Extracto
Varios células de mamíferos, incluyendo las células cancerosas, arrojar vesículas extracelulares (EVs), también conocidos como los exosomas y microvesículas, en los tejidos circundantes. Estos vehículos eléctricos juegan un papel en el crecimiento del tumor y la metástasis mediante la promoción de la angiogénesis. Sin embargo, sigue siendo desconocido el mecanismo detallado de cómo los vehículos eléctricos derivados del cáncer provocan la activación de las células endoteliales. Aquí, nos proporcionan la prueba de que la respuesta-1 (Egr-1) la activación temprana de crecimiento en las células endoteliales está implicada en la actividad angiogénica de los vehículos eléctricos derivados de células de cáncer colorrectal. Ambos RNA regulación a la baja interferencia mediada de Egr-1 y ERK1 /2 o un inhibidor de JNK significativamente bloqueado mediada por EV Egr-1 de activación y migración de células endoteliales. Por otra parte, los lípidos inhibidor de la endocitosis mediada por balsa efectivamente bloqueado endotelial Egr-1 de activación y la migración inducida por los vehículos eléctricos derivados del cáncer. Nuestros resultados sugieren que Egr-1 de activación en las células endoteliales puede ser un mecanismo clave involucrada en la actividad angiogénica de los vehículos eléctricos derivados del cáncer. Estos resultados van a mejorar nuestra comprensión acerca de las actividades proangiogénicos de vehículos eléctricos en diversas condiciones patológicas como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades neurodegenerativas
Visto:. Yoon YJ, Kim DK, Yoon CM, Parque J, Kim YK, Roh TY, et al. (2014) Egr-1 Activación por Derivado-cáncer extracelular vesículas promueve la migración de células endoteliales a través de ERK1 /2 y JNK vías de señalización. PLoS ONE 9 (12): e115170. doi: 10.1371 /journal.pone.0115170
Editor: Shilpa J. Buch, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Junio, 2014; Aceptado: 19 Noviembre 2014; Publicado: December 12, 2014
Derechos de Autor © 2014 Yoon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigador mitad de su carrera a través de subvención financiado por la NRF MEST (Nº 2014023004), BK21 Plus (10Z20130012243), financiado por el Ministerio de Educación , Corea, y la Fundación Nacional de Investigación de Corea (2011-0030049). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Varios tipos de células de mamíferos, tales como células de cáncer, macrófagos, células endoteliales, plaquetas y células epiteliales liberan vesículas extracelulares (EVs) en su entorno de los compartimentos de plasma y endosomal de membrana [1] - [4] . Estos vehículos eléctricos de mamíferos, también conocido como exosomas y microvesículas, son de doble capa proteolípidos esféricas con un diámetro medio de 40 a 250 nm y se enriquecen con diversos constituyentes bioactivos, incluyendo proteínas, lípidos, y el material genético [1] - [9]. La creciente evidencia ha revelado que los vehículos eléctricos desempeñan funciones pleiotrópicos en la comunicación intercelular:. EVs estimulan a las células receptoras mediante la activación de un receptor y la transferencia de las proteínas de membrana, moléculas de señalización, ARNm, y miRNAs [4] - [9]
EVs han sido a menudo se hace referencia como "polvo celular", aunque las células arrojan los vehículos eléctricos, ya sea constitutivamente o de manera regulada [1] - [9]. Por otra parte, las proteínas, ARNm, o miRNAs en vehículos eléctricos difieren en composición dependiendo de los estados de las células del donante [1], [4]. Recientemente, nuestro grupo reveló que las proteínas de los vehículos eléctricos derivados de células de cáncer colorrectal humano se interconectan a través de interacciones físicas y agrupar en módulos funcionales implicados en la biogénesis y función EV [4], [10]. Además, la secreción de los vehículos eléctricos es un proceso celular universal, que ocurre a partir de organismos simples (Archea o Gram-negativas y bacterias Gram-positivas) a organismos multicelulares complejos, lo que sugiere que esta comunicación EV mediada se conserva evolutivamente [9], [11] - [13]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que los vehículos eléctricos desempeñan diversos papeles en la comunicación intercelular [6], [10]. Sin embargo, los papeles fisiopatológicos de los vehículos eléctricos no se entienden completamente.
