Extracto
Los cambios epigenéticos, incluyendo la metilación aberrante del ADN, como resultado la expresión de genes alterados y jugar un papel importante en la carcinogénesis. Los fitoquímicos tales como el sulforafano (SFN) y 3,3, diindolylmetano (DIM) son prometedores agentes quimiopreventivos para el tratamiento de cáncer de próstata. Ambos han sido demostrado que induce la re-expresión de los genes, incluidos los genes supresores de tumores silenciados en células de cáncer, a través de la modulación de las marcas epigenéticas incluyendo la metilación del ADN. Sin embargo, no estaba claro los efectos SFN y poco clara en la metilación del ADN en una escala genómica. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos en todo el genoma de SFN y poco clara en la metilación del promotor en las células epiteliales normales de la próstata y las células de cáncer de próstata. Tanto SFN y el tratamiento DIM disminución de la expresión de ADN metiltransferasa en las células epiteliales de próstata normales (PrEC), y células cancerosas (PC3) de próstata dependientes de andrógenos (LnCAP) y independiente de andrógenos. Los efectos de la SFN y poco clara en los perfiles de metilación del promotor en PrEC normales, las células LNCaP y cáncer de próstata PC3 se determinaron utilizando inmunoprecipitación metil-ADN seguida de matriz de metilación del ADN en todo el genoma. Nos mostró cambios generalizados en los patrones de metilación del promotor, incluyendo el aumento o disminución de metilación, en las tres líneas celulares de próstata en respuesta a SFN o tratamientos DIM. En particular, SFN y DIM alterada metilación del promotor en distintos conjuntos de genes en PrEC, LNCaP y PC3 células, pero compartida objetivos de genes similares dentro de una única línea celular. Demostramos además que SFN y DIM invierten muchas de las alteraciones de metilación asociados con el cáncer, incluidos los genes aberrantemente metilados que se dysregulated o están altamente implicados en la progresión del cáncer. En general, nuestros datos sugieren que tanto SFN y DIM son moduladores epigenéticos que tienen efectos amplios y complejos en los perfiles de metilación del ADN tanto en células epiteliales de próstata normales y cancerosas. Los resultados de nuestro estudio pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos epigenéticos mediante el cual SFN y Dim ejercen sus efectos quimiopreventivos de cáncer
Visto:. Wong CP, Hsu A, Buchanan A, Palomera-Z Sánchez, Beaver LM, Houseman EA , et al. (2014) Efectos de sulforafano y 3,3-Diindolilmetano en la metilación del promotor de genoma completo en las células normales de la próstata y las células epiteliales del cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (1): e86787. doi: 10.1371 /journal.pone.0086787
Editor: Bernard W. Futscher, La Universidad de Arizona, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Agosto, 2013; Aceptado: 13 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Wong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de NIH subvenciones CA90890, CA65525, CA122906, CA122959, CA80176, R01GM104977, y por NIEHS Centro ES00210 P30 subvención. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción mecanismos
epigenéticos son esenciales para la regulación y el mantenimiento de los patrones de expresión de genes. procesos epigenéticos desregulada, incluyendo la metilación del ADN aberrante, modificación de las histonas, y los perfiles de microARN, conducen a la expresión de genes alterados y la función y desempeñan un papel importante en la carcinogénesis. En particular, se observan cambios generalizados en los patrones de metilación de ADN durante la iniciación y progresión del cáncer, caracterizado por la hipometilación del ADN global y específica de sitio, así como genes específicos de la hipermetilación del promotor [1], [2]. hipometilación del ADN en el cáncer puede contribuir a la inestabilidad del genoma y aumento de la expresión de oncogenes. Por otro lado, la hipermetilación del ADN puede conducir a silenciamiento de genes supresores de tumores, factores de transcripción, así como genes implicados en la regulación del ciclo celular y la apoptosis. El establecimiento y mantenimiento de los patrones de metilación de ADN están mediados por metiltransferasas de ADN (DNMTs) [3]. La sobreexpresión de DNMTs se observa en muchos tipos de cáncer, incluyendo leucemia [4], cáncer de páncreas [5], cáncer gástrico [6], cáncer de pulmón [7], y el cáncer de próstata [8], y la expresión DNMT dysregulated probable es una de las que contribuye factores que conducen a patrones de metilación aberrante del ADN durante la progresión del cáncer. A diferencia de las mutaciones genéticas, alteraciones epigenéticas son potencialmente reversibles y representan un objetivo atractivo y prometedor para las estrategias de quimioprevención del cáncer. Muchos fármacos epigenéticos desarrollados para revertir las aberraciones de metilación del ADN y la modificación de las histonas en el cáncer están actualmente bajo investigación. Además de los agentes farmacológicos, se ha demostrado que un número creciente de micronutrientes esenciales y fitoquímicos dietéticos para actuar como moduladores epigenética, y son candidatos atractivos para uso en terapia epigenética [9], [10]. La capacidad de los factores de la dieta que ejercen efectos epigenéticos subraya la importancia potencial de nutrientes específicos y fitoquímicos bioactivos en las estrategias de regulación y la quimioprevención del cáncer epigenéticos.
