Extracto
En los pacientes diabéticos complicados con cáncer colorrectal (CCR), se informó que el tratamiento con metformina tener correlación diversa con la mortalidad por CCR-específica. En estudios de laboratorio, se informó de la metformina para afectar a la supervivencia de las células madre del cáncer (CSC) en cánceres de mama y de páncreas y el glioblastoma. Aunque cscs desempeñan un papel fundamental en la resistencia a 5-fluorouracilo (5-FU) la quimioterapia en pacientes con CRC, el efecto de la metformina sobre cscs en pacientes con CRC y el efecto sinérgico de la metformina en combinación con 5-FU en cscs no se reportan. En el presente estudio se realizaron exámenes patológicos en 86 pacientes con CRC complicadas con DM tipo 2 que habían sido divididos en un grupo de metformina y un grupo no-metformina. Las comparaciones con respecto al tipo patológico, la incidencia de la metástasis, la expresión de CD133 y β-catenina se llevaron a cabo entre los dos grupos. Hemos explorado los efectos sinérgicos de la metformina en combinación con 5-FU en la proliferación, ciclo celular, la apoptosis y la proporción de CD133 + cscs de líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW620. Los resultados muestran que el tratamiento con metformina tuvo correlaciones inversas con la proporción de pacientes con adenocarcinoma pobremente diferenciado, la proporción de cscs CD133 + en pacientes con CCR con DM tipo 2. La metformina mejora los efectos antiproliferativos de 5-FU en cscs CD133 + en las células SW620. Estos resultados proporcionan un complemento importante de estudio previo. La inhibición de la proliferación de cscs CD133 + puede ser un posible mecanismo responsable de la asociación de uso de metformina con mejores resultados en pacientes con CRC CRC con diabetes tipo 2
Visto:. Zhang Y, Guan M, Z Zheng, Zhang Q , Gao F, Xue Y (2013) Efectos de la metformina sobre las células CD133 + cáncer colorrectal en pacientes diabéticos. PLoS ONE 8 (11): e81264. doi: 10.1371 /journal.pone.0081264
Editor: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Julio, 2013; Aceptado: 2 Octubre de 2013; Publicado: 21 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una beca de la provincia investigación de Tecnología Industrial desarrollode proyectos, no. (2010) 207 y el Fondo de Investigación de la Asociación Farmacéutica de Guangdong para la medicación de la diabetes tipo 2, el NO. 2012C07, Guangdong, China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Gestión de los pacientes diabéticos complicado con el cáncer colorrectal (CCR) es un gran desafío para los médicos. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la diabetes mellitus (DM) está estrechamente relacionado con la incidencia de cánceres, especialmente malignidad gastrointestinal [1,2]. Un meta-análisis de 15 estudios con un total de más de 2,5 millones de personas, mostró que la diabetes se asoció con un aumento del riesgo de CCR 30% [3]. Por otra parte, la diabetes se asocia significativamente con el aumento general y CRC-mortalidad específica [4,5], mientras que la metformina (clorhidrato de 1,1-dimetil biguanida), el fármaco antidiabético oral más ampliamente prescrito para la DM tipo 2 [6,7], puede disminuido riesgo de cáncer y la mortalidad por CCR-específica en pacientes diabéticos [8]. La evidencia acumulada sugiere que la metformina podría ser un fármaco potencial para la quimioprevención del CRC en pacientes diabéticos. En nuestro estudio previo, la metformina inhibe el crecimiento de células SW-480 incubadas con o sin productos finales de glicación avanzada (AGE) y regula a la baja la expresión de ciclina D1 y la actividad de la telomerasa [9,10]. Se han notificado los efectos antineoplásicos de la metformina para ser asociado con la activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) vía de señalización, la mejora de la resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia [11,12].