La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, es un proceso complejo y múltiples etapas que implica la adhesión, migración, invasión, proliferación y diferenciación de las células endoteliales [14], [15]. Esta neovascularización se produce en diversas condiciones normales y patológicas [14]. Por ejemplo, la angiogénesis es esencial para el crecimiento tumoral y la metástasis al proporcionar oxígeno y nutrientes a la creciente tumor [15]. En el microambiente tumoral, una población heterogénea de células, incluyendo las células de cáncer, células endoteliales, fibroblastos y células inmunes modula un entorno favorable para el crecimiento del tumor y la invasión [16] - [18]. Estas células cancerosas y estromales secretan factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), e IL-6 en la zona circundante y estos factores contribuyen a la angiogénesis asociada a tumores [16] - [19].
Además de estos factores solubles proangiogénicos, las células que comprenden el tejido tumoral secretan EVs en el medio extracelular y estos derramada EVs juegan múltiples papeles en el crecimiento del tumor y la metástasis mediante la promoción de la angiogénesis, la invasión tumoral y escape inmune [4] - [8], [20] - [23]. Después de que el informe inicial sobre las actividades angiogénicas de los vehículos eléctricos derivados de fibrosarcoma humano HT1080 y 145 DU-células de carcinoma de próstata humano [5], varios estudios confirmaron que los vehículos eléctricos deriva de las células cancerosas, los fibroblastos y las células madre del cáncer de promover la
in vitro
y
in vivo
angiogénesis [4], [8], [24] - [28]. Estas actividades angiogénicas de los vehículos eléctricos están mediadas por lípidos vesicular (s), las proteínas, incluyendo los receptores y proteínas tetraspanin, mRNAs, y miRNAs. Sin embargo, el mecanismo detallado de cómo los vehículos eléctricos provocan actividad angiogénica no se ha estudiado de forma exhaustiva.
El crecimiento inicial de respuesta-1 (Egr-1), un gen temprano inmediato y un factor de transcripción con dedos de zinc, juega un papel crucial en la la angiogénesis [29] - [32]. Además de suero exposición, Egr-1 puede ser inducida rápida y transitoriamente por citoquinas, factor de crecimiento, y el estrés ambiental, incluyendo la hipoxia, esfuerzo de cizalladura de fluido, y la lesión vascular [33], [34]. Egr-1 regula la expresión de genes proangiogénicos, tales como VEGF, FGF2, y IL-6 en las células endoteliales o TNF-α en macrófagos [31], [34] - [36]. En el tejido tumoral, las células endoteliales, las células cancerosas, los fibroblastos y los macrófagos infiltrantes de tumores pueden expresar Egr-1. Además, la densidad de microvasos en los tejidos tumorales obtenidos de Egr-1-ratones deficientes son más bajos que los obtenidos de ratones de tipo salvaje [37] y la formación de estructura de los vasos como en el tejido tumoral fue suprimida por DNAzymes que se dirigen a Egr-1 mRNA [31] , lo que sugiere que Egr-1 juega un papel esencial en el crecimiento del tumor y la angiogénesis. En este sentido, han informado de varios estudios que Egr-1 expresión en células de cáncer, células endoteliales y macrófagos se relaciona con la progresión tumoral [32], [36] - [38]. En conjunto, estos resultados sugieren que el Egr-1 juega un papel importante en la angiogénesis asociada a tumores y la progresión tumoral.
En este informe, aportar pruebas de que la activación de Egr-1 en las células endoteliales debe ser un mecanismo clave que participan en el actividad angiogénica de los vehículos eléctricos derivados del cáncer. Se encontró que el Egr-1 de activación por EVs derivados de células de cáncer colorrectal promovió la migración de células endoteliales a través de la ERK1 /2 y JNK vías de señalización y de lípidos endocitosis balsa mediada.
Materiales y Métodos
Cell
cultura
adenocarcinoma humano colorectal (SW480), carcinoma colorrectal (HCT116), adenocarcinoma de pulmón (A549), y fibrosarcoma (HT1080), y del epitelio bronquial normal de las células (BEAS-2B) se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; Invitrogen), 100 U /ml de penicilina, y 0,1 mg /ml de estreptomicina. células de carcinoma de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) y de próstata (PC3) se mantuvieron en MEM (Invitrogen) suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina, y 0,1 mg /ml de estreptomicina. SW480, HCT116, A549, HT1080, SH-SY5Y, PC3, y BEAS-2B se adquirieron de la American Type Culture Collection. Las células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1s) se cultivaron en medio de crecimiento endotelial-2 (EGM-2; Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) [5]. células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) se aislaron a partir de cordones umbilicales recién entregados y mantuvieron como se describe anteriormente [39]. Las HUVEC se cultivaron en medio 199 (Invitrogen) suplementado con 20% de SFB, 3 ng /ml FGF2 (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), 5 U /ml de heparina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) , 100 U /ml de penicilina, y 0,1 mg /ml de estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Todas las líneas celulares estaban libres de micoplasma confirmado usando el kit de correo MiCo Mycoplasma PCR Detección (Intron Biotecnología. Inc., Seúl, Corea).