El cáncer de próstata es el segundo cáncer diagnosticado más común en hombres en los Estados Unidos [11 ]. La dieta es un factor de riesgo modificable y puede influir en la susceptibilidad al desarrollo del cáncer de próstata. el riesgo de cáncer de próstata se ha demostrado que se correlaciona inversamente con el consumo de verduras crucíferas [12], [13]. En particular, el sulforafano (SFN) y 3,3'-diindolylmethane (DIM), dos fitoquímicos derivados de glucosinolatos en las verduras crucíferas han demostrado ser agentes quimiopreventivos eficaz contra el cáncer de próstata [14], [15]. SFN es un isotiocianato derivado de la hidrólisis de glucorafanina, y DIM es un producto de condensación de ácido importante de indol-3-carbinol (I3C), un producto de hidrólisis de glucobrasicina. Los efectos anticancerígenos del DIM tanto SFN y son múltiples, diversos mecanismos quimiopreventivos incluyendo la inducción de enzimas de fase 2, aumento de la apoptosis, la inducción de la detención del ciclo celular y la inhibición de la proliferación celular. Más recientemente, el aumento de la evidencia indica que SFN y DIM también pueden actuar como moduladores epigenética y ejercer propiedades contra el cáncer por la orientación marcas epigenéticas en células de cáncer de próstata. Por ejemplo, SFN y DIM pueden inhibir las actividades de la histona deacetilasa (HDAC), alterar la expresión de HDAC, y dar lugar a la re-expresión de genes supresores de tumores [16], [17]. Nosotros y otros han demostrado que la SFN se puede inhibir la expresión de DNMT y alterar la metilación del ADN en células de la próstata y cáncer de mama, lo que representa un nuevo mecanismo por el cual la quimioprevención SFN regula epigenetically expresión de genes [18] - [20]. Los efectos duales de SFN sobre la inhibición de HDAC y la metilación del ADN lo convierten en un agente de quimioprevención dietética atractivo. Sin embargo, se sabe poco sobre los efectos de SFN sobre otros objetivos de genes aberrantemente metilados, y si SFN tienen efectos diferenciales en la metilación del ADN en las células normales y cancerosas de la próstata. Además, queda por determinar si DIM de manera similar puede ejercer efectos epigenéticos duales y modular la metilación del ADN en las células de cáncer de próstata.
