Extracto
Antecedentes
La eficacia de la quimioterapia basada en cisplatino en células no pequeñas de cáncer de pulmón está limitada por la resistencia a los fármacos adquirida. Identificación de los ARN relacionadas con la resistencia a cisplatino pueden ayudar a mejorar las tasas de respuesta clínica.
Métodos
microarrays de expresión de perfiles de ARNm, y lncRNA miARN se llevó a cabo en las células A549 y A549 células resistentes a cisplatino /CDDP . ARNm expresados diferencialmente, lncRNAs y miRNAs, verificados por tiempo real RT-PCR, se sometieron a análisis de vía. Expresión de NKD2 y β-catenina fue evaluada por tiempo real RT-PCR y análisis de transferencia Western. El efecto de lncRNA AK126698 sobre la apoptosis inducida por cisplatino fue investigado por la anexina-V /PI citometría de flujo.
Resultados
En total, ARNm 1471, 1380 lncRNAs y 25 miRNAs expresados diferencialmente en A549 /CDDP y células A549. Entre ellos, se validaron los ARNm 8, 8 y 5 lncRNAs miRNAs expresados diferencialmente en el análisis de chips de genes. vía de análisis de alta enriquecimiento identificó que algunas vías clásica participaron en la proliferación, la diferenciación, la evitación de la apoptosis, y el metabolismo de fármacos se expresan de forma diferente en estas líneas de células. red de genes co-expresión identificado muchos genes como FN1, CTSB, EGFR, y NKD2; lncRNAs incluyendo BX648420, ENST00000366408, y AK126698; y miRNAs como miR-26a y let-7i potencialmente jugaron un papel clave en la resistencia al cisplatino. Entre las cuales, la vía Wnt canónica fue investigado por haberse demostrado ser el blanco de ambos lncRNAs y miRNAs incluyendo lncRNA AK126698. Derribo lncRNA AK126698 disminuyó en gran medida no sólo NKD2 que puede regular negativamente la señalización de Wnt /β-catenina, pero también incrementó la acumulación y translocación nuclear de β-catenina, y la tasa de apoptosis significativa depresión inducida por cisplatino en células A549.
Conclusión
resistencia a cisplatino en las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas puede estar relacionado con los cambios en los ARN no codificantes. Entre estos, AK126698 parece conferir resistencia al cisplatino apuntando a la vía Wnt
Visto:. Y Yang, Li H, Hou S, Hu B, Liu J, J Wang (2013) El perfil Noncoding ARN expresión y la efecto de lncRNA AK126698 sobre la resistencia a cisplatino en no microcítico de pulmón de células cancerosas. PLoS ONE 8 (5): e65309. doi: 10.1371 /journal.pone.0065309
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 7 Agosto, 2012; Aceptado: April 29, 2013; Publicado: 31 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (Nº 81071910, 81070042). lncRNA experimentos de microarrays se realizaron por Kangchen Bio-tech, Shanghai, China. MiRNA experimentos de microarrays se realizaron por Genminix Informática Ltd., Shanghai, China. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses. lncRNA experimentos de microarrays se realizaron por Kangchen Bio-tech, Shanghai, China. MiRNA experimentos de microarrays se realizaron por Genminix Informática Ltd., Shanghai, China. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El cáncer de pulmón es uno de los más comunes cánceres humanos en todo el mundo y continúa siendo asociados con las tasas más altas de incidencia y mortalidad de todos los cánceres [1], [2]. De acuerdo con el proyecto de la OMS GLOBOCAN, 1,6 millones de nuevos casos de cáncer de pulmón, que representan el 12,7% de la incidencia total de cáncer en el mundo, se diagnosticaron en 2008 [3]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 85% de todos los casos de cáncer de pulmón [4]. El tratamiento más eficaz para el NSCLC es resección pulmonar completa. Sin embargo, la tasa de supervivencia después de la resección pulmonar completa está lejos de ser satisfactoria y la mayoría de los pacientes se les ofrece quimioterapia como alternativa, en particular, cisplatino (CDDP; cis-diaminodicloroplatino II) basado en la quimioterapia
cisplatino principalmente por actos ADN causando. daños [5]. Sin embargo, la capacidad de las células cancerosas a volverse resistentes a CDDP sigue siendo un obstáculo importante para la quimioterapia con éxito. Estudios previos han propuesto una serie de posibles mecanismos de resistencia a cisplatino [6]. Sin embargo, hay una continua necesidad de identificar los mecanismos exactos involucrados con el fin de encontrar nuevas dianas para prevenir la resistencia a los medicamentos.