Purificación de EVs
EVs se purificaron mediante una combinación de centrifugación diferencial, la ultrafiltración usando una membrana de fibra hueca de 100-kDa, ultracentrifugación en cojines de sacarosa, y ultracentrifugación en gradiente de densidad iodixanol de acuerdo con métodos previamente establecidos [8]. Brevemente, el 80-90% de células confluentes se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y después se incubaron durante 24 h en medio libre de suero RPMI 1640 (SW480, HCT116, A549, HT1080, y BEAS-2B) o medio MEM libre de suero ( SH-SY5Y y PC3). Aproximadamente 2000 ml de medio acondicionado se centrifugó a 500
g
durante 10 min, y luego dos veces en 2000
g
durante 15 min para eliminar la contaminación de la célula. El sobrenadante se concentró aún más mediante el sistema de sobremesa QuixStand con una membrana de fibra hueca de 100 kD (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). El concentrado (~ 35 ml) se colocó en 0,5 ml de 0,8 y 2,0 M almohadillas de sacarosa en tampón (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) y después se centrifugó a 100.000
g
durante 2 h (SW 32 Ti rotor basculante cubo con un factor k de 256.8). Los vehículos eléctricos (0,5 ml) se recogieron de la interfase entre las 0,8 y 2,0 M cojines de sacarosa, se diluyó con 9 ml de solución salina tamponada con fosfato, colocado sobre 0,35 ml de 0,8 M y 0,15 ml de 2,0 M cojines de sacarosa y se centrifugaron a 100.000
g
durante 2 h (SW 41 Ti oscilación cubo de rotor con un factor k de 256,6). Los vehículos eléctricos (0,5 ml) se recogieron de la interfase entre las 0,8 y 2,0 M cojines de sacarosa, y se diluyeron con 1,42 ml de tampón fosfato salino y 2,88 ml de 50% iodixanol (Axis-Shield PoC AS, Nycomed, Noruega), a dar el 30% iodixanol. Esta muestra se colocó en la parte inferior de un tubo y cubrió con 3 ml de 20% iodixanol y 2,5 ml de 5% iodixanol. Después de centrifugación a 200.000
g
durante 2 h (SW 41 Ti oscilación cubo de rotor con un factor k de 128,3), 10 fracciones de igual volumen (1 ml) fueron retirados de la parte superior del gradiente. Finalmente, se midieron los vehículos eléctricos purificados por su contenido de proteína usando el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Munich, Alemania) y se aplican a otros ensayos. Obtuvimos 70-150 g de vehículos eléctricos en las proteínas totales de ~2,000 ml de 24 h medio condicionado libre de suero de células cancerosas (SW480, HCT116, A549, HT1080, SH-SY5Y, y PC3): el rendimiento de los vehículos eléctricos de la misma cantidad de células normales humanas bronquiales epiteliales (BEAS-2B) es ~ 10 g de las proteínas totales.
Western El análisis de transferencia
Cada fracción de gradientes de densidad de iodixanol fue separado por SDS-PAGE y luego se transfiere a una membrana de difluoruro de polivinilideno. La membrana se bloqueó y se incubó con el ratón anti-CD81 (BD Biosciences, San Jose, CA), ratón anti-CD63 de anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anticuerpo de ratón anti-GM130 (BD Biosciences), y anti ratón -cytochrome
c
de anticuerpos (BD Biosciences), seguido de anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con un sustrato chemiluminnescent.