Más recientemente, otro beneficio antineoplásica de se informó de la metformina. Se podría inhibir la supervivencia de las células madre del cáncer (células madre cancerosas, las células madre-como iniciadoras del tumor: CATI) en la mama, y cáncer de páncreas y el glioblastoma in vitro [13,14]. Como células madre cancerosas poseen el potencial para iniciar y sostener el crecimiento tumoral y la metástasis, que son responsables de la resistencia a la quimioterapia y la recurrencia de los cánceres, en el que la vía de señalización /β-catenina Wnt puede estar implicado [15,16]. Las células CD133 positivas (CD133 +) separados por CCR exhiben las propiedades de las células madre cancerosas, como la auto-renovación y alto potencial tumorigénico. En el cáncer de mama, CD133 ha sido reportado como un marcador útil para la predicción de la eficacia de la quimioterapia y la recurrencia [17]. papeles similares de CD133 también se han identificado en CRC. La alta proporción de células CD133 + es altamente correlacionado con una pobre supervivencia global (SG) en pacientes con CRC [18]. Sin embargo, no hay ninguna investigación sobre la correlación entre el tratamiento con metformina y la proporción de CD133 + células madre cancerosas en pacientes con CCR.
Lo que es más, no hay ninguna investigación ya sea en la correlación entre el tratamiento con metformina y el 5-fluorouracilo (5-FU) quimioterapia. La metformina ha sido recientemente descrito que tienen un efecto sinérgico en combinación con un poco de quimioterapia [19,20]. 5-FU, un fármaco quimioterapéutico de primera línea para pacientes con CRC, se utiliza generalmente en combinación con otros fármacos quimioterapéuticos para mejorar la eficacia terapéutica, ya que la resistencia a 5-FU probablemente se produce en pacientes con CRC avanzada y con frecuencia conduce al fallo de la quimioterapia [ ,,,0],21]. Por lo tanto, necesita ser explorado si la metformina se puede utilizar en combinación con 5-FU para mejorar el efecto antiproliferativo de 5-FU en CRC. Teniendo en cuenta el importante papel de las células madre cancerosas en la progresión tumoral hipótesis de que el papel positivo de la metformina en el CCR podría ser aportado en parte a su efecto antiproliferativo sobre las células madre cancerosas colorrectales.
Con el fin de aclarar cómo metformina afecta a la patogénesis y la progresión patológica de CRC con DM tipo 2, hemos examinado las asociaciones de metformina con el tipo patológico y la incidencia de metástasis de CCR en pacientes diabéticos complicados con la CRC y la efecto antiproliferativo de la metformina sobre células madre cancerosas colorrectales (CD133 +) también. Con el fin de entender cómo metformina de forma sinérgica con el 5-FU que afecta el comportamiento celular de CRC, se examinaron los efectos sinérgicos de la metformina sobre la expresión de células CD133 + en combinación con 5-FU in vitro.
Materiales y Métodos
Este estudio fue aprobado por el comité ético del hospital Nanfang, Universidad médica del Sur.
el comité de ética del hospital Nanfang renunció a la necesidad del consentimiento de los pacientes ya que las muestras se adquirieron desde el banco de tejidos del Departamento de patología, hospital Nanfang, Universidad médica del Sur.
1.1.1 pacientes y diseño del estudio
Un total de 187 pacientes diabéticos tipo 2 sometidos a resección de CRC en el hospital Nanfang, Universidad médica del Sur en Guangzhou, china entre enero de 2010 y junio de 2012. se recuperaron las historias clínicas de estos pacientes para la investigación epidemiológica de sus características demográficas y clínicas. También se investigó el uso de otros medicamentos para la diabetes (sulfonilureas, tiazolidinedionas, inhibidores de la alfa-glucosidasa, insulina, y así sucesivamente). La mediana de edad fue de 64 años de edad (que van desde 29 a 87 años de edad) y 119 (63,64%) de los pacientes eran mayores de 60 años de edad. 88 (47,06%) de los pacientes habían recién diagnosticado diabetes mellitus tipo 2. La duración de la DM de menos de 5 años y más de 5 años un porcentaje del 26,74% (50/187) y 22,99% (43/187), respectivamente. Los otros (6/187, 3,21%) no tenían información clara acerca de la duración de la DM. Finalmente, 86 pacientes con historias clínicas completas se inscribieron en este estudio y se dividieron en dos grupos de acuerdo con el uso de la metformina. En el grupo tratado con metformina hubo 36 pacientes que habían usado consistentemente metformina antes del diagnóstico de CCR y en el grupo de metformina no había 50 pacientes. muestras patológicas de 37 pacientes que se sometieron a la radioterapia ni quimioterapia ni antes de la resección del CRC se recuperaron para el examen inmunohistoquímico de la expresión de CD133 y β-catenina.
