Extracto
Antecedentes
Genoma en todo el análisis de la expresión génica de los tumores son una herramienta poderosa para identificar firmas de genes asociados con características biológica y clínicamente relevantes y por varios tipos de tumores están bajo la validación clínica de ensayos prospectivos. Sin embargo, el manejo y procesamiento de muestras clínicas pueden afectar significativamente a los datos moleculares obtenidos a partir de su análisis. Se estudiaron los efectos del tiempo de manipulación del tejido sobre la expresión génica en tejidos de colon normales y tumorales humanos sometidos a procedimientos quirúrgicos de rutina.
Métodos
ARN extraído de muestras de 15 pacientes en cuatro puntos de tiempo (para una se analizó total de 180 muestras) después de la cirugía para la expresión génica en microarrays de oligonucleótidos de alta densidad. Se utilizó un modelo de efectos mixtos para identificar sondas con diferentes medios de expresión a través de los cuatro puntos de tiempo diferentes. El p-valores del modelo se ajustaron con el método de Bonferroni.
Resultados
Treinta y dos conjuntos de sondas asociadas al tiempo de manipulación de tejidos en las muestras de tumor, y treinta y un años en los tejidos normales , fueron identificados. La mayoría de los genes exhiben cambios moderados en la expresión en los puntos de tiempo analizados; Sin embargo cuatro de ellos eran oncogenes, y dos confirmaron el efecto de la manipulación de tejidos mediante la validación independiente.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que un punto de tiempo crítico para su manipulación en el tejido de colon parece ser 60 minutos a temperatura ambiente. Aunque el número de genes dependientes del tiempo se identificaron era baja, los tres genes que ya mostraron cambios en este punto de tiempo en muestras de tumores fueron todos oncogenes, por lo tanto, la recomendación de normalización de los protocolos de manipulación de tejido y el esfuerzo para reducir el tiempo de extracción de la pieza para romper la congelación de contabilidad para la isquemia caliente en este tipo de tumor
Visto:. Musella V, P Verderio, Reid JF, Pizzamiglio S, M Gariboldi, Callari M, et al. (2013) Efectos del tiempo de isquemia caliente de perfiles de expresión génica en el cáncer colorrectal tejidos y mucosa normal. PLoS ONE 8 (1): e53406. doi: 10.1371 /journal.pone.0053406
Editor: Shoba Ranganathan, Macquarie University, Australia |
Recibido: 18 de abril de 2012; Aceptado: noviembre 30, 2012; Publicado: 7 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Musella et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Cariplo-Región de Lombardía (Título del proyecto: "Biobanca per il carcinoma colorettale"), Associazione Italiana Ricerca Cancro, Alianza Contro il Cancro, y el proyecto EurocanPlatform. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Con la introducción de las nuevas tecnologías genómicas como los microarrays de ARN basado en los tejidos, patrones de expresión de genes identificados por el análisis de microarrays se ha descubierto que los tumores estratificar y predecir los resultados clínicos en los diferentes tipos de cáncer [1]. Algunos de ellos se han utilizado con éxito para identificar a los pacientes que pueden beneficiarse de un tratamiento específico y la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos): aprobado las pruebas basadas en las firmas de genes del cáncer de mama ya están disponibles comercialmente. Como consecuencia, la recogida en bancos de tejidos de muestras quirúrgicas que pueden ser utilizados para estos análisis se ha convertido en un tema obligatorio para la comprensión de los resultados correlativos de la mayoría de los ensayos clínicos actuales. Sin embargo, la variabilidad en la manipulación de tejidos y procesamiento de muestras quirúrgicas puede afectar a la reproducibilidad y la interpretación de los resultados. Diversas variables, como la manipulación de tejidos, la isquemia caliente ex vivo y tiempos de almacenamiento pueden alterar potencialmente los niveles de expresión de ARNm y afectar negativamente a la validez de los estudios que utilizaron muestras clínicas [2]. Todas estas variables deben ser investigadas cuidadosamente con el fin de establecer directrices para los bancos de tejidos [3]. La organización de los biobancos calificados y certificados debe ser la base para garantizar la conexión en red de actividades y disponibilidad de material biológico de calidad certificada-
.
