCR para A549 (A-B) y (C-D) 95D células después de 48 h de incubación con 5-nm, 10 nm, 20 nm, o 40 nm-Au-NPs. * P & lt; 0,05, *** P & lt; 0,001 frente a control. Las barras de error indican los valores de DE de tres experimentos independientes.
La cuantificación de la expresión de MMP9 en el lisado celular (A-B) y el sobrenadante (C-D) de las células A549 y 95D, respectivamente , se llevó a cabo mediante el uso de la tecnología Luminex. * P & lt; 0,05. Las barras de error indican los valores de DE de tres experimentos independientes.
Además, se determinó la expresión de proteínas utilizando el Western Blot. Los resultados mostraron que MMP9 y ICAM-1 se upregulated en los lisados de A549 y 95D células por tratamiento con 5-nm y 10 nm-Au-PN, respectivamente (Figura 7); por el contrario, MMP9 y ICAM-1 se downregulated por el tratamiento con 40-nm Au-PN, lo que sugiere que el tamaño de partícula Au-NPs juega un papel importante en la regulación de estas proteínas. Estos resultados proporcionan la evidencia de que MMP9 e ICAM-1, moduladores clave de la invasión de células, podrían ser reguladas por Au-PN.
Los resultados representativos que muestran el efecto del tratamiento Au-NP en la expresión de MMP9 y ICAM 1 en A549 (a) y las células 95D (B). densidad de banda relativa de MMP9 y ICAM-1 para el valor medio del grupo de control (C-H). Los valores se expresan como intensidad relativa normalizó a GAPDH y la intensidad se dan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt;. 0,001 frente a control
Discusión
El bajo costo de producción y la relativa facilidad para sintetizar Au-PN hacen factibles para futuras aplicaciones biomédicas. Sin embargo, con el paso de los NP-Au de la mesa de trabajo a la clínica, se requiere mucho más conocimiento sobre las interacciones fundamentales entre los materiales a nanoescala y los sistemas biológicos. La bioseguridad y la biocompatibilidad de Au-PN son preocupaciones vitales que debe demostrarse antes de tales materiales se aplican a los sistemas biológicos. Al igual que en muchos otros informes [24], [25], en este estudio, Au-PN fueron llevados fácilmente por A549 y 95D células a través de endocitosis no específica y localizada dentro de las vesículas citoplasmáticas. En este estudio, hemos demostrado que pequeñas Au-NPs con un diámetro de 5 nm presentan una alta eficacia en la inhibición de la proliferación, la promoción de la apoptosis, y la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 en dos líneas celulares de cáncer de pulmón. En contraste, no se observó citotoxicidad obvia en 10 nm, 20 nm, y 40 células tratadas-Au-NP nm, lo que está de acuerdo con los resultados de otros grupos de investigación. Estudios anteriores mostraron que el tamaño de la superficie, la superficie y la carga no, juega un papel importante en el efecto terapéutico de Au-PN [26]. Generalmente, Au-NPs para aplicaciones de suministro de fármacos y terapia fototérmica tiene dimensiones mayores que 10 nm, que es suficiente para disminuir la reactividad de la superficie y por lo tanto hacer núcleos de oro benigna. Un tamaño mayor que 6-8 nm también es óptimo de exclusión de excreción renal y, en consecuencia la disminución de la vida media circulatoria [27]. Inesperadamente, nuestros resultados mostraron que la proliferación de células A549 fue ascendido después de tratamiento de 24 h con Au-NPs de 20 nm o 40 nm de diámetro. Este fenómeno no se observó en las células 95D. Por otra parte, 5-nm Au-NPs y 10-nm promueven significativamente la invasión de A549 y 95D células, respectivamente, mientras que la capacidad invasiva no se vio afectada en presencia de partículas con un tamaño mayor que 20 nm. Estos resultados apoyan la opinión de que Au-PN no lo hace universalmente dirigirse a todos los tipos de células [28]. Coulter et al. encontró que la fracción de supervivencia de las células tratadas con Au-PN mostró una fuerte dependencia del tipo de célula en comparación con la de las células no tratadas con respecto al potencial de sensibilización radiológica [24].
En nuestro estudio, la capacidad de mejorar la invasión era acompañada de una regulación por incremento notable de ICAM-1 y la expresión de MMP-9. La invasión a través de la ECM es un paso importante en la metástasis tumoral. Las células cancerosas inician la invasión de la adhesión y difusión a lo largo de la pared del vaso sanguíneo. Las metaloproteinasas de matriz son endopeptidasas que son capaces de degradar los componentes de ECM, que permite a las células de cáncer para acceder a la vasculatura y los sistemas linfáticos [29] - [31]. MMP-9 ha atraído mucha atención por su capacidad para degradar el colágeno tipo IV, el componente básico de la membrana basal [32]. El aumento de expresión de MMP-9 en pacientes con cáncer no microcítico de pulmón de células ha informado [33], [34]; por lo tanto, agentes de supresión de la expresión de los MMPs podrían inhibir la migración de células de cáncer y la invasión [35]. ICAM-1 es una molécula de adhesión representante involucrados en la interacción entre las células tumorales, el endotelio, y ECM. Alta expresión de ICAM-1 en muestras de cáncer de pulmón humano se correlaciona con un mayor riesgo de cánceres avanzados (estadios III y IV). Se muestran las células A549 /ICAM-1 para inducir la invasión in vitro de células y la metástasis tumoral in vivo [36] en. Denissenko et al. observado que ICAM-1 downregulation en el ARNm y los niveles de proteína dieron lugar a una fuerte supresión de la invasión de células de mama humano a través de una matriz de Matrigel [37]. Se encontró que 5 nm y 10 nm-Au-NPs promover eficazmente la expresión de ICAM-1 y MMP9 en A549 y 95D células, respectivamente, que explica en parte la acción mejorada de las partículas sobre la invasión de células de cáncer.
Dado que los efectos regulación al alza de Au-PN sobre la MMP-9 y la ICAM-1 de expresión en A549 y células 95D sugirieron que las partículas pequeñas pueden poseer la capacidad de facilitar la invasión de las células del cáncer de pulmón, estudios in vivo adicionales son necesarios para confirmar los mecanismos. En resumen, el tratamiento con 5-nm Au-NPs inhibe eficazmente la proliferación de células y promueve la apoptosis, pero también upregulated la expresión de ICAM-1 y MMP9, así como el aumento de la invasión de las células A549. Por el contrario, Mukherjee et al. informó de que Au-NP (5 nm de diámetro) exhibe propiedades anti-angiogénicos (es decir, inhibe el crecimiento tumorigénico de nuevos vasos sanguíneos) tanto in vitro como in vivo [38].