ensayo murino Matrigel y inmunotinción
Se utilizaron ratones de tipo salvaje 6-8 semanas de edad, del Laboratorio Jackson. Los ratones (n = 5) se inyectaron por vía subcutánea con 0,5 ml de Matrigel (BD Biosciences) que contiene 20 g de EVs SW480 derivado o solución salina tamponada con fosfato (Invitrogen). En el día 7 después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y el Matrigel se retiró y se tiñeron durante todo el montaje de inmunofluorescencia. Los vasos sanguíneos se inmunotiñeron con anticuerpo de cabra anti-CD31 (Cell Signaling Technology), seguido por el anticuerpo anti-cabra de burro AlexaFluor488 (Invitrogen). Todas las imágenes se visualizaron utilizando un microscopio confocal Olympus FV1000 (Olympus, Tokio, Japón) equipado con una lente de objetivo UPlanSApo 20 × /0,75 y adquiridos utilizando software FV1000-ASW 1,5 (Olympus). El área de CD31-positivo (m
2) en la imagen de inmunofluorescencia se analizó cuantitativamente utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health). Todos los animales recibieron cuidado humano, y se aprobaron los experimentos por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Pohang de Ciencia y Tecnología, Pohang, República de Corea (número de autorización: 2011-01-0015).
arañazos cicatrización de heridas ensayo
HMEC-1 se sembraron en placas de cultivo celular de 24 pocillos (Corning Inc., Corning, NY) a una densidad de 1 × 10
5 células por pocillo y se dejó que se unieran durante la noche. Confluentes HMEC-1 fueron heridas por un arañazo deliberada y se incubaron con los vehículos eléctricos de control, SW480 derivados (1 mg /ml, 0,5 ml), o EGM-2. Doce horas después de la lesión, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato, se tiñeron con CellTracker (Invitrogen), y se fijaron en paraformaldehído al 4% antes de imágenes de fluorescencia. Las imágenes fueron visualizados con una Olympus 1 × 81 microscopio de fluorescencia invertido (Olympus) y adquiridos utilizando el software MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
proliferación endotelial ensayo
HMEC-1 eran en placas de cultivo celular de 24 pocillos (Corning Inc., Corning, NY) con cubreobjetos de vidrio (Fisher Scientific, Rochester, NY) a una densidad de 5 × 10
4 células por pocillo y se dejó que se unieran durante la noche. Después de un tratamiento de 24 h con el control, los vehículos eléctricos SW480 derivados (1 g /ml, 0,5 ml), o EGM-2, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se incubaron con anticuerpo de conejo anti-fosfo-histona H3 (PH3) (Upstate biotecnología, Lake Placid, Nueva York), seguido de anticuerpos IgG anti-conejo de cabra AlexaFluor488 (Invitrogen). Los núcleos se contratiñeron con Hoechst (Sigma-Aldrich). Las imágenes se visualizan en un microscopio confocal Olympus FV1000 (Olympus) y adquiridas mediante FV1000-ASW 3.0 del software (Olympus). El porcentaje de células positivas PH3 se cuantificó contando las células con señales de fluorescencia co-localizados.
Real-time RT-PCR
cebadores de PCR utilizados en este estudio fueron diseñados utilizando el programa Primer3 (Instituto Whitehead, http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi). Los cebadores utilizados para la amplificación del gen fueron los siguientes: GAPDH adelante, 5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3 '; GAPDH inverso, 5'-TTCACACCCATGACGAACAT-3 '; EGR1 adelante, 5'-CCGCAGAGTCTTTTCCTGAC-3 '; EGR1 inversa, 5'-AGCGGCCAGTATAGGTGATG-3 '. HMEC-1 (2 × 10
5 células) se sembraron en placa de cultivo celular de 6 pocillos se trataron con los vehículos eléctricos (1 g /ml, 2,0 ml) durante 0,5, 1, 1,5, 2 y 4 h. Se extrajo el ARN de las células cultivadas utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Para el tiempo real de RT-PCR, el ARN total (100 ng) se amplificó con un kit de un solo paso SYBR RT-PCR (Takara Bio, Tokyo, Japón) usando un sistema LightCycler 2.0 PCR (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La amplificación se lleva a cabo calentando las muestras a 50 ° C durante 2 min, luego a 95 ° C durante 10 min, seguido de ciclos que se repiten a 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 10 seg, y 72 ° C durante 10 seg, para un total de 45 ciclos. El método comparativo Ct se utilizó para la cuantificación relativa de expresión del gen diana frente a la de un gen de mantenimiento, GAPDH [40].