El objetivo de este estudio piloto fue explorar los efectos del tiempo de manipulación del tejido en el tejido precisamente documentado muestras que siguieron las normas habituales de tratamiento en nuestra institución (Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, INT-MI), para el desarrollo de un método de muestreo aplicable clínicamente tumores en los bancos de tejidos que puede ser utilizado con seguridad para análisis de microarrays. Se utilizó el modelo de cáncer colorrectal (CCR). CRC es la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en los países occidentales ya pesar de los importantes avances en su gestión, la supervivencia global para la enfermedad avanzada y metastásica ha cambiado poco en los últimos 20 años, con cinco años en casi el 90% para la primera y 15% para los tumores finales de [4]. Como consecuencia, hay una necesidad urgente de nuevos biomarcadores para mejorar la detección y el tratamiento clínico de CRC. El uso de microarrays de oligonucleótidos de alta densidad que investigó los efectos secuenciales de manipulación de tejidos en muestras obtenidas de 15 CRC y en su tejido normal correspondiente recogido en nuestra Institución y se deja a temperatura ambiente en diferentes puntos de tiempo después de la cirugía. El resultado primario del estudio fue evaluar el efecto del tiempo en muestras de tumores y posiblemente seleccionar genes específicos cuya expresión es relacionada con el tiempo, que podrían ser utilizados como detectores de la degradación del tejido. Además, para identificar genes influenciados por el tiempo independientemente del tipo de muestra (normal o tumor), también se investigó el efecto del tiempo en tejidos normales y comparó la expresión diferencial entre los dos tipos de tejidos que representan el tiempo.
Nuestros resultados muestran que el impacto del tiempo la manipulación de tejidos en todo el perfil de expresión génica podría ser considerado de menor importancia en el colon y que un umbral razonable para los especímenes de recogida podría ser de 60 minutos después de la cirugía, cuando no se observaron alteraciones de genes. Estas muestras pueden ser usados para generar perfiles de microarrays reproducibles para facilitar la toma decisiones de tratamiento que utiliza modelos clinicogenomic.
Materiales y Métodos
1 Ética Declaración
Se incluyeron todos los pacientes cuyas muestras biológicas en el estudio firmaron un consentimiento informado, aprobado por el Comité ético Independiente del INT-MI, para donar a INT-MI las muestras de tejidos sobrantes después de completar los procedimientos de diagnóstico con fines de investigación. El Comité de Ética independiente de INT-MI aprobó el uso de las muestras para este estudio específico en el marco de un proyecto en el control de calidad de los bancos biológicos.
2 Diseño del estudio y Tratamiento de Muestras
El tumor y las muestras normales de contraparte utilizados en los experimentos se recogieron de forma prospectiva a partir de 15 pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica en el INT-MI y cuyos tumores eran representativas de las diferentes etapas patológicas de este tipo de tumor. En el examen histológico de rutina todas las muestras de tumores se clasificaron (G2 grado de acuerdo con el Comité Conjunto sobre el Cáncer 2010 http://www.cancerstaging.org/) moderadamente diferenciado adenocarcinomas de colon NOS. Los detalles clínico-patológicos e histológicos se enumeran en la Tabla 1. Se obtuvieron seis fragmentos de cada muestra y se dejaron a temperatura ambiente al azar en diferentes puntos de tiempo de la siguiente manera: tres fragmentos en & lt; 20 min. (T0), un fragmento en 60 min. (T1), un fragmento a 180 min. (T2) y un fragmento en 360 min. (T3). El tiempo se mide a partir de la escisión quirúrgica del paciente y se analiza el primer punto de tiempo (T0) se procesó y se congela a menos de 20 min. de la cirugía. Las muestras fueron transportadas desde el teatro a la patología a temperatura ambiente sin hielo. El número total de fragmentos analizados fue de 180 (90 muestras normales y 90 muestras de tumor). muestras neoplásicas se obtuvieron de la zona central de la neoplasia, evitando la selección de zonas de material o de transición necróticas con mucosa sana. Las muestras de mucosa del colon sano se resecaron al menos 20 centímetros lejos de la neoplasia y distante de los márgenes de la resección quirúrgica. El control se costituited exclusivamente por la mucosa normal, despojado de la superficie luminal.