Los dos grupos se compararon en términos demográficos, características clínicas y los hallazgos de laboratorio. datos demográficos del paciente y las características clínicas incluyeron la edad al momento del diagnóstico, sexo, duración de la diabetes, índice de masa corporal (IMC), presión arterial sistólica /diastólica (PAS /PAD). Los hallazgos de laboratorio incluyen la glucosa en plasma en ayunas (FPG), hemoglobina A1c (HbA1c), el nitrógeno de la orina en sangre (BUN), creatinina (CR), triglicéridos (TG), colesterol total (T-Chol), colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), muy colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (VLDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL), así como la información relativa al diagnóstico CRC, incluyendo la histología, la diferenciación y la metástasis. La fecha de diagnóstico CRC se definió como el día del diagnóstico anatomopatológico definitivo.
1.1.2 Exámenes inmunohistoquímicos
Las muestras de tejido de cada paciente de los 37 pacientes fueron fijadas en formol e incluidos en parafina. Seguidamente, las secciones de parafina fueron desparafinados antes, se calentaron durante 20 minutos a 105 ° C en tampón de recuperación de antígeno (Jinqiao Zhongshan BioTech, Pekín, China). Después de bloquear con suero de cabra al 10%, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos monoclonales primarios, respectivamente, contra CD133 (BIOS, China, dilución 1: 150) y β-catenina (Cell Signaling Technology, EE.UU., dilución 1: 200) durante la noche a 4 ° C seguido de peroxidasa de rábano picante marcada con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente. Y luego, los portaobjetos se revelaron con tetrahidrocloruro diaminoben-zidine (DAB) y de contraste con hematoxilina.
1.1.3 Evaluación inmunohistoquímica
Para cada diapositiva, al menos 5 campos (dentro del tumor) y & gt; 500 células se analizaron con alta potencia (magnificación × 400) microscopia por dos patólogos. Las muestras se definieron como positivas para la expresión CD133 si las células tumorales se tiñeron claramente por los anticuerpos anti-CD133. Los resultados se clasificaron en dos niveles: & lt; 10% y ≥10% de células CD133 positivas
.
Se registraron las expresiones de β-catenina en la membrana celular y en el citoplasma y núcleos. A & gt; 70% de expresión de β-catenina en la membrana celular se consideró normal, registrado como negativo (-), mientras que a & gt; expresión 10% de β-catenina en el citoplasma y los núcleos se considera anormal, registrado como positivo (+ ).
1.2.1 líneas celulares y condiciones de cultivo celular
La línea celular de cáncer colorrectal humano SW620 se obtuvo de la ATCC (EE.UU.) y se mantuvo en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de bovino fetal suero (FBS; PPA, Austria) en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 ° C. 5-FU y la metformina se adquirieron de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.. Para evaluar los efectos de la metformina en combinación con 5-FU, se trataron las células con o sin metformina (5 mM) durante 24 h, y después se lavaron con PBS, se trató después por 5-FU (5μΜ) por otro 48h.