Se realizó este estudio para determinar los efectos en todo el genoma de SFN y poco clara en la metilación del promotor en las células epiteliales normales de la próstata y células de cáncer de próstata. Nuestra hipótesis es que tanto SFN y DIM son moduladores eficaces de la dieta de la metilación del ADN, debido a sus efectos inhibidores sobre la expresión de DNMT. Se postula además que SFN y DIM podemos afectar diferencialmente los perfiles de metilación del promotor en las células epiteliales de próstata normales y cancerosas, y revertir los genes metilados aberrantes en las células del cáncer de próstata. Nuestro estudio aumentará nuestra comprensión de los objetivos de metilación del SFN y DIM, y proporcionar conocimientos sobre los mecanismos epigenéticos mediante el cual SFN y Dim ejercen sus efectos quimiopreventivos de cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivos Celulares y condiciones de tratamiento
se obtuvieron células epiteliales de próstata humanos normales (PrEC) de Lonza (Allendale, NJ) y se cultivaron en medios basales PrEC que contienen suplementos PrEGM SingleQuot Kit y factores de crecimiento (Lonza, Allendale, NJ). Las células humanas dependientes de andrógenos de cáncer de próstata epiteliales (LnCAP) y células epiteliales de cáncer de próstata independiente de andrógenos (PC3) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA), y se cultivan en medios RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10%. Todas las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 5% de CO
2 y 37 ° C. SFN (LKT Laboratories, St. Paul, MN) y DIM (Sigma, St. Louis, MO) se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). PrEC, LNCaP y PC3 células se trataron con control de vehículo (0,03% DMSO), 15 mM SFN, o 15 mM DIM por triplicado biológicos para su uso en matrices de metilación del ADN. La dosis de tratamiento fue elegido para reflejar las concentraciones fisiológicamente relevantes de SFN y DIM [21], [22]. Las células se recogieron a las 48 h post-tratamientos para su uso en los ensayos de metilación o ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP). Para los ensayos de expresión génica, las células se recogieron a las 72 h post-tratamiento. En los grupos tratados con el agente de desmetilación del ADN, 5-aza-2'- desoxicitidina (AZA), 5 mM AZA se utilizaron y se recogieron las células a las 48 h post-tratamiento.
Preparación de muestras para la metilación del ADN array
Un total de 27 muestras se sometieron a análisis de matriz de la metilación del ADN, incluyendo muestras de cada una de las tres líneas de células tratadas con los controles del vehículo (n = 3 por línea celular), DIM (n = 3 por línea celular), y SFN (n = 3 por línea celular). El ADN genómico se aisló utilizando DNeasy Blood & amp; Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). Para la fragmentación del ADN genómico, el ADN purificado se digirió con la enzima de restricción MseI (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante la noche a 37 ° C para producir fragmentos de ADN entre 200 a 1000 pb. ADN metilado se enriqueció mediante inmunoprecipitación metil-ADN (MeDIP) según el protocolo del fabricante (Roche NimbleGen, Madison, WI). ADN MeDIP-enriquecido, así como la entrada de ADN se amplificó con GenomePlex completo kit de amplificación del genoma entero (Sigma). amplificación de muestras de ADN de entrada MeDIP y se sometieron a Centro para la Investigación del Genoma & amp; núcleo de Biocomputación instalación (Oregon State University, Corvallis, OR) para la muestra de etiquetado, la hibridación de la muestra, y el escaneo de matriz. la hibridación de la muestra y la exploración matriz se realizaron utilizando hibridación NimbleGen Sistema 4 (Roche) y Axon GenePix Pro 4200 A (Molecular Device, Sunnyvale, CA), respectivamente.
metilación del ADN Matriz de Análisis de Datos
NimbleGen se utilizó ADN humano metilación 3 × 720 K CpG Island Plus RefSeq Promotor array (Roche) en base a la liberación del genoma HG18. La matriz contenía 720.000 sondas de 50 a 75 pb de longitud con una separación media de la sonda de 104 pb, que abarca 30.848 transcripciones, 22,532 promotores, y 27,728 islas CpG. Los cruda intensidad de la imagen escaneada, tanto para Cy5 y Cy3 canales se extrajeron mediante el NimbleScan (Roche). Los archivos de pares de intensidad en bruto se importaron en el entorno de programación estadística R usando software personalizado R.
Identificación de las sondas con un peso significativo en escala log
2 relación.
Las relaciones de intensidad de la señal, se generaron restando el log transformado canal intensidades IP de las intensidades de los canales de entrada de registro transformado. Las relaciones se centraron en una base por ejemplo mediante la función de Tukey biweight. Las sondas con registro en escala significativa
2 ratio fueron identificados por el software NimbleScan utilizando los parámetros por defecto proporcionado por el fabricante.
metilación diferencial factor de cambio entre las líneas celulares y /o tratamientos.