3 Extracción de ARN y Evaluación
Las muestras de tejido fueron almacenadas a -80 ° C hasta la extracción de RNA. ARN total fue extraído de 10-20 mg de muestras de tumores y 30 a 40 mg de las muestras normales. Los tejidos se rompieron mecánicamente y al mismo tiempo homogeneizaron en presencia de QIAzol reactivo de lisis (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), utilizando un Mikrodismembrator (Braun Biotech International, Melsungen, Alemania). El ARN se extrajo usando el kit de miRNeasy Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Purificación y DNasa digestión se realizaron con dos kits diferentes: se empleó RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) para un máximo de 45
μ
g de ARN, mientras que se utilizó RNeasy Mini kit (Qiagen) para el ARN que oscila entre 45 y 100
μ g
. las concentraciones de ARN se midieron con el NanoDrop ND-100 Espectrofotómetro (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE), mientras que la calidad del ARN se evaluó con el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) utilizando el kit de RNA Nano 6000 (Agilent Technologies). El ARN Número Integridad (RIN) [5] se determinó utilizando el software proporcionado por el fabricante.
4 Expresión Génica
RNA de muestras se procesaron para la hibridación de microarrays por la facilidad de la base genómica funcional en Perfilado INT-MI. En pocas palabras, 800 ng de ARN total se transcribió de forma inversa, marcado con biotina y se amplifica durante la noche (14 horas) utilizando el kit de ARN Illumina TotalPrep amplificación (Ambion, Austin, Texas, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Una ug de la muestra cRNA biotinilado se mezclaron con el tampón hybridizatioin Hyb E1 que contiene 37,5% (w /w) de formamida y luego hibridado con Sentrix Chip Bead HumanHT12_v3 (Illumina, Inc., San Diego, CA) a 58 ° C durante la noche (18 horas). La matriz representa a más de 48000 tipos de cuentas, cada una con una secuencia única derivada de los genes humanos en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica Referencia de secuencia y la base de datos UniGene. virutas de matriz se lavaron con solución E1BC del fabricante, se tiñeron con 1 ug /ml de estreptavidina-Cy3 (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). escaneado y, finalmente, con Illumina BeadArray lector
5 PCR en tiempo real
ensayos de gen TaqMan® se utilizaron para la validación de ABL1 (Hs00245443), FOSB (Hs01547109), Jun (Hs00277190) los genes en las muestras tumorales y HIST1H1D (Hs00271187), HIST1H1E (Hs00271195), HIST1H4E (Hs003743461), HIST4H4 (Hs00545522) tanto en muestras tumorales y normales. Todos los genes se normalizaron a 18S (HS03003631), mientras que los tres genes asociados a tumores también se normalizaron a ACTB (HS03023942) y GAPDH (Hs00266705). En pocas palabras, se sintetizó ADNc por duplicado para la validación de ABL1, FOSB y Jun y en una sola reacción para la validación de los genes de las histonas de 500 ng de ARN total usando la alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Real-Time PCR cuantitativa se realizó utilizando la química de FAST (Applied Biosystems) con los ensayos de genes específicos en ABI PRISM 7900 HT sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems) utilizando 10 ng de cDNA.