Egr-1 de translocación nuclear
HMEC-1 se sembraron en 24 y placas de cultivo celular (Corning Inc.) con cubreobjetos de vidrio (Fisher Scientific) a una densidad de 5 × 10
4 células por pocillo y se dejó que se unieran durante la noche. Las células fueron tratadas con los vehículos eléctricos SW480 derivados (1 g /ml, 0,5 ml), se fijaron con 4% de paraformaldehído, y se incubaron con anticuerpo de conejo anti-Egr-1 anticuerpo (Cell Signaling Technology, Hitchin, Reino Unido) seguida de AlexaFluor488 cabra anti- anticuerpo IgG de conejo (Invitrogen). Los núcleos se contratiñeron con Hoechst (Sigma-Aldrich). Las imágenes se visualizan en un microscopio confocal Olympus FV1000 (Olympus) y adquiridas mediante FV1000-ASW 3.0 del software (Olympus). El porcentaje de células Egr-1-positivos se cuantificó contando las células con señales de fluorescencia co-localizado.
Para investigar el efecto de inhibidores (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, EE.UU.) o metil señalización β-ciclodextrina (MβCD; Sigma-Aldrich) en Egr-1 translocación nuclear, HMEC-1 se trataron con ERK1 2 inhibidor /(PD98059, 20 M), el inhibidor de p38 MAPK (SB203580, 10 M), el inhibidor de JNK (SP600125, 20 M), inhibidor de Akt (BML-257, 20 mM), o MβCD (10 mM) en presencia o ausencia de los vehículos eléctricos derivados de SW80 (1 mg /ml).
downregulation mediada por interferencia de ARN de Egr -1
pequeños ARN de interferencia (siRNA) de Egr-1 (Bioneer, Daejeon, Corea del Sur) a una concentración final de 50 nM se transfectó en HMEC-1 utilizando Welfect-Q (Welgene, Daegu, Corea). No silenciamiento revueltos siRNA se utilizó como control negativo. Después de 48 h, las células se utilizaron para el análisis en tiempo real de RT-PCR para determinar el nivel de Egr-1 mRNA expresión, Egr-1 ensayos de traslocación nuclear, y los ensayos de curación de heridas de rascar. Las secuencias de siRNA fueron los siguientes: siRNA, 5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 'revueltos; Egr-1 siRNA-1, 5'-CAGUAUCAUCUCCAUCAUA-3 '; Egr-1 siRNA-2, 5'-AGUUUGCCAGGAGCGAUGA-3 '; Egr-1 siRNA-3, 5'-GUGCAAUUGUGAGGGACAU-3 '.
EV captación
EVs
SW480-derivados se marcaron con Dil (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. EVs Brevemente, derivados de SW480 (100 mg) se incubaron con DiI (1 M) durante 15 min a 37 ° C y se centrifugaron a 100.000
g
durante 2 horas a 4 ° C (tipo 90 Ti rotor de ángulo fijo con un factor k de 126,4). Los gránulos, los vehículos eléctricos marcadas con DiI, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, y después de ultracentrifugación a 100.000
g
durante 2 horas a 4 ° C (tipo 90 Ti rotor de ángulo fijo con un factor K de 126,4), se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato. HMEC-1 se trataron previamente sin o MβCD (10 mM) durante 0,5 h, y después se incubaron con los vehículos eléctricos SW480 derivados de DiI-marcados (1 g /ml, 0,5 ml) durante 1 h. Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído y los núcleos se tiñeron con Hoechst (Sigma-Aldrich). Las imágenes se visualizan en un microscopio confocal Olympus FV1000 (Olympus) y adquiridos utilizando el software FV1000-ASW 3.0 (Olympus).
análisis estadísticos
Todos los valores se expresan como medias ± S. D.
valores P se calcularon a partir de una sola vía o de dos vías de análisis de varianza (ANOVA) con la corrección de Bonferroni, basado en comparaciones con las muestras de control adecuadas analizadas al mismo tiempo.
Resultados
EV-SW480 derivada promueven
in vivo
y
in vitro
angiogénesis
EVs liberadas por las células SW480 se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo mediante una combinación de centrifugación diferencial , ultrafiltración utilizando una membrana de fibra hueca 100-kDa, ultracentrifugación en cojines de sacarosa, y gradientes de densidad de iodixanol como se informó [8]. De acuerdo con el estudio anterior [8], los vehículos eléctricos purificadas tenían una densidad de ~1.098 g /ml y se albergaron CD81 y CD63, proteínas marcadoras EV (Fig. 1A). Sin embargo, estos vehículos eléctricos purificadas no contenían GM130 (a
cis -Golgi
proteína) y el citocromo
c
(una proteína mitocondrial encuentra en cuerpos apoptóticos): estas dos proteínas son bien conocidos no proteínas vesiculares (Fig. 1B). En primer lugar, demostramos que los vehículos eléctricos derivados de células de adenocarcinoma colorrectal humano SW480 inducidos
in vivo
neovascularización (Fig. 1C y 1D). Cuando se inyectaron EVs SW480 derivado dentro de Matrigel por vía subcutánea en ratones, se observó una formación masiva de estructuras de los vasos como CD31-positivas (Fig. 1C). En contraste, no se detectó la formación de vasos aparente en el Matrigel sin vehículos eléctricos. Vehículos eléctricos inducidos de manera significativa un aumento de 10,4 veces en la zona de CD31-positivas en Matrigel en comparación con el control sin tratar (Fig. 1D).