Por parejas comparaciones se realizaron a través de re-parametrización para determinar la línea celular y los efectos del tratamiento. Los errores estándar y los grados de libertad fueron extraídos y utilizados para la construcción de t-estadísticas y la determinación de la significación.
datos de la matriz de metilación fueron depositados en NCBI Gene Expression Omnibus, número de acceso GSE47017
.
lista de sondas con un peso significativo log2 veces de cambio (valor de p & lt; 0,05) la comparación entre el tratamiento (SFN o DIM) frente al control del vehículo, o la comparación entre las células de cáncer de próstata (control del vehículo) frente a las células epiteliales de próstata normales (control del vehículo) se generaron . Las sondas con un peso significativo factor de cambio fueron asignadas a las características anotadas en el genoma humano (HG18) y se visualizaron utilizando Generic Genome Browser (GBrowse) [23]. Las sondas dentro de 2 kb aguas arriba y aguas abajo 1 kb del sitio de inicio de transcripción (TSS) se incluyeron en los análisis en este informe. análisis de agrupamiento jerárquico se realizaron utilizando software MeV [24]. Los diagramas de Venn que comparan la superposición de diferentes listas de genes se generaron con BioVenn [25]. el enriquecimiento de genes y análisis de anotaciones funcionales se realizaron utilizando la Base de datos para anotación, y Visualización y v6.7 integrado Descubrimiento (DAVID) [26]. Se utilizó herramienta de anotación agrupación funcional para determinar enriquecido significativamente ontología de genes (GO) los términos dentro de cada uno de los clústeres de anotación. mapeo epigenoma de manera significativa sondas diferencialmente metilado para codificar base de datos de la modificación de histonas se realizó utilizando EpiExplorer [27].
Validación de Datos de ADN de metilación
Seleccione genes diferencialmente metiladas como se determina por matriz de metilación NimbleGen fueron validados por pirosecuenciación. El ADN genómico se trató con bisulfito de sodio usando Epitech bisulfito Kit (Qiagen). Pirosecuenciación PCR y cebadores de secuenciación para seleccionar los genes diferencialmente metilado fueron diseñados utilizando el software de diseño de ensayo PyroMark versión 2.0.1 (Qiagen) (Tabla S1). amplificación por PCR de ADN genómico con bisulfito convertidos se realizó usando el kit de PyroMark PCR (Qiagen) en condiciones como se especifica por el fabricante. Los productos de PCR fueron sometidos a Protein Universidad de Stanford y Facility ácido nucleico (Palo Alto, CA) para la pirosecuenciación. Los análisis de metilación cuantitativos se realizaron utilizando el software PyroMark Q23 versión 2.0.6 (Qiagen).
Gene análisis de expresión
El ARN total de las células tratadas fue aislado utilizando Trizol (Life Technologies). El ARN total se transcribe invertir en cDNA utilizando superíndices III primer capítulo de síntesis Supermix para QRT-PCR (Life Technologies). La expresión génica se cuantificó mediante qPCR utilizando los siguientes cebadores qPCR: DNMT1 humana (adelante: 5'-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3 ', a la inversa: 5'-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3'), DNMT3A (adelante: 5'-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3 ', inversa: 5'-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3 '), DNMT3B (adelante: 5'-AATGTGAATCCAGCCAGGAAAGGC-3', inversa: 5'-ACTGGATTACACTCCAGGAACCGT-3 '), GAPDH (adelante: 5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3', inversa: 5'-TTCACACCCATGACGAACAT -3 '), CCR4 (adelante: 5'-AATTGTGCACGCGGTGTTTT-3', inversa: 5'-TCCAGGGAGCTGAGAACCTT-3 '), CXCR4 (adelante: 5'-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3', inversa: 5'-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3 ') , CYR61 (adelante: 5'-CTTAGTCGTCACCCTTCTCCAC-3 ', inversa: 5'-CAGGGTCTGCCCTCTGACT-3'), y TGFBR1 (adelante: 5'-CCTCGAGATAGGCCGTTTGT-3 ', inversa: 5'-ATGGTGAATGACAGTGCGGT-3'). Todas las reacciones de qPCR se realizaron utilizando SYBR Green Fast Mastermix (Life Technologies) en 7900 HT sistema de PCR en tiempo real rápida (Applied Biosystems). La expresión génica se normalizó a GAPDH y cuantificación relativa se determinó utilizando el método ΔΔCt en el software Administrador de RQ 1.2.1 (Applied Biosystems).