6 Análisis de Datos
6.1 datos Microrarray pre-procesamiento.
los datos primarios se obtuvieron a partir de imágenes escaneadas utilizando el software de Illumina BeadStudio (versión 3.3.8) y pre-procesados utilizando el paquete lumi [6] de la Bioconductor proyecto [7]. La media de la señal, la tasa de detección y de la matriz entre las distancias fueron evaluados en la etapa de control de calidad. Dos de los 90 perfiles de muestras de tumores y dos de los 90 perfiles de las muestras normales no pasaron los controles de calidad y se descartaron en el análisis posterior. Los datos se normalizaron utilizando el método Spline Normalización robusto y sondas con una detección de valor de p & lt; 0,01 en menos de 10% de las muestras se separaron por filtración. Todos los datos de microarrays MIAME son compatibles y los datos brutos fueron depositados en la Expresión Génica del NCBI Omnibus (GEO) de bases de datos (http://www.ncbi.nmlm.nih.gov/projects/geo/) con el número de acceso asociación entre GSE37182.The perfiles de genes de línea de base y las características clínico-patológicas se analizaron por ANOVA de una vía. analiza
6.2 Evolución temporal.
con el fin de identificar las sondas en muestras tumorales expresan de forma diferente en los cuatro puntos de tiempo diferentes (
hora de expresión curso de análisis
) un modelo de efectos mixtos se llevó a cabo en los datos de microarrays, considerando el factor de
de tiempo, (T0, T1, T2, T3) como fijo y el factor de
paciente
como al azar [8]. El modelo fue implementado por considerar como variables dependientes el registro (base 2) valor de expresión de cada sonda. El p-valores del modelo se ajustaron con el método de Bonferroni [9]. Para el estudio de validación el mismo enfoque se aplicó al considerar como variables dependientes de los valores obtenidos a partir de -ΔCt qPCR realizar en los genes de interés. El análisis estadístico se llevó a cabo la implementación de un código específico desarrollado en software SAS ® v. 9.2 (SAS Institute Inc Cary, NC). resultados superponibles se produjeron utilizando el lenguaje de programación R v. 2.12.0 [10], así como mediante el uso del paquete de software EDGE de código abierto distribuido libremente y [11]. Un procedimiento estadístico idéntica se aplica posteriormente en el procesamiento de los datos a partir de tejido normal. RIN valores correspondientes a las dos muestras normales y tumorales fueron analizados siguiendo el mismo método utilizado para los datos de microarrays también teniendo en cuenta el factor de
Tipo gratis (normal o tumoral) fijada (
curso de análisis RIN tiempo
)
análisis conjunto
Gen 6.3
set análisis funcional de genes utilizando la Ontología de Genes (2010) [12]..; [13] bases de datos se ha realizado mediante las GOstats paquetes de Bioconductor [14] y de la categoría (v 2.16.0.) Con los parámetros por defecto (sobre-representación con valor de p & lt; 0,01) (v 2.16.0.).
resultados
1 RIN Análisis
El Número integridad del ARN (RIN) de todas las muestras sobre todos los puntos de tiempo tenían un valor medio de 5,8 con un rango inter-cuantil de 1,95. Las muestras tumorales tenían en promedio un valor de RIN superior a las muestras normales (mediana de 6,4 y 5,35, respectivamente), sobre todo en el primer punto el tiempo T0. distribuciones similares de los valores de RIN pudieron observarse a través de los diferentes puntos de tiempo y se observó una variación considerable para cada muestra en el T0 punto primera vez (RIN mediana varianza = 1,668, IQR = 2,084) que era más pronunciado en las muestras normales. El análisis del curso RIN tiempo mostró que los valores de RIN tenían una tendencia a disminuir con el tiempo (p-valor por el tiempo = 0,0565 y de contrastes individuales en comparación con T0, T1 = 0,0214, T2 y T3 = 0,1705 = 0,0529). La distribución de los valores RIN difieren significativamente (p-valor = 0,0008) en las muestras tumorales con respecto a las normales (Fig. 1).
distribuciones RIN en cada punto de tiempo para ambos tumor (A) y normal ( b) Las muestras. Un RIN más altos indican una mayor calidad del ARN.
Al tener en cuenta todos los cuatro puntos de tiempo hemos identificado un subconjunto de 6 normal y 7 casos de tumor de los valores de RIN, que era siempre superior a cinco y expresión curso temporal análisis se realizó también para este subconjunto de muestras. Cabe destacar que no se observó ninguna asociación entre los perfiles de genes en muestras tumorales en T0 y la etapa (valor de p = 0,59) o ubicación (p-valor = 0,95) de la enfermedad.