El rápido desarrollo de la biología molecular hace que sea posible detectar diferencias moleculares entre las diferentes células. Este enfoque puede proporcionar pistas importantes sobre la resistencia a los medicamentos. La comprensión de las relaciones entre la resistencia a cisplatino y cambios moleculares ayudará a predecir la resistencia a cisplatino por adelantado y para mejorar la eficacia de la intervención terapéutica
.
El transcriptoma humano comprende un gran número de los ARN mensajeros codificadores de proteínas (ARNm), junto con un gran conjunto de transcripciones de codificación no proteicos incluyendo larga ARNs no codificantes y microARN que tienen funciones estructurales, reguladoras o desconocidas [7], [8]. ARN no codificantes largas (lncRNAs) que se caracterizan por la complejidad y diversidad de sus secuencias y mecanismos de acción son distintos de los pequeños ARN o ARN estructurales y se cree que funcionar como transcritos primarios o empalmados [9]. niveles lncRNA alterados han demostrado que resulta en la expresión aberrante de productos génicos que pueden contribuir a diferentes estados de enfermedad, incluyendo el cáncer [10], [11]. Sin embargo, sigue siendo desconocida la contribución fisiopatológica general de lncRNAs a la resistencia a cisplatino
.
Los microARN (miRNA) son una familia de pequeños no codificantes, ARN endógeno, ~22nt, de cadena simple que regulan la expresión génica. miRNAs maduro y Argonauta (AGO) proteínas forman el ARN inducida por silenciar complejo (RISC), que media génico post-transcripcional silenciamiento través de la inducción de la degradación del ARNm o la inhibición de la traducción [12]. Algunos miRNAs se han encontrado juegos de rol importante en la resistencia a cisplatino [13], [14], pero se necesita más investigación para explorar las relaciones entre los miRNAs, lncRNAs y ARNm en el proceso de la biología del cáncer.
El Wnt /β catenina vía de señalización canónica fue considerado previamente como jugando un rol central en la determinación del destino celular [15]. La vía de Wnt ha encontrado ahora que ser alterado en muchos tipos de cáncer [16]. Después de la unión de Wnt a su receptor, proteínas Dishevelled (DSH /Dvl) se activan, lo que lleva a la inactivación de la axina /poliposis adenomatosa coli (APC) /glucógeno sintasa quinasa (GSK) complejo 3β que impide la degradación de β-catenina [ ,,,0],17]. Esto da como resultado estabilizado β-catenina ser translocado al núcleo donde se une a los miembros de la /factor de unión potenciador linfoide factor de células T (/LEF TCF) la familia de factores de transcripción, y es capaz de modular la expresión de una amplia gama de los genes objetivo de regular las células destinos.
vía Wnt-β-catenina [18] son controlados con precisión por una serie de reguladores. Entre ellos, la familia de la cutícula desnuda (NKD) incluye Drosophila cutícula desnuda y sus dos ortólogos vertebrados NKD1 y NKD2 se ha demostrado que regular negativamente la señalización de Wnt canónica mediante la unión a Dvl. Sin embargo, si la vía Wnt está implicada en la resistencia al cisplatino o su regulación es aún desconocido.