(A, B) EVs liberadas por las células SW480 se purificaron de sobrenadantes de cultivo por una combinación de centrifugación diferencial, ultracentrifugación en cojines de sacarosa, y gradientes de densidad de iodixanol. Cada fracción de gradientes de densidad de iodixanol se analizó por transferencia Western para detectar CD81 y CD63, las proteínas marcadoras de los vehículos eléctricos (A). Los vehículos eléctricos purificados en la fracción 3 se analizaron por Western Blot para detectar proteínas marcadoras no EV (GM130 y citocromo
c
). SW480 derivados de todo el lisado celular (CMT; 10 g) y vehículos eléctricos SW480-derivado (EVs; 10 g) fueron cargados para el análisis de transferencia de Western (B). (C, D) de Matrigel en presencia o ausencia de los vehículos eléctricos derivados de SW480 (20 g) se inyectaron por vía subcutánea en ratones C57BL /6. Después de 7 días, la tinción de Matrigel todo el montaje con el anticuerpo anti-CD31 se llevó a cabo (n = 5). fotografías Z-pila confocal representativas de los montajes enteros teñidos para CD31 (verde) se muestran en el panel C. barras de escala representan 100 micras. Se midieron las intensidades de fluorescencia de CD31 tinción del plano Z-pila de la Matrigel como se describe en los Métodos (D). (E) la actividad migratoria de los vehículos eléctricos SW480 derivados se evaluó mediante un ensayo de cicatrización de heridas cero. Confluentes HMEC-1 se rascaron y se trataron con EVs SW480-derivado (1 mg /ml); a continuación, se evaluó el número de células migradas en la zona desnuda después de 12 h (n = 3). (F) la actividad proliferativa de los vehículos eléctricos SW480-derivado (1 mg /ml) se evaluó mediante la evaluación del PH3 marcador mitosis. Después de 24 h, la PH3 y los núcleos se tiñeron con anticuerpo anti-PH3 y Hoechst, respectivamente y se evaluaron por microscopía confocal. El porcentaje de células PH3-positivas en HMEC-1 se cuantificó contando las células con señales de fluorescencia co-localizados (n = 3). Como control positivo, HMEC-1 se trataron con EGM-2 medio suplementado con diversos factores angiogénicos tales como EGF, FGF2, VEGF, y IGF1. Los datos se representan como media ± DE. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P Hotel & lt; 0,001; N. S.,
no es significativo. A continuación se investigó la actividad de los vehículos eléctricos proangiogénico SW480 derivado de células endoteliales humanas, HMEC-1
in vitro
. ensayos de curación de heridas de Scratch revelaron que los vehículos eléctricos indujo un aumento de 4,1 veces en el número de células endoteliales migrados en la zona desnuda en comparación con el control sin tratar (Fig. 1E). Además, los vehículos eléctricos potentemente estimula la proliferación de células endoteliales: el porcentaje de células PH3-positivas aumentó 8,9 veces más que la de las células no estimuladas (Fig 1F.). El control positivo, EGM-2 suplementado con diversos factores angiogénicos tales como EGF, FGF2, VEGF, y IGF1, tanto de la migración de células endoteliales también inducida y la proliferación. También se observaron las actividades migratorias y proliferativas de EVs derivados de SW480 en otras células endoteliales, HUVECs (datos no mostrados). Por lo tanto, nuestros datos indican que los vehículos eléctricos tienen SW480 derivado
in vivo
y
actividades angiogénicas in vitro
.