Tiempo 2 Curso de Análisis de Expresión
Después de que el control de calidad de los datos de microarrays, se eliminaron los perfiles de expresión de 4 muestras (2 perfiles de tumor y 2 de las muestras normales). Estos valores atípicos pertenecían a diferentes puntos de tiempo de dos pacientes en el caso de las muestras normales y en el mismo paciente para las muestras tumorales. Debido a la naturaleza del diseño del estudio era crucial tener para cada paciente unos cuadros llenos en todos los puntos de tiempo y por lo tanto todos los perfiles asociados a esos pacientes no se toman en consideración en el tiempo de análisis. Como consecuencia de ello, se utilizaron un total de 13 pacientes en el conjunto de datos normal que contenía 17895 sondas y 14 en el tumor de datos que contiene 18007 sondas. Ambos conjuntos de datos compartidos 16698 sondas comunes
Las sondas identificadas por la corrección de Bonferroni estrictas. (Valor de p & lt; 0,05) en el método
de Tiempo, factor o en al menos uno de los contrastes de tiempo ( T0 línea de base) en el normal y conjuntos de datos tumorales se enumeran en la Tabla 2 (N = 32) y en la Tabla 3 (N = 31), respectivamente. En estas tablas, las filas se han ordenado de acuerdo con los valores de p primas derivadas de la
de Tiempo, los factores y una estrella (*) en las columnas 'Time', 'T1', 'T2', o ' T3 "indica a partir del cual se seleccionó el contrario la sonda. Mapas de calor en el panel A y B de la figura S1 representan gráficamente la dirección de la alteración de expresión en cada punto de tiempo en el tumor y normales conjuntos de datos, respectivamente.
cinco puntas de prueba (genes) que presenta diferentes medios de expresión a través de los cuatro puntos de tiempo fueron identificados tanto en el normal y los conjuntos de datos tumorales (
HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E, HIST4H4 y 5.960.086).
la mayor parte de la variabilidad observada deriva desde el punto T3 última vez en 360 minutos cuando se comparan con la base de referencia T0. Esto es especialmente cierto en el conjunto de datos del tumor mientras que algunas sondas derivadas del contraste T2 emergen en el conjunto de datos Normal. Todos los genes identificados en el tumor de datos son constantemente hasta reguladas a través del tiempo; lo mismo se aplica al conjunto de datos normal, con algunas excepciones. En general, sin embargo, la mayoría de los genes no muestran cambios drásticos en los niveles de expresión. anotación funcional de los genes de las dos listas (utilizando tanto ontología de genes y vías KEGG bases de datos) destacaron que 22 de los 32 genes modulados en el tejido normal eran las histonas, que participan en la organización de la cromatina nucleasome y montaje. Cuatro de ellos eran también dependiente del tiempo en las muestras tumorales, junto con otros 27 genes con diversas funciones implicadas en el cáncer, incluyendo los oncogenes, como
junio
,
FOSB
,
ABL1 Opiniones y
EGR1
. Otro gen comúnmente modulada en tejidos normales y tumorales fue
RNU11
, un pequeño ARN nuclear.
Un análisis idéntico se realizó utilizando el subconjunto de muestras con un RIN superior a cinco, que identificó sólo 6 sondas en el conjunto de datos normal y 6 en el conjunto de datos del tumor, el conjunto de datos, probablemente debido al tamaño reducido de la muestra. No hay sondas comunes donde se encuentran en las dos listas. Cinco de 6 sondas (
HIST1H1E
,
HIST1H4B
,
HIST1H4E
,
HIST4H4
,
5960086
) en el conjunto de datos normales se también presente en el análisis utilizando todas las muestras y 2 (
HSPA1A
,
IER5
) estaban en común en el conjunto de datos del tumor.