1.2.2 Ensayos de proliferación celular
células SW620 se sembraron en placas de 96 pocillos antes del tratamiento con o sin metformina seguido de 5-FU durante 24, 48 y 72 h, respectivamente. La proliferación celular se midió con el 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT; 5 mg /ml; Sigma, MO, EE.UU.) de ensayo. Después de tiempo de tratamiento apropiado, MTT se añadió a una concentración final de 1 mg /ml, y la mezcla de reacción se incubó durante 3 horas a 37 ° C. Los cristales resultantes se disolvieron en HCl 0,04% en isopropanol y la absorbancia se leyó a 562 nm. Cada tratamiento se realizó por triplicado y cada experimento se repitió dos veces.
ensayos
1.2.3 del ciclo celular
células SW620 fueron pre-tratados con metformina durante 24 h o no, y luego tratados con 5-FU durante 48 h. Las células se recogieron en una fase de crecimiento exponencial, y las suspensiones de una sola célula que contienen células 1x106 se fijaron con alcohol 70%. ciclo celular se controló usando yoduro de propidio (PI) tinción de los núcleos. La fluorescencia de PI unido a ADN en las células se midió con un citometría de flujo (BD Biosciences). Los resultados se analizaron con el software ModFit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME). El experimento se realizó tres veces. La proporción de células en la fase G0 /G1, intra-S, y G2 /M fases se expresaron como media ± desviación estándar.
1.2.4 Evaluación de la apoptosis
La apoptosis se detectó mediante citometría de flujo a través de examen de la plasma de fosfolípidos de membrana embalaje alterado por colorante lipófilo Anexina V. brevemente, se recogieron las células tratadas y se lavaron dos veces con PBS antes de se resuspendieron a una concentración de 1 x 106 células /ml en tampón de unión de acuerdo con las instrucciones del fabricante (AnnexinV: FITC Kit de Detección de la apoptosis, BD Pharmingen, CA, EE.UU.). A partir de entonces, se añadieron 5 l de anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio (PI) en 100 l de suspensión de células y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de añadir 400 l de tampón de unión, las células marcadas se contaron a los 30 minutos por el flujo FACS Calibur citómetro (Becton-Dickinson, Mountain View, California). células apoptosis temprana células necróticas apoptosis /tardío (doble positivo) (Anexina V-positivo, PI-negativa),, así como células vivas (doble negativo) se midieron antes de su posterior análisis por el software Cell Quest (Becton-Dickinson).
1.2.5 Detección de células CD133 positivas
Después se prepararon y trataron como se describe, se recogieron y se tiñeron con anticuerpo anti-CD133 (IgG monoclonal de ratón las células tumorales SW620 células, 1: 10 , Milteny Biotec) o anticuerpo IgG1 de control de isotipo (Milteny Biotec) durante 30 minutos en la oscuridad a 2-8 ° C. CD133 tinción se analizó mediante citometría de flujo (Becton Dickinson, San Jose, CA). Los experimentos se realizaron por triplicado. La proporción de células CD133 + se expresan como media ± desviación estándar.
1.3 estadístico El análisis
Los datos se presentan como media + desviación estándar (SD) y se analizaron con el programa SPSS v.16.0 software estadístico (Abbott laboratorios, North Chicago, IL). Una forma de análisis de varianza (ANOVA) y, a continuación de Student no apareado
t
-test se utilizaron para determinar los efectos de diferentes variables. Las asociaciones entre las expresiones de CD133 y β-catenina y parámetros clínico se analizaron con el uso de chi-cuadrado de Pearson (χ
2) prueba y la prueba exacta de Fisher.
valor de p
menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
2.1.1 Datos demográficos del paciente y las características clínicas
Datos demográficos del paciente y las características clínicas se resumen en la Tabla 1. no hubo diferencias significativas entre los grupos de metformina y no metformina en cuanto a edad al momento del diagnóstico, la presión arterial, índice de masa corporal, la duración de la diabetes, glucosa plasmática en ayunas, HbA1c, BUN, CR, ALB, TG, T-chol, HDL , o los niveles de VLDL en la línea de base, pero el nivel de LDL fue significativamente menor en el grupo de metformina que en el grupo no metformina (p = 0,024). En cuanto a las características patológicas entre los dos grupos, la proporción de pacientes con adenocarcinoma pobremente diferenciado en el grupo de metformina fue significativamente menor que en el grupo no metformina (2,78% frente a 16,0%, p = 0,048). Además, la tasa de metástasis a distancia en el grupo de metformina fue significativamente menor que en el grupo no metformina (5,60% frente a 21,6%, p = 0,035). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa entre los dos grupos en la metástasis de los ganglios linfáticos (tabla 2).