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Los análisis
Los análisis se realizaron como chip anteriormente descrito con ligeras modificaciones [28]. Brevemente, las células tratadas fueron fijadas en formaldehído y la cromatina se esquilada de ultrasonidos. complejos de proteína /DNA se inmunoprecipitaron con anticuerpos específicos contra H3K4me3 (Abcam, Cambridge, MA). Chip de control negativo se realizó utilizando IgG normal. Después de la inmunoprecipitación, la inversión de reticulación, y tratamiento con proteinasa K, DNA ChIP se purificó por extracción con fenol-cloroformo. cebadores chip-qPCR fueron diseñados para amplificar específicos TGFBR1 y Cyr61 regiones promotoras que mostraron metilación diferencial debido a la DIM tratamiento (TGFBR1 hacia adelante: 5'-GGATCGGGAAGGGGTTTGAG-3 ', inversa: 5'-CCCTTCACATGCGACTCACT-3'; CYR61 hacia adelante: 5 ' CTCCCACCCCTAACCCTCTA-3 ', inversa: 5'-GGCCCTTAGTGCTAATGCTGA-3'). reacciones chip-qPCR se realizaron por triplicado, y la cuantificación de las muestras de ADN inmunoprecipitadas se hizo utilizando una curva estándar generada a partir de diluciones seriadas de ADN de entrada purificada. Los resultados se calcularon como un porcentaje de ADN de entrada (entrada%) y se informaron como relativa factor de cambio en comparación con el control de vehículo DMSO.
Análisis estadístico
prueba estadística de los valores de solapamiento EpiExplorer para determinar si seleccione sondas de metilación se superponen significativamente más de lo esperado por azar (control aleatorio) con picos H3K4Me3 y H3K9ac en la base de datos de ENCODE se realizaron utilizando el algoritmo de Monte Carlo secuencial de múltiples ensayos (MCFDR) en Genómica HyperBrowser [29], [30]. La diferencia estadística entre las sondas de ADN asociadas con la metilación mediada DIM-aumentado o disminuido y su respectivo solapamiento con marcas de histona se determinaron mediante la prueba t de dos muestras proporción en SciPy (http://scipy.org). El resto de los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5.02 (GraphPad, La Jolla, CA), donde los datos se informaron como media ± SEM, y los valores de p se determinaron utilizando t para datos independientes de prueba o un modelo lineal sigue por Tukey-Krammer de comparación múltiple probar en su caso. el nivel de significación estadística se definió como α de 0,05.
Resultados
SFN y DIM disminución de la expresión génica y causaron DNMT Distinto metilación del ADN alteraciones del perfil Dependiendo de próstata línea celular
evaluado los efectos de SFN y DIM en la expresión de DNMT1, DNMT3A, y DNMT3B en las células epiteliales normales de la próstata (PrEC), células de cáncer (PC3) de próstata dependientes de andrógenos (LnCAP) y independiente de andrógenos. células LNCaP y PC3 tenían significativamente más alta expresión de línea de base de DNMT1, DNMT3A, y DNMT3B comparación con las células PrEC (Fig. 1A). En las células PrEC y LNCaP, tanto SFN y tratamientos DIM disminuyeron DNMT1 y la expresión génica DNMT3B (Fig. 1B y 1C). En las células PC3, SFN disminuyó significativamente la expresión de los tres DNMTs examinados, y DIM disminuyó la expresión de DNMT1 (Fig. 1D). Con base en este resultado, así como nuestros hallazgos previos de que SFN puede mediar promotor de-metilación en células de cáncer de próstata [18], hemos realizado un estudio de todo el genoma para determinar los efectos globales del SFN y poco clara en promotor de la metilación del ADN en PrEC, LnCAP, y células PC3.