3 RT-PCR validación
los tres genes
que fueron significativos Opiniones de 'Time', 'T2' y los contrastes 'T3'
en las muestras tumorales (JUN
,
FOSB
y
ABL1)
fueron seleccionados para la validación técnica con PCR en tiempo real (RT-PCR) análisis en los mismos tejidos tumorales pertenecientes a los 14 pacientes diferentes analizadas por microarrays. Dos de ellos (
Jun y FOSB)
confirmó los resultados de las matrices. Figura 2 informa la expresión dinámica en el tiempo de los genes, normalizado a 18S. La normalización usando GAPDH y genes de limpieza ACTB confirmó estos resultados (datos no presentados). ABL1 no fue validado como isquemia asociada gen probablemente debido al nivel débil de la asociación entre los datos de RT-PCR y microarrays. Esto puede explicarse en parte por la variabilidad limitada expresión de este gen en nuestras muestras en comparación con junio y FOSB (Fig. S2). Cuatro genes comúnmente moduladas en el tejido normal y tumoral, también se analizaron (HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E y HIST4H4); sólo uno de ellos, HIST1H4E, confirmó los datos de microarrays.
Los valores de RT-PCR de FOSB, Jun y ABL1 (-ΔCt) normalizaron a la casa de mantenimiento de genes 18S.
discusión
Se estudió el efecto del tiempo de manipulación sobre la expresión génica global utilizando CRC muestras de tejido sub-muestreado y se congelaron rápidamente-a diferentes puntos de tiempo después de la cirugía, siguiendo los protocolos de manipulación de tejido de rutina de una Unidad de Patología. ARN de calidad evaluada por el Integrity Número de ARN (RIN) mostró una ligera tendencia de disminución asociada en cuando con muestras de tumores que exhiben mayor y menos variable RIN valores en T0 en comparación con las muestras normales. La presencia de la degradación en T0 podría indicar la variabilidad del procedimiento o una sensibilidad específica de ARN a partir de tejido del colon. Los resultados obtenidos para las muestras de tumor están de acuerdo con lo encontrado por Bray et al. [15]. Todas las muestras se utilizaron para el análisis de microarrays, independientemente de su número RIN de entender si la plataforma de microarrays podría destacar mejor proxies de calidad para la manipulación de tejidos. La distribución de las intensidades de características por conjunto fue muy similar en todos los 180 arrays analizados, lo que sugiere que todos los ARN realizan al mismo nivel y que hibridaciones se realizaron de manera similar; sólo 4 muestras no pasan los controles de calidad.
Para evaluar la variabilidad de las mediciones de expresión génica como una función de tiempo, cada característica (sonda) se modeló respecto a las categorías de tiempo y se ajusta para el factor del paciente. Esto se hizo por separado en ambos tumor y los conjuntos de datos normales. El uso de una corrección de Bonferroni de P & lt; 0,05, treinta y un sondas fueron identificados como dependiente del tiempo en las muestras de tumor y de treinta y dos en las muestras normales. Muchos de los genes identificados en el tumor de datos fueron ADN vinculante proteínas implicadas en diferentes procesos: algunos correspondían a genes implicados en el cáncer, como
ABL1
,
junio
,
FOSB
,
NFKB1A
y
CCL5
; cuatro sondas pertenecían a las histonas (
HIST1H1E
,
HIST1H4E
,
HIST1H1D
y
HIST4H4
), otros eran factores de transcripción (
DDIT3
) o genes implicados en la transcripción como
EGR1
y
PPP1R15A
. Seis genes estaban involucrados en la apoptosis, uno de los procesos inducidos por resección de tejido. La mayoría de los genes identificados (N = 22) fueron significativas en la comparación de tiempo que involucra todos los puntos temporales, 16 fueron identificados en T3 frente a T0 contraste y sólo 3 genes (
ABL1
,
Opiniones y junio
FOS
) en ambos momentos T2 y T3. Nueve genes cambiado solamente en T3. Por otra parte, muchos de los genes identificados en las muestras normales (N = 21) correspondían a genes que codifican para las proteínas histonas, y tres eran pequeños ARN nucleares (
RNU2-1
,
RNU11
y
RNU12
). Treinta y dos genes cambiados sobre todos los cuatro puntos de tiempo analizados; 17 de ellos eran significativamente diferentes a T3 punto de tiempo y 8 en ambos puntos temporales T2 y T3. Dos genes cambiado solamente en T3. Al realizar el mismo análisis utilizando sólo las muestras con un RIN encima de cinco muy pocos genes fueron identificados (6 sondas en ambos conjuntos de datos) de los cuales principalmente histonas estaban en común con los genes identificados previamente. Los resultados de estos dos enfoques indican que los cambios observados en el tiempo son bastante insignificante. De hecho, cuando se compararon los tipos de tejidos tumorales entre ambos conjuntos de datos normal y un gran número de diferencias que se observaron, como se esperaba, con independencia de la calidad de la RIN. Además, el análisis funcional de estas sondas utilizando la Enciclopedia de Kyoto de genes y la base de datos vía genomas (KEGG) demostró que estas diferencias emparejaron con once vías importantes que participan en la progresión del cáncer, incluyendo el ciclo de la célula, la replicación del ADN y la vía de señalización de p53 (datos no mostrados).