Grupo de metformina (n = 36)
grupo no metformina (n = 50) p
edad media al diagnóstico (años) 66,19 ± ± 9.8863.22 9.940.725DM duración (años) 4,99 ± 3.685.75 ± 4.700.334BMI (kg /m
2) 22.39 ± ± 3.4125.09 3.450.894SBP ( mmHg) 144,72 ± ± 21.82137.66 19.230.199DBP (mmHg) 80.11 ± ± 9.7277.98 17.720.306BUN (mmol /L) 6,92 ± 9.836.42 ± 3.780.430CR (mmol /L) 92,61 ± ± 69.2197.94 108.490. 253ALB (g /L) 34,96 ± ± 6.9333.71 5.760.063FBG (mmol /L) 8,63 ± 2.099.27 ± 2.950.080HbA1c (%) 6,78 ± 1.067.61 ± 1.990.083TG (mmol /L) 1,75 ± 1,282. 51 ± 3.070.132T-Chol (mmol /L) 4,44 ± 0.835.42 ± 4.260.173HDL (mmol /L) 1,25 ± 0.251.27 ± 0.850.203LDL (mmol /L) 2.27 ± 0.522.41 ± 1.070.024VLDL ( mmol /L) 0.88 ± 0.490.95 ± 0.540.741Table 1. Datos demográficos del paciente y las características clínicas al inicio del estudio.
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grupo de metformina (n = 36)
grupo no metformina ( n = 50)
p
patológica characteristicsWell adenocarcinoma12 diferenciado (33,33%) 13 (26,0%) adenocarcinoma21 0.460moderately diferenciado (58,33%) 22 (44,0%) adenocarcinoma1 0.190poorly diferenciado (2,78%) 8 (16.0%) adenocarcinoma2 0.048mucinous (5,56%), carcinoma01 6 (12,0%), con células en anillo 0.310signet (2,0%), Metastasislymph node7 (19,44%) 14 (28,0%) 0.257distant2 (5,60%) 11 (21,6%) 0.035Table 2. características patológicas y la metástasis en dos grupos.
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2.1.2 expresiones de CD133 y β-catenina en las muestras de CRC
patrones de inmunohistoquímica de CD133 y β-catenina expresiones fueron analizados en muestras de CRC . señales de color marrón CD133 se observaron en la membrana celular, especialmente en su luminal y la superficie basal. En general, una mayor intensidad de la tinción de CD133 indica mayor porcentaje de células tumorales CD133 + (Figura 1, panel 1). En el grupo de metformina, 15 de los 19 especímenes de CRC (78.9%) contenían células tumorales CD133 positivas de menos de 10% mientras que el otro 4 (21,1%) contenía células tumorales CD133-positivo más de 10%. Aunque la mitad de las muestras de CRC (9/18, 50,0%) en el grupo sin metformina contenía células tumorales CD133 positivas más del 10%,
la diferencia entre los dos grupos no alcanzó un nivel significativo gratis (
p = 0,065
). (Tabla 3)
(A): débilmente positivo o tinción positiva focalmente en el 10% de las células; (B): moderadamente o fuertemente positiva-tinción que implica 10% o más de las células; (C) y (D): la tinción de CD133 en la superficie luminal y la superficie basal de las células cancerosas. Grupo 2: (A): la expresión citoplasmática o nuclear de β-catenina estaba ausente; (B): expresión nuclear de β-catenina fue de menos de 10% de las células de cáncer; (C) y (D):. Acumulación nuclear generalizada de β-catenina
Expresión positiva
*
grupo de metformina (n = 19)
grupo no metformina (n = 18)
p-valor
CD1334 (21,1%) 9 (50,0%) 0.065β-catenin7 (36,8%) 13 (72,2%) 0.031Table 3. Las expresiones de CD133 y β-catenina en dos grupos.