(a) La expresión de genes de DNMT1, DNMT3A, y DNMT3B en no tratado PrEC, LNCaP y células PC3 (n = 3-5 por grupo). Los datos representan la media normalizada factor de cambio ± SEM en comparación con PrEC. (B-D) Efectos de la SFN y Dim sobre la expresión génica en las células PrEC DNMT (B), las células LNCaP (C), y las células PC3 (D). Las células se trataron con control de vehículo (DMSO), 15 mM SFN, o 15 mM DIM (n = 6 por grupo en B-D). DNMT1, DNMT3A, y DNMT3B la expresión génica se analizaron 48 h después del tratamiento. Los datos representan la media normalizada factor de cambio ± SEM en comparación con DMSO. * P-valor. & Lt; 0,05
El estado de metilación de las sondas individuales se identificó por primera vez en cada una de las tres líneas celulares mediante la comparación de MeDIP-enriquecido en comparación con muestras de entrada (relación log2 escala). El análisis de agrupamiento jerárquico mostró que PrEC, LNCaP y PC3 tenían distintos perfiles de metilación (Fig. 2A). A continuación, se determinó la metilación diferencial entre las células de cáncer de próstata y células epiteliales normales de la próstata. Sondas con significativa registro escalado
2 relación identificado en células LNCaP y células PC3 se compararon con los identificados en las células PrEC a través de comparación por parejas para determinar significativo log2 plegado diferencias entre las células de cáncer de próstata y las células epiteliales de próstata normales (LnCAP frente PrEC, y PC3 frente PrEC). Todos los análisis posteriores de la línea celular y /o los efectos del tratamiento se refiere a los cambios de metilación significativos basados en comparaciones factor de cambio log2. células LNCaP y células PC3 tenían 78,272 54,876 sondas y sondas, respectivamente, que fueron significativamente diferencialmente metilado comparación con las células PrEC normales (Fig. 2B). En las células PC3, el 64% de las sondas se había incrementado la metilación, comparado con el 49% de las sondas en las células LNCaP que habían aumentado en relación con la metilación PrEC. Dado que el perfil de metilación de cada gen se evaluó por múltiples sondas, se determinó el nivel de metilación media por gen promediando el log2 significativo factor de cambio de todas las sondas asignadas a los genes individuales. Esto representaba 10.315 y 8.013 genes diferencialmente metiladas en LNCaP y células PC3, respectivamente, en relación a las células PrEC (Fig. 2C). Se observó que la mayoría de las sondas dentro de cada gen tenía cambios de metilación similares, en los que mayor que 92% o bien había aumentado o disminuido metilación. Sólo 7,4% de las sondas en las células LNCaP y 4,2% de las sondas en células PC3 tenían perfil de metilación mixta de cada gen (datos no presentados). Log2 veces de cambio por gen osciló -3,322-2,893 en las células LNCaP y -2,411-2,941 en células PC3. Los análisis de anotación funcional indicó que los genes con alterada perfil de metilación en células de cáncer de próstata fueron enriquecidos en los genes que se dysregulated o involucrados en la progresión del cáncer, incluyendo GO categorías asociadas con la migración celular, la adhesión celular, la señalización célula-célula, así como la regulación de la transcripción (datos no mostrada). Seleccionar los genes con metilación diferencial basado en la matriz de metilación NimbleGen fueron validados por pirosecuenciación (Figura S1).
(A) Análisis de agrupación jerárquica de las sondas con un peso significativo en escala log
2 en relación PrEC, LNCaP y PC3 Células. Las barras verdes y rojas representan sondas individuales con significativa disminución y el aumento de la metilación, respectivamente, de las muestras de ADN MeDIP relativos a muestras de ADN de entrada. Los datos representan las 1.000 sondas más significativos dentro de cada línea celular. (B) Una comparación de los cambios de metilación en LNCaP y células PC3 relación con las células PrEC. sondas metilados significativas en LNCaP y PC3 células fueron comparados con PrEC, y se muestran la distribución de las sondas con log2 significativa los factores de cambio. (C) Nivel medio de metilación en los genes individuales en LNCaP y PC3 células en comparación con PrEC. Log2 veces de cambio por gen se determinó promediando el log2 veces de cambio de todas las sondas diferencialmente metiladas asignados a cada gen, y representa como caja y bigote parcelas. Número encima de la barra indica el número de genes en cada grupo. Bigotes representan los valores máximos y mínimos, y "+" representa valor medio.