los cambios observados en los genes para los tejidos normales y tumorales se produjeron principalmente en T3, aunque algunos genes ya se alteraron en T2, lo que sugiere que un punto de tiempo crítico establece en 60 minutos a temperatura ambiente. Curiosamente, los tres genes que mostraron cambios ya en T2 en muestras de tumores fueron todos oncogenes, lo que sugiere que considerar cuidadosamente las alteraciones de estos genes durante la manipulación de las muestras de tumor y de usar un umbral de tiempo más conservador (es decir, 60 minutos) para la recogida de muestras. se incrementaron los niveles de expresión en el tiempo de la mayoría de los genes. El presente hallazgo está de acuerdo con lo encontrado por Dumur et al. [16] en los casos de cáncer de ovario y por Bray et al. [15], en CRC, donde el número de sondas con el aumento de expresión aumenta con el tiempo. Como se ha discutido por los autores de los dos estudios, esto es contrario a lo que se esperaba ya que el tiempo de manipulación debe favorecer la degradación de transcritos de ARN y puede al menos en parte reflejar una modulación de la expresión génica activa. Comparación entre GO clasificación de los genes expresados diferencialmente en nuestros (valores de p & lt FDR ajustados; 0,05) y los análisis de Bray mostraron algunos términos comunes enriquecidos ( 'actividad dimerización de la proteína y de actividad del factor de transcripción'). Las posibles explicaciones para estos resultados podrían ser los diferentes puntos de tiempo evaluados (hasta 360 minutos en nuestro estudio y hasta 120 minutos en el estudio de Bray), diferentes procedimientos seguidos para la recogida de muestras (muestras quirúrgicas que siguieron a la norma procesamiento rutinario vs biopsias tumorales) y diferentes plataformas de microarrays de expresión utilizados para los análisis (Illumina vs Affymetrix).
Dos de los tres genes seleccionados para la validación
en los tejidos tumorales gratis (
Jun y FosB) confirmaron los resultados de la matriz
. Estos genes también se encontraban entre los mRNAs más afectados significativamente por el momento de la congelación en un estudio de cáncer de mama [17]. Como se informó por estos autores, Jun y FOSB son inducidos por el estrés inmediatos primeros factores de transcripción que son componentes de AP-1 dímeros, y estos dímeros se han encontrado alterados por isquemia en diferentes tejidos, incluyendo la próstata y cáncer de colon. En las células isquémicas y riperfused los dos genes inducen la proliferación y la apoptosis y podrían estar estrechamente relacionados con intentos para la degradación o la regeneración de los tejidos injuried [18]. Cinco sondas fueron compartidos entre las muestras normales y tumorales. Identificaron los genes de la familia de histonas (
HIST1H1D
,
HIST1H1E
,
HIST1H4E
y
HIST4H4
) que participan en la organización del ADN, y un pequeño ARN nuclear (
RNU11
). Sólo uno de estos genes (
HIST1H4E
) validaron los datos de microarrays. La alta similitud de secuencia de las histonas podría explicar el elevado número de histonas moduladas identificados, que podría ser debido a la hibridación inespecífica parcial y podría ser la razón de la falta de validación con una técnica independiente.