SW480-derivan vehículos eléctricos inducen la activación de Egr-1 en las células endoteliales
Egr-1 juega un papel crucial en la angiogénesis asociada a tumores [29] - [32]. lo tanto, examinar la posibilidad de la activación endotelial de Egr-1 por los vehículos eléctricos derivados-SW480 (Fig. 2). Los análisis en tiempo real RT-PCR reveló que el tratamiento con vehículos eléctricos SW480 derivados causada elevación rápida y transitoria de Egr-1 de expresión a nivel transcripcional en las células endoteliales humanas, HMEC-1s y HUVECs (Fig. 2A). Utilizamos HMEC-1 en los siguientes experimentos. Por otra parte, los vehículos eléctricos de otras células humanas de cáncer (carcinoma colorrectal HCT116, adenocarcinoma de pulmón A549, fibrosarcoma HT1080, carcinoma de próstata PC3, y neuroblastoma SH-SY5Y) también indujo Egr-1 la expresión de ARNm en las células endoteliales humanas, mientras que los vehículos eléctricos a partir de células epiteliales bronquiales humanas normales (BEAS-2B) no (Fig. 2B). Además, investigó la activación de Egr-1 después de la estimulación por los vehículos eléctricos derivados-SW480. EVs indujo la expresión rápida y transitoria y la translocación nuclear de la proteína Egr-1 en HMEC-1; se observó el efecto máximo a 1 h después del tratamiento EV (Fig. 2C y 2D). Tomados en conjunto, los vehículos eléctricos de cáncer derivado de inducir la activación de Egr-1 mediante el aumento de su expresión y translocación nuclear en las células endoteliales. Estas observaciones sugieren que Egr-1 de activación podría ser crítico para la modulación de la angiogénesis inducida por EV.
(A) HMEC-1 y HUVECs se incubaron con EVs SW480 derivados (1 g /ml) o control sin tratar. Se aisló el ARNm a partir de células de control no tratadas o células tratadas con los vehículos eléctricos durante 0, 0,5, 1, 2, y 4 h y se analizó usando el tiempo real de RT-PCR (n = 3). Los valores representan Egr-1 mRNA /mRNA GAPDH normalizado a las células control sin tratar. (B) HMEC-1 se trataron con los vehículos eléctricos (/ml 1 g) derivado de carcinoma HCT116 colorrectal, adenocarcinoma de pulmón A549, fibrosarcoma HT1080, carcinoma de próstata PC3, neuroblastoma SH-SY5Y, y BEAS-2B células epiteliales bronquiales normales durante 0,5 h ( n = 3). (C, D) En HMEC-1, la translocación nuclear de la proteína Egr-1 después de la estimulación con EVs SW480 derivados (1 g /ml) durante 0,5, 1, 2, y 4 h se analizó con microscopía confocal (n = 3) . Los núcleos y Egr-1 proteínas se tiñeron con Hoechst (azul) y anti-Egr-1 anticuerpo (rojo), respectivamente. señales de fluorescencia co-localizados (púrpura) indican la translocación de Egr-1 en el núcleo. fotografías representativas se muestran en el panel C. Escala barras representan 30 micras. El porcentaje de núcleos Egr-1-positivas se determinó midiendo el número de células con núcleo señales colocalized más que del total de células (D). Los datos se representan como media ± DE. *
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Egr-1 atenúa
A continuación se investigó el papel de Egr-1 en EV inducida por la migración de células endoteliales inducida por los vehículos eléctricos SW480 derivado de ARNsi migración de células endoteliales usando siRNA. Cuando se examinaron tres Egr-1 siRNAs, se encontró que Egr-1 siRNA-1 reduce más eficazmente el nivel de ARNm Egr-1 en las células endoteliales pero revueltos siRNA no muestra este efecto inhibidor (Fig. 3A). Las células endoteliales tratadas con Egr-1 siRNA-1 bloqueado de manera eficiente EV-inducida Egr-1 de activación (Fig. 3B) y la migración observada en los ensayos de curación de heridas scratch (Fig. 3C y 3D), mientras revueltos siRNA no mostró estos efectos inhibitorios . Por lo tanto, nuestros resultados indican que la expresión y translocación nuclear de Egr-1 EV-inducida en las células endoteliales deben contribuir a la migración de las células endoteliales EV-inducida.