A continuación examinó los efectos de la SFN y poco clara en los perfiles de metilación del promotor en cada línea celular de próstata. Log2 veces de cambio se comparó entre SFN o tratamientos DIM en relación con el control del vehículo DMSO en PrEC, LNCaP y PC3 células. tratamientos SFN resultó en significativa log2 veces de cambio en 6.154 sondas en las células PrEC, 9.302 sondas en las células LNCaP, y 20,783 sondas en células PC3 (Fig. 3A), que representa a 2.472, 3.508, y 6.778 genes diferencialmente metiladas, respectivamente (Fig. 3B ). tratamientos DIM inducidos significativa log2 veces de cambio en 8.970 sondas en las células PrEC, 15.237 sondas en las células LNCaP, y 7.386 sondas en células PC3, que representan a 3.224, 4.404 y 2.394 genes diferencialmente metiladas, respectivamente (Fig. 3B). sondas individuales dentro de cada gen tuvieron cambios de metilación similares, en los que más de un 95% de las sondas o bien había aumentado o disminuido la metilación, y muy pocos genes tenido perfil de metilación mixto (& lt; 5% de las sondas en las células tratadas con SFN y & lt; 2.5 % de las sondas en DIM células tratadas) (datos no mostrados). La gama de veces de cambio debido a la SFN y los tratamientos DIM eran entre -1,380 a 1,243, y era más estrecha con relación a las observadas cuando se comparan las células de cáncer de próstata frente a las células epiteliales de próstata normales (Fig. 2B). Distribución de las sondas diferencialmente metiladas dentro del promotor se examinó y no mostró sesgo preferencial a regiones específicas del promotor (datos no mostrados).
(A) Efectos de la SFN y DIM en el perfil de metilación en PrEC, LNCaP, y células PC3 en comparación con el control del vehículo. En cada una de las tres líneas celulares, significativos sondas metilados en SFN o grupos tratados con DIM se compararon con su respectivo control del vehículo para determinar sonda específica de log2 factor de cambio. Se muestra la distribución de las sondas con log2 significativo factor de cambio. (B) Promedio de nivel de metilación de genes individuales en SFN y tratada-DIM PrEC, LNCaP y PC3 células en comparación con el control del vehículo. Log2 veces de cambio por gen se determinó promediando el log2 veces de cambio de todas las sondas diferencialmente metiladas asignados a cada gen, y representa como caja y bigote parcelas. Número encima de la barra indica el número de genes en cada grupo. Bigotes representan los valores máximos y mínimos, y "+" representa valor medio.
diagrama de Venn Los análisis mostraron que SFN y DIM cada metilación alterada en distintos conjuntos de genes en cada una de las líneas celulares. La comparación de los conjuntos de genes alterados por SFN o DIM mostró que sólo un pequeño número de genes (219 y 209 genes, respectivamente) se comparte entre las tres líneas celulares, lo que representa entre el 3% a 9% de los genes diferencialmente metiladas dentro de cada línea celular (Fig. 4A). De este conjunto básico de los genes, había ~ 30% de solapamiento entre SFN y tratamientos DIM. Por el contrario, hubo un alto grado de solapamiento de genes afectados por los tratamientos tanto SFN y DIM dentro de las células PrEC y LNCaP (1.926 genes y 2.671 genes, respectivamente), y en las células PC3 en menor medida (1.408 genes) (Fig. 4B) . Se obtuvieron resultados similares al subdividir los conjuntos de datos en genes con el aumento o disminución de la metilación metilación (datos no mostrados). Los análisis de anotación funcional mostró diferentes conjuntos de genes enriquecido en las células epiteliales de la próstata normal en comparación con las células de cáncer de próstata, pero conjuntos similares de genes fueron enriquecidos al comparar SFN y el tratamiento DIM dentro de cada línea celular (Fig. 5). En las células PrEC, genes implicados en la transcripción, la apoptosis y la cromatina organización /modificación se enriquece con tanto SFN y tratamientos DIM. En las células LNCaP, se enriquecieron dos categorías generales de genes. Los primeros genes implicados asociados con el movimiento de células, incluyendo la migración celular, la adhesión, y la localización. El segundo genes implicados asociados con la respuesta inmune, incluyendo la inflamación y de defensa, la activación de leucocitos y la regulación inmune. análisis anotación funcional en células PC3 mostró categorías de genes compartidos enriquecidos similitud tanto PrEC y LNCaP, incluyendo genes implicados en la transcripción, apoptosis, migración celular, y la respuesta inmune.
(A) Venn diagramas que muestran el número de genes que fueron metilados diferencialmente en PrEC, LNCaP y células PC3 a tratamientos con SFN o DIM comparación con el control vehículo. (B) diagramas de Venn que muestra el número de objetivos de genes diferencialmente metiladas del SFN y DIM dentro de cada línea celular.
anotación funcional de los genes blancos diferencialmente metiladas del SFN y DIM en PrEC, LNCaP y PC3 células fueron examinados y se muestra el número de genes implicados en procesos biológicos seleccionados y funciones. Los datos se expresan como el número de genes en cada categoría GO enriquecido significativamente.