En este estudio, lncRNA, miARN ARNm y los perfiles de expresión se compararon en A549 y cisplatino líneas celulares de resistencia de tipo salvaje A549 /CDDP usando La tecnología genética Chip. Se utilizó un análisis integrador combinando cambios en los tres grupos de ARN dentro de las diferentes redes genéticas para identificar los genes y las vías que pueden estar relacionados con la resistencia a cisplatino en el CPNM. Los experimentos con lncRNA AK126698 caída se utilizaron para observar su impacto en los canónicos de la vía Wnt y de células respuestas a cisplatino.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Pulmón humano línea celular de adenocarcinoma y la línea celular A549 variante cisplatino-resistentes A549 /CDDP se compraron a la Peking Union Medical College, Beijing, china. Las células A549 y A549 /CDDP se mantuvieron en RPMI-1640 (Life Technologies) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Gibco, Gran Island, NY, EE.UU.) en una atmósfera húmeda que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C . El medio de células A549 /CDDP contenía adicionalmente 2 mg /L de cisplatino con el fin de mantener su fenotipo resistente a fármacos. Las células en la fase logarítmica de crecimiento se utilizaron para todos los experimentos.
lncRNA microarray
Brevemente, se usaron células A549 y A549 /CDDP para sintetizar ADN complementario de doble hebra (ADNc). ADNc de cadena doble se marcó y se hibridó a la 8 × 60 K lncRNA microarrays de expresión (Arraystar, Rockville, MD). El microarray expresión lncRNA utilizado en este estudio clasifica principalmente sus sondas como la siguiente subtipo: 1). LncRNAs Enhancer: Contiene datos de perfiles de todos los lncRNAs con potenciador similar a la función [19]. 2). lincRNAs Rinn: Contiene datos de perfiles de todos los lincRNAs basado en los papeles de John Rinn [20], [21]. 3). clúster HOX: Contiene datos de perfiles de todas las sondas en los loci de cuatro HOX, apuntando a 407 regiones transcritas discretos, lncRNAs y codificación de las transcripciones [22]. 4). LincRNAs cerca del gen de codificación: Contiene los lincRNAs expresados diferencialmente y pares de genes que codifican cercanos (distancia y lt; 300 kb). 5). Potenciador lncRNAs cerca del gen de codificación: Contiene los lncRNAs potenciador-como expresados diferencialmente y sus genes codificantes cercanos (distancia y lt; 300 kb). Después de la hibridación y el lavado, portaobjetos procesados fueron escaneadas con el escáner Agilent DNA microarrays (número de pieza G2505B). software de extracción de características de Agilent (versión 10.7.3.1) se utilizó para analizar las imágenes adquiridas de matriz. cuantil normalización y el posterior procesamiento de los datos se realizaron con el uso de la GeneSpring GX v11.5.1 paquete de software (Agilent Technologies). Cada línea celular realizó lncRNA microarrays por triplicado.
Mirna microarrays
microarrays de perfiles de miARN se realizó utilizando vectores Affymetrix GeneChip miARN (Santa Clara, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Brevemente, 1 g de ARN total a partir de las células se marcó mediante polyA de la polimerasa usando el kit Genisphere FlashTag HSR siguiendo las recomendaciones del fabricante (Genisphere, Hatfield, PA). ARN se hibridó a la matriz de Affymetrix miRNA según lo recomendado por el vendedor. Estándar Affymetrix casete de tinción, el lavado y la exploración se realizó utilizando el kit de post-hibridación (# 900720; Affymetrix) y el escáner GeneChip 3000. Extracción de características se realizó utilizando el software de la consola de comandos de Affymetrix. Los datos en bruto se procesaron en la secuencia siguiente: Detección de fondo fue seguido por RMA fondo global de correlación, cuantil normalización, la estimación de la mediana y el log2-transformación utilizando la herramienta de software miRNA QC (Affymetrix). Cada línea celular miARN microarrays realizó por triplicado.