(A) HMEC-1 fueron transfectadas con 50 nM de ARNsi revueltos o Egr-1 siRNA-1, Egr-1 siRNA-2, o Egr-1 siRNA-3. mRNAs fueron aisladas de las células después de 48 h y el nivel de Egr-1 mRNA se analizó usando el tiempo real de RT-PCR (n = 3). (B) la translocación nuclear de la proteína Egr-1 después de la estimulación con EVs SW480 derivados (1 g /ml) durante 1 h se analizó en siRNA revueltos (50 nM) o Egr-1 siRNA-1 (50 nM) transfectadas HMEC-1 (n = 3). (C, D) confluentes HMEC-1 transfectadas con siRNA revueltos (50 nM) o Egr-1 siRNA-1 (50 nM) se rascaron y se trataron con EVs SW480 derivados (1 g /ml); a continuación, se evaluó el número de células migradas en la zona desnuda después de 12 h (n = 3). El número de células migradas en la zona despojada de cada grupo se muestra en el panel D. Escala barras representan 100 micras. Los datos se representan como media ± DE. *
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/2 y JNK vías de señalización ERK1 están involucrados en EV-inducida Egr-1 de activación y migración de células endoteliales
A continuación se investigó las vías de señalización implicadas en EV mediada por la activación de Egr-1. ERK1 /2 inhibidor (PD98059) y el inhibidor de JNK (SP600125) casi completamente suprimido Egr-1 translocación nuclear en las células endoteliales después de la estimulación con EVs SW480-derivado, pero inhibidor p38 MAPK (SB203580) y el inhibidor de Akt (BML-257) no tuvieron ningún efecto (Fig. 4A y 4B). Por otra parte, se observó que los tratamientos PD98059 y SP600125 casi bloquean completamente la migración de células endoteliales inducida por EV mientras que estos inhibidores no mostraron ningún efecto aparente sobre la migración basal de las células endoteliales (Fig. 4C y 4D). Por otra parte, PD98059 o SP600125 inhibe casi por completo las actividades de
in vivo
angiogénicos de los vehículos eléctricos SW480 derivados (Fig. 4E y 4F). Todas estas observaciones indican que los /2 y JNK vías de señalización ERK1 son esenciales para la activación de Egr-1, la migración de células endoteliales, y
in vivo de la angiogénesis.
(A, B) HMEC-1 fueron pretratados con inhibidores de la señalización por 1 h y luego se estimularon durante 1 h con EVs SW480-derivado (1 mg /ml). translocación nuclear de la proteína Egr-1 se analizó mediante microscopía confocal (n = 3). Los núcleos y Egr-1 proteínas se tiñeron con Hoechst (azul) y anti-Egr-1 anticuerpo (rojo), respectivamente. señales de fluorescencia co-localizados (púrpura) indican la translocación de Egr-1 en el núcleo. fotografías representativos se muestran en el panel A. El porcentaje de núcleos Egr-1-positivas se determinó midiendo el número de células con núcleo señales colocalized más de las células totales (B). (C, D) confluentes HMEC-1 se rascaron y se trataron con EVs SW480-derivado (1 mg /ml) en presencia o ausencia de inhibidores de señalización; a continuación, se evaluó el número de células migradas en la zona desnuda después de 12 h (n = 3). fotografías representativas de imágenes microscópicas confocal se muestran en el panel C y el número de células migradas en la zona desnuda de cada grupo se muestran en el panel inhibidor D. ERK1 /2, PD98059 (20 mM); p38 inhibidor de MAPK, SB203580 (10 mM); inhibidor de JNK, SP600125 (20 mM); inhibidor de AKT, BML-257 (20 M). (E, F) C57BL /6 ratones fueron inyectados por vía subcutánea con Matrigel que contiene EVs derivados de SW480 (20 g) con PD98059 (20 mM) o SP600125 (20 M). Después de 7 días, la tinción de Matrigel todo el montaje con el anticuerpo anti-CD31 se llevó a cabo (n = 5). fotografías Z-pila confocal representativas de los montajes enteros teñidos para CD31 (verde) se muestran en el panel E. intensidades de fluorescencia de CD31 en el plano Z-pila del Matrigel se midieron como se describe en los métodos (F). Las barras de escala en los paneles A, C, y E representan 30, 100, y 100 micras, respectivamente. Los datos se representan como media ± DE. ***
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inhibidor inhibe la endocitosis Egr-1 de activación y migración de células endoteliales inducida por los vehículos eléctricos SW480 derivados
Como posible participación de la endocitosis balsa lipídica en la captación EV [41], [42], se analizó el papel de las balsas de lípidos en la absorción por las células endoteliales EV. captación EV marcada con DiI se inhibió significativamente después del tratamiento con MβCD (10 mM) (Fig. 5A). migración de células endoteliales inducida por EV en zona desnuda fue completamente bloqueado por el tratamiento MβCD (Fig. 5B). Además, las células endoteliales tratadas con MβCD bloquearon completamente EV-inducida Egr-1 de activación (Fig. 5C y 5D).