* mayor que o igual a la expresión 10% de CD133 en las células se registró como positivo; & Gt; 10% de expresión de β-catenina en el citoplasma y los núcleos se registró como positivo. CSV Descargar CSV
La expresión de β-catenina era claramente evidente en los límites de célula-célula y en el citoplasma en una mayoría de muestras de CRC, mientras que en algunas de las células se observó la acumulación nuclear de la proteína β-catenina (Figura 1, panel 2 ). Hubo una diferencia significativa entre los dos grupos en la tasa positiva de expresión de la proteína β-catenina (p = 0,031). La tasa de acumulación nuclear de β-catenina en más de 10% de las células tumorales fue significativamente menor en el grupo de metformina que en el grupo no metformina (7/19, 36,8% vs 13/18, 72,2%; p = 0,031) . (Tabla 3)
Existe una correlación positiva significativa entre la expresión de CD133 y β-catenina (p = 0,028).
La expresión de CD133 se correlaciona con el tipo patológico de CRC pero no alcanzó un nivel significativo (p = 0,056
). No existe una correlación significativa entre la β-catenina y el tipo patológico de CRC (p = 0,335).
2.2.1 efecto antiproliferativo de 5-FU solo y en combinación con metformina en las células SW620
In vitro, las células SW620 fueron tratados respectivamente con 5-FU solo y con una combinación de 5-FU y metformina. La proliferación de las células SW620 en ambos grupos aumentó con la ampliación del tiempo. Hemos observado que el tratamiento previo metformina seguido de 5-FU tratamiento inhibió significativamente la proliferación de las células SW620 en comparación con el tratamiento de 5-FU solo (1,019 ± 0,181 vs 1,218 ± 0,090, p = 0,058 para 24 h de exposición; 1.075 ± 0.118 vs 1,644 ± 0,219, p = 0,001 para la exposición 48 h; 1.299 ± 0.147 vs 1.786 ± 0.109, p & lt; 0,001 para 72 h de exposición). (Figura 2A)
B: La proporción de células SW620, ya sea en G0 /G1 o G2 /M fase no se cambió obviamente entre los tres grupos (p = 0,06 y p = 0,248, respectivamente), pero la metformina pretratamiento redujo significativamente la proporción de células SW620 en la fase S (24,14 ± 6,01 vs 39,62 ± 0,88, P = 0,003). **, P. & Lt; 0,01 para comparaciones de tratamiento MET + 5-FU, respectivamente, con el tratamiento y el control de 5-FU
2.2.2 Efecto sinérgico de metformina y 5-FU en el ciclo celular de SW620 células
para investigar el efecto de la metformina en combinación con 5-FU en el ciclo celular, pretratados SW620 células con metformina para 24 h antes del 5-FU tratamiento. A partir de entonces, las proporciones de células SW620 en G0 /G1, S, y G2 /M fases se analizaron por citometría de flujo. Se observó que no había ninguna diferencia significativa entre los tres grupos en la proporción de células SW620 en G0 /G1 o G2 /M fase (p & gt; 0,05), mientras que el pretratamiento con metformina redujo significativamente que en la fase S en comparación con el 5-FU tratamiento solo (24,14 ± 6,01% frente a 39,62 ± 0,88%, p = 0,003) (Figura 2B).
2.2.3 Efecto del tratamiento con MET + 5-FU sobre la apoptosis de las células SW620
El porcentaje de células apoptóticas aumentó de forma significativa por el tratamiento previo metformina seguido de tratamiento con 5-FU en comparación con 5-FU tratamiento solo (tasa de apoptosis temprana: 3,50 ± 0,44% vs 2,33 ± 0,38%, p = 0,029; índice de apoptosis con retraso: 11.80 ± 4,15% vs 5,30 ± 2,10%, p & lt; 0,001) (Figura 3A).
*, p & lt; 0,05 y ***, p & lt; 0,001 para la comparación entre el grupo tratado con MET + 5-FU y el grupo que sólo el 5-FU. B: La proporción de células CD133 + se redujo significativamente por el MET + 5-FU tratamiento en comparación con el 5-FU solo tratamiento (15,13 ± 3,43 vs 21,30 ± 1,40; p = 0,027). Los valores se expresan como media ± desviación estándar.