in vitro la sensibilidad al fármaco de ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10
3 células /pocillo y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de cisplatino durante 48 h a 37 ° C. Después de la adición de 20 l de CellTiter 96R Una solución acuosa (Promega) a cada pocillo, las placas se incubaron durante 2,5 horas a 37 ° C. La absorbancia de cada pocillo a 490 nm (A490) se leyó usando un espectrofotómetro. La concentración a la que cada fármaco produce 50% de inhibición del crecimiento (IC50) se calculó a partir de curvas de supervivencia relativa. Tres experimentos independientes se realizaron en seis pocillos por duplicado.
en tiempo real RT-PCR
Real-time RT-PCR se utilizó para verificar la expresión diferencial de 16 genes que fueron detectados por la microarrays de expresión lncRNA. El ADNc se sintetizó usando la transcriptasa inversa (Takara), oligo (dT) cebadores con 1 mg de ARN de las mismas muestras como los utilizados en la micromatriz. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S1. Cada tiempo real RT-PCR (en 20 l) contenía 2,5 × SYBR verde en tiempo real PCR Master Mix (Tiangen), 0,5 M cebadores y 0,5 l de cDNA plantilla. Las condiciones de los ciclos consistieron en una, solo ciclo inicial de 2 min a 94 ° C, seguido de 40 ciclos de 15 s a 94ºC, 20 s a 63 ° C, y 30 s a 68 ° C. Las amplificaciones por PCR se realizaron en tres duplicados para cada muestra. los niveles de expresión de genes se cuantificaron en relación con la expresión de 18S usando un método de valor optimizado comparativo Ct (ΔΔCt). Las diferencias en los niveles de expresión génica entre los grupos se compararon mediante la prueba t de Student. & lt; P-valores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
QRT-PCR de los genes miARN
Establece bombeo de circuito ™ miARN QRT-PCR Primer (un cebador RT y un par de cebadores para cada qPCR. set) específico para el miR-17, miR-21, miR-138, miR-194 y miR-let-7i fueron diseñados por RiboBio (Guangzhou, china). Brevemente, el ARN total se extrajo utilizando un kit de MiRNeasy Mini (QIAGEN). El bulto de bucle miARN se transcribe de forma inversa con el Kit Quantscript RT (Tiangen). Cada tiempo real RT-PCR (en 25 l) contenía 2 x superreal premezcla (Tiangen), 10 mM cebadores, y 1 l de cDNA plantilla. Las condiciones de los ciclos consistieron en una, solo ciclo inicial de 3 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 10 s a 95ºC, 20 s a 60 ° C y 30 s a 70 ° C. Las amplificaciones por PCR se realizaron en tres duplicados para cada muestra. La cantidad relativa de miRNAs se normalizó en contra U6 snRNA, y el factor de cambio para cada miARN se calculó por la 2
-ΔΔCt método. & lt; P-valores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
pequeños ARN de interferencia (siRNA)
Para estimar la inhibición de la AK126698, 50 nM de AK126698 siRNA (Shanghai Genepharma, China) se transfectaron en células A549. células utilizando Lipofectamine reactivo 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas con el agente de transfección y siRNA-control de mezcla aleatoria (control negativo) se utilizaron como controles. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección. Cuatro pares de siRNA fueron nombrados siRNA AK126698-291, siRNA AK126698-341, siRNA AK126698-424 y siRNA AK126698-1492, respectivamente. En comparación con el control, solamente siRNA siRNA AK126698-291 y AK126698-424 disminuyen con éxito el nivel de expresión de lncRNA AK126698. Las secuencias de siRNA y AK126698 siRNA control de mezcla aleatoria se enumeran en la Tabla S2.