SFN y DIM Invertida cáncer asociado a alteraciones de metilación del ADN en las células LNCaP
A continuación, dada la disminución más significativa en DNMT1 y DNMT3B tanto con SFN y el tratamiento DIM en las células LNCaP, se optó por centrarse en la caracterización de un subconjunto de genes que eran diferencialmente metilado en las células LNCaP relación con las células PrEC, y se revirtieron con SFN y /o tratamientos DIM. De los 10.315 genes que tenían metilación diferencial en las células LNCaP (Fig. 2C), SFN y tratamientos DIM invierten los perfiles de metilación de 1.509 (14,6%) y 2.219 genes (21,5%), respectivamente (Fig. 6a). Estos genes pertenecen a dos categorías: 1) los genes que habían aumentado la metilación del promotor en las células LNCaP relación con las células PrEC, y la reducción de la metilación sobre SFN y /o tratamiento DIM, y 2) los genes que habían disminuido la metilación del promotor en las células LNCaP relación con las células PrEC , y el aumento de la metilación sobre SFN y /o tratamiento DIM. Un ejemplo de un gen que pertenece a cada categoría, C-C del receptor de quimiocinas de tipo 4 (CCR4) y de crecimiento transformante de tipo receptor del factor-β1 I (TGFBR1), se muestra en la Fig. 6B. Los análisis de anotación funcional mostró GO enriquecimiento para muchos genes que se sabe están alteradas o están altamente involucrados en la progresión del cáncer. Este conjunto de datos incluye los genes que participan en la adhesión celular y la quimiotaxis, así como genes relacionados con la inmunidad implicados en la inflamación y de defensa, la unión de citocinas, y desarrollo inmunológico (Fig. 6C). Venn diagrama de comparación mostró que el 86% de los genes en la lista de genes SFN (1309 de 1509) fueron compartidos con la lista de genes DIM (Fig. 6D). Dado que la mayoría de los genes afectados por el SFN fueron incluidos en la lista de genes DIM, la expresión génica posterior análisis se centró en determinados genes en el tratamiento DIM revirtió el perfil de metilación desregulado en las células LNCaP.
(A) Número de genes diferencialmente metilado en las células LNCaP relación con las células PrEC que fueron revertidos con SFN o tratamientos DIM. barra de color negro representa los genes que habían disminuido metilación en las células LNCaP que se incrementaron con SFN /tratamientos DIM. barra blanca representa los genes que habían aumentado la metilación en las células LNCaP que se vieron reducidos con SFN /tratamientos DIM. (B) Dos ejemplos de genes, CCR4 y TGFBR1, con perfiles de metilación desreguladas en las células LNCaP que fueron revertidos con SFN y /o tratamientos DIM. Las barras de colores representan la posición genómica de sondas de metilación del ADN que había disminuido la metilación (azul) o aumentan la metilación (rojo) cuando se compara la sonda específica de log2 veces de cambio en las células LNCaP frente PrEC, o DIM frente al control de vehículo DMSO en las células LNCaP. TSS (círculo azul) representa el sitio de inicio de transcripción de cada gen. (C) de la anotación funcional de los genes blancos diferencialmente metilado en las células LNCaP que fueron revertidos con SFN o tratamientos DIM. Diagrama (D) de Venn que muestra el número de objetivos de genes con metilación del promotor que se dysregulated en las células LNCaP y revertir con SFN o DIM.
Cuatro genes (TGFBR1, inductor angiogénico rica en cisteína 61 (CYR61) , fueron seleccionados CCR4 y CXC tipo de receptores de quimioquinas 4 (CXCR4)) para examinar más a fondo la relación entre la alteración en el perfil de metilación del promotor y la expresión génica en células LNCaP. Los perfiles de metilación del promotor de cada uno de estos cuatro genes fueron alterados en las células LNCaP en comparación con las células PrEC, y el tratamiento DIM invierten los perfiles de metilación asociados con el cáncer. se ha informado de la expresión de cada uno de los cuatro genes candidatos para ser dysregulated en el cáncer, y se correlacionó con la progresión del cáncer.