2.2.4 Efectos de la MET + 5-FU tratamiento sobre la proporción de células CD133 +
La proporción de células CD133 + se determinó mediante citometría de flujo. 27,63 ± 2,58% de las células SW620 expresó el antígeno de membrana CD133 y tanto el 5-FU solo y tratamientos MET + 5-FU redujo significativamente la proporción de células CD133 positivas. Además, el tratamiento previo metformina durante 24 h seguido de 5-FU tratamiento durante 48 h reforzó significativamente el efecto inhibidor de 5-FU tratamiento solo en la proporción de células CD133-positivos (15,13 ± 3,43 vs 21,30 ± 1,40; p = 0,027) (Figura 3B).
Discusión
En los pacientes con CRC complicadas con diabetes tipo 2, el presente estudio mostró que la tasa de metástasis a distancia en el grupo tratado con metformina fue significativamente menor que en el grupo sin fines de metformina (5,60% vs. 21,6%, p = 0,035) y la proporción de pacientes con adenocarcinoma pobremente diferenciado fue significativamente menor en el grupo de metformina que en el grupo no metformina (2,78% frente a 16,0%, p = 0,048). Estos resultados muestran otro beneficio de la metformina en pacientes con CRC. En la última década, los estudios epidemiológicos y ensayos de gran tamaño, controlados aleatorios (ECA), como ADOPT (A Resultado de la Diabetes Trial Progresión) y RECORD (Rosiglitazona evaluados para los resultados cardiovasculares y el Reglamento de la glucemia en la diabetes), han sugerido una correlación inversa entre la metformina usar y el riesgo de cáncer, especialmente el riesgo de cáncer colorrectal (CRC), en comparación con otros tratamientos antidiabéticos [22,23]. El tratamiento con metformina dio lugar a un menor riesgo de mortalidad global y la mortalidad por CCR-específico en pacientes con CCR con diabetes [24]. Un estudio prospectivo aleatorio mostró que el tratamiento con metformina redujo el número de rectal focos de criptas aberrantes (ACF), un marcador sustituto endoscópica del CCR, en pacientes sin diabetes [25]. En varias líneas celulares de cáncer y modelos animales, el tratamiento con metformina ejerce efectos antiinvasive y antimetástasis [26-29]. Sin embargo, pocos estudios evaluaron las correlaciones de tratamiento con metformina con la metástasis del cáncer y con el tipo histológico de cáncer en las poblaciones humanas. El presente estudio es un intento preliminar de los nuestros para explorar estas preguntas. La fuerza de esta investigación es nuestra observación patológica de un subgrupo de pacientes con CCR con la diabetes tipo 2 concomitantes que estaban recibiendo tratamiento con metformina. Hemos encontrado evidencia patológica sólido apoyo a una notable asociación de metformina con mejores resultados en estos pacientes, lo que activó nuestro estudio más a fondo en algunos de los mecanismos que subyacen a la asociación.
En nuestro estudio previo, la proliferación de las células SW480 se inhibió significativamente por el tratamiento con metformina de la dosis y dependiente del tiempo de manera que pueda debido a la baja regulación de la expresión de ciclina D1 y la actividad de la telomerasa por la metformina [ ,,,0],9,10]. En el presente estudio, mostramos que la metformina tiene efectos sinérgicos con 5-FU en el ciclo de proliferación y celular de las células SW620. El inhibidor del crecimiento significativa y efectos pro-apoptóticos de la metformina sobre las células cancerosas probablemente debido a la activación de LKB1 /AMPK y la mejora de la resistencia a la insulina [19,20,30]. Además, también se ha informado de Ras /Raf /MAPK y metabolismo de la glutamina reductora para desempeñar un papel en el efecto antineoplásico de la metformina [19]. Más recientemente, se informó de la metformina para afectar a la supervivencia de las células madre cancerosas en varias líneas celulares de cáncer [13,14]. CSC se han identificado como dianas terapéuticas para la progresión del tumor [31], ya que juegan un papel importante en la génesis y la recurrencia de tumores, metástasis y la resistencia a la quimioterapia, como resultado de dos propiedades críticas: capacidad de auto-renovación y diferenciación potencial en poblaciones heterogéneas ilimitadas de células cancerosas. Posteriormente, se analizó el efecto del tratamiento con metformina sobre las células madre cancerosas colorrectales en pacientes con CRC, mediante sus muestras patológicas. por tanto, hemos encontrado una correlación inversa del tratamiento con metformina con CD133 + células madre cancerosas en pacientes con CCR. CD133 se ha creído que es el más robusto marcador de superficie de células madre cancerosas colorrectales. Los pacientes con expresión de CD133-alta parecía tener una tasa mucho más baja de SG a 5 años y más posibilidades de T3, 4 invasión tumoral, N positivo y la invasión vascular que aquellos con CD133-baja expresión [32].