Western blot análisis
Las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos (2 x 10
5 células /pocillo ). 48 horas después de la transfección de ARNsi AK126698 o un control negativo, las células se recogieron y se homogeneizaron con tampón de lisis. La proteína total se separó mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida-SDS 10%. La detección se realizó con el sistema de Odyssey (gen Company Limited, EE.UU.). Los anticuerpos primarios para β-catenina, fosfo-β-catenina (Ser675) y β-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Cell Signaling Technology y Sigma-Aldrich, respectivamente. Los anticuerpos primarios para la vía del ciclo celular fosfo-cdc2 (Tyr15), fosfo-Rb (ser807), fosfo-Chk2 (Thr68) y fosfo-p53 (Ser15) y para la vía de señalización MAPK fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) y fosfo-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) fueron adquiridos de tecnología de señalización de la célula. diluciones de anticuerpos fueron 1:2000 de β-catenina, 1:1000 de fosfo-β-catenina, 1:1000 de fosfo-Rb (ser807), 1:1000 de fosfo-Chk2 (Thr68), 1:1000 de fosfo-cdc2 (Tyr15), 1:200 de fosfo-p53 (Ser15), 1:200 de fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), 1:200 de fosfo-p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) y 1:5000 para β-actina. Los niveles de proteína se normalizaron a ß-actina y se determinaron los cambios.
Citometría de Flujo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (2 x 10
5 células /pocillo). 24 horas después de la transfección de ARNsi AK126698 como se ha descrito anteriormente, las células A549 se trataron con CDDP en una concentración final de 10 mg /L. 24 horas después del tratamiento de CDDP, la citometría de flujo se utilizó para detectar la apoptosis de las células A549 transfectadas mediante la determinación de la cantidad relativa de células con anexina V-FITC-positivo-PI-negativas.
Análisis de Datos
Cada experimento se repitió al menos tres veces. Los datos numéricos se presentan como medias y los errores estándar (± SEM). Las diferencias entre las medias se analizaron utilizando la prueba t de Student. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS11.0 (Chicago, IL).
Análisis diferencial de genes importantes.
El modelo de variación aleatoria (RVM) se utilizó la prueba t para identificar los genes expresados diferencialmente para el grupo control y el experimento. Este modelo tiene más poder que las pruebas estándar para recoger grandes cambios en la expresión, sin aumentar la tasa de falsos positivos [23]. Tras el análisis significativo y análisis de la tasa de falso descubrimiento (FDR), se seleccionaron los genes expresados diferencialmente en función de umbrales P-valor predefinidos (& lt; 0,05) [23], [24], [25]. Los resultados de los genes expresados diferencialmente fueron sometidos a la agrupación sin supervisión jerárquica (Cluster 3.0) y el análisis de TreeView (Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE.UU.).
objetivos de microARN predicción.
Metas ARNm de miRNAs se predijeron basado en TargetScan (http://www.targetscan.org/) versión 5.2. TargetScan predice dianas biológicas de miRNAs mediante la búsqueda de la presencia de sitios 8MER y 7mer conservadas que responden a la región de semillas de cada miARN [26]. También identificaron son los sitios con los desajustes en la región de semillas que son compensados por "sincronización conservada 3 [27]. En los mamíferos, las predicciones se clasifican en base a la eficacia prevista de la orientación como se calcula utilizando el contexto + puntuaciones de los sitios alineaciones [28], [29]. TargetScanHuman considera partidos para anotar UTRs humanos y sus ortólogos, según la definición de la UCSC alineaciones de todo el genoma. La orientación conservada también se ha detectado dentro de los marcos de lectura abiertos (ORF).
Pathway análisis.
Se utilizó Pathway análisis para identificar las vías importantes para los genes diferenciales según la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas , bases de datos y BioCarta Reatome. También se utilizó la prueba exacta de chi-cuadrado y de Fisher para seleccionar las vías significativas. El umbral de significación se define por P-valor y FDR. El Re enriquecimiento fue dada por: (R
e = ENRIQUECIMIENTO), donde es el número de genes diferenciales dentro de la categoría en particular, es el número total de genes dentro de la misma categoría, es el número de genes diferenciales en todo el microarray , y es el número total de genes en el microarray [30], [31], [32].