En el presente trabajo se han descrito por primera vez el efecto en el tiempo en el manejo de hasta 6 horas de tejido colorrectal normal, que se utiliza con frecuencia como control en los análisis en todo el genoma. Curiosamente, el tejido normal mostró una menor degradación de sus espécimen tumorales correspondientes, tanto en términos de la calidad del ARN (valor RIN) y de genes modulados que eran principalmente histonas. Nuestros resultados favorecen el almacenamiento de tejido normal, además de la tumoral.
no parecen Los cambios globales en la expresión génica observados en las muestras analizadas en el estudio actual, donde se investigaron más de 16000 sondas, para correlacionar con un evento transcriptoma global que se podría esperar, al menos durante el período de tiempo analizado en este estudio (& lt; 20 minutos, 60 minutos, 180 minutos y 360 minutos). Teniendo en cuenta el escaso número de genes afectados se encuentra, el impacto del tiempo de manipulación del tejido en la expresión global de genes de perfiles, por lo menos en el CCR, podría considerarse de menor importancia y no se espera que juegue un papel importante en la estratificación del tumor basada en la expresión génica.
Nuestros resultados están de acuerdo con la de Dumor et al. [16] y de Micke et al. [19] que no mostró cambios relevantes en el cáncer de ovario y con lo que Hatzis et al. encontrado en el cáncer de mama [20]. Otros estudios han demostrado alteraciones significativas en ARN después de 30 minutos de la extirpación del tejido [15]; [21]; [22]. Dado que nuestro diseño no incluyó los primeros tiempos, no podemos excluir que los cambios pertinentes ya han ocurrido antes de nuestro primer punto de tiempo (20 minutos). Sin embargo, los estudios antes mencionados tienen típicamente tamaños de muestra muy bajos y necesitarían una mayor validación.
alteración significativa del perfil de expresión génica se observó en nuestro estudio anterior en especímenes de cáncer de mama, donde el tiempo de manipulación del tejido alterado la expresión de los genes incluidos en el más común de cáncer de mama predictivos firmas de genes [23]. Estos datos están de acuerdo con Borgan et al. [17], que encontraron miARN (microARN) y la expresión del ARNm alteradas en el cáncer de mama con el tiempo de isquemia hasta seis horas. De hecho, Hatzis y colegas [20] en el cáncer de mama no mostraron cambios significativos en los niveles de expresión de los genes individuales y firmas multigene, probablemente debido a que consideraban 40 minutos como punto de tiempo más largo a temperatura ambiente o hasta 180 minutos, pero utilizando el ARN más tarde para preservar la integridad del ARN.
a pesar del desacuerdo parcial en su extensión, el tiempo de manipulación de tejidos puede tener un efecto sobre la expresión génica, y probablemente podría variar con el tejido y con el tipo de tumor, incluyendo los que podrían exhibir una mayor sensibilidad a los efectos de hipoxia , tales como tumores cerebrales [24].
conclusiones
los resultados que cuatro de los pocos genes significativamente diferentes entre los puntos de tiempo analizados en las muestras tumorales fueron oncogenes, insinúa que el análisis de su expresión en especímenes tumorales podrían conducir a resultados engañosos. Incluso si el tiempo de manipulación del tejido tiene un impacto débil sobre el perfil global de la expresión génica, la desregulación de los genes que participan directamente en los procesos tumorales implica que los tejidos deben ser almacenados en los primeros tiempos después de la cirugía (en nuestro contexto no más de una hora) y apoyan firmemente su introducción como guía para depósitos de tejidos.
Apoyo a la Información
Figura S1.
alteración Expresión en cada punto de tiempo en el tumor (A) y Normal (B) de datos
doi: 10.1371 /journal.pone.0053406.s001 gratis (PPTX)
figura S2. Gráficos de dispersión de los valores
RT-PCR? Ct (eje x) frente a valores de intensidad log2 microarrays (Y-ejes) de los genes ABL1, Jun y FosB. En cada gráfico se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson (R) para medir la fuerza de la asociación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053406.s002 gratis (PPTX)