Después de nuestro hallazgo de la asociación del tratamiento con metformina con la proporción de CD133 + células madre cancerosas en el CCR de estos pacientes, que investigarse más a fondo el efecto sinérgico de la metformina más el tratamiento con 5-FU en la proporción de células CD133 + y la expresión de proteína β-catenina en las células SW620. Hemos puesto de manifiesto que la metformina en combinación con 5-FU disminuyó significativamente tanto la proporción de células CD133 + y la expresión de la proteína β-catenina, que indica la metformina podría tener un efecto antineoplásico sinérgico sobre CRC por inhibting la proliferación de las células madre cancerosas a través de la vía de β-catenina. Un efecto antineoplásico similar de metformina ha sido reportado en cáncer de mama [20]. Aunque 5-FU es el agente quimioterapéutico más común en el tratamiento de CRC, la resistencia a este fármaco es muy común en la quimioterapia de los pacientes de CRC. La activación de la vía /β-catenina Wnt en CD133 (+) células madre cancerosas colorrectales puede ser responsable de la resistencia de la quimioterapia en el CCR [15,16,33]. Recientemente, se informó de activadores de AMPK para suprimir el crecimiento de células de cáncer cervical mediante la inhibición de Wnt /β-catenina vía [34]. La inhibición de la vía de Wnt /β-catenina por AMPK puede ser responsable del efecto sinérgico de la metformina en combinación con 5-FU en la proliferación de las células madre cancerosas colorrectales. Es evidente que nos encontramos con el tratamiento combinado de metformina más 5-FU tenido un efecto significativamente mejor antineoplásico que el tratamiento de 5-FU solo, lo que sugiere que el tratamiento combinado podría ser una quimioterapia estándar potencial para pacientes con CRC, sobre todo para los que están altamente resistentes a 5-FU. Por supuesto, otras investigaciones, tanto de ensayos clínicos y experimentos de laboratorio, son necesarios para verificar esta hipótesis.
En conclusión, nuestro estudio confirma además que la metformina no es sólo un antidiabético, sino también un medicamento potencial contra el cáncer. Nuestros resultados revelan correlaciones inversas de tratamiento con metformina con la incidencia de metástasis a distancia y adenocarcinoma pobremente diferenciado, la tasa positiva de CD133 y la expresión de la proteína β-catenina en pacientes con CRC con el tipo 2 DM. También demuestran los efectos sinérgicos de la metformina en combinación con 5-FU sobre la biología celular y la proporción de células CD133 + in vitro. Sin embargo, el mecanismo de metformina interferir con la proliferación de las células madre cancerosas permanece indeterminado. En el futuro, se necesitan ECA prospectivos para investigar el efecto de la metformina en combinación con 5-FU en el pronóstico de pacientes con CRC y los mecanismos subyacentes debe ser analizada más.
Reconocimientos
Deseamos agradecer al Prof. Yanqing Ding, el director del Departamento de Patología, y Hongfen Shen, un técnico en el Instituto de Investigación del Cáncer de la Universidad Médica del Sur, Guangzhou, China. También reconocemos los útiles comentarios y revisiones de este manuscrito por el Prof. Allen Ping Liang.