GeneRelNet (coexpression red).
se utilizaron redes de co-expresión génica para identificar las interacciones génicas [33]. redes de genes coexpression se construyeron de acuerdo a la intensidad de la señal normalizada de expresión de genes específicos. Para cada par de genes, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y elegir pares de correlación significativos para la construcción de la red [34].
Dentro del análisis de redes, el grado de centralidad gen se define como el número de enlaces de un nodo a otro, se utilizó para determinar su importancia relativa [35]. K-núcleos se utilizaron para el análisis de la topología del gráfico. La k-núcleo de una red fue una subred en la que todos los nodos se conectan a al menos 'K' otros genes en la subred. Dentro de una interacción proteína-proteína, redes k-núcleo por lo general contienen grupos cohesivos de proteínas [35], [36]
Resultados
Microarray de A549 y A549 líneas celulares. CDDP /
en primer lugar, el cisplatino resistencia de la línea celular /CDDP A549 fue identificado mediante la evaluación de la IC50 valor de A549 /CDDP contra la línea celular A549 salvaje. Como se muestra en la Figura 1A, la IC50 de cisplatino para la línea celular /CDDP A549 resistente a los medicamentos fue 17,06 ± 0,68 mg /L, que era 3,9 veces mayor que la de la línea celular A549 de tipo salvaje (4,36 ± 0,78 mg /l). Este resultado demuestra que las células /CDDP A549 eran más resistentes a cisplatino que las células de tipo salvaje.
Las células se trataron con concentraciones crecientes de cisplatino (0,5 mg /L a 128 mg /L). 48 horas más tarde, la viabilidad celular se midió por MTS (A). mapas de calor muestran lncRNA (B) de ARNm (C) y miRNAs (D) perfiles, que diferencian A549 /A549 de CDDP. Cada muestra se ensayó por triplicado. Tanto las reguladas (verde) y hasta reguladas (rojo) ARNs fueron identificados en el A549.
A continuación, un estudio de chips de genes se llevó a cabo en estas dos líneas celulares para investigar los posibles cambios en la expresión de ARN en cisplatino resistencia en células de adenocarcinoma de pulmón utilizando el conjunto de datos de la sonda Arraystar que incluía 33.045 y 30.215 lncRNAs transcripciones de codificación. La agrupación jerárquica mostró variaciones sistemáticas en la expresión de lncRNAs y los ARN codificantes de proteínas entre las dos líneas celulares (Figura 1B y 1C). En comparación con la línea celular A549, 725 sondas de lncRNAs aumentaron y disminuyeron 655 sondas en la línea celular A549 /CDDP. Además, 625 sondas diferenciales ARNm aumentos y disminuciones de la sonda 846 de mRNA se encontraron en la línea celular A549 /CDDP.
Para investigar si la expresión de microARN se modificó en las células resistentes a cisplatino, los perfiles de expresión de genes miARN se evaluaron utilizando el Affymetrix chips de genes miARN que contenía 1.105 pre-miRNAs y 1.105 sondas-miRNAs maduros. Para un análisis más detallado nos centramos en madura-miRNAs. Los resultados mostraron que en las células A549 /CDDP, 16 miRNAs downregulated y 9 miRNAs upregulated en comparación con la línea celular A549 (P & lt; 0,05; Figura 1D). Los microarrays de datos analizados en este artículo han sido depositadas en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) y son accesibles a través de número de acceso (GEO) Serie GSE43494 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE43494).
la validación de los datos de microarrays utilizando qPCR
para validar los resultados de análisis de microarrays, el nivel de expresión de ARNm 8 que se cree que desempeñar un papel importante en la resistencia a los medicamentos y 8 lncRNAs que tenían correlaciones con mRNAs antecedentes entre los ARN de expresión diferencial, se analizaron mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Para lncRNA, los resultados mostraron que AK123263, CES1P1-001, RP3-508I15.14, AK126698, TP53TG1, y AC090952.4.1 disminuyó, mientras que uc003bgl.1 y NCRNA00210 aumentaron en A549 /CDDP (todos P & lt; 0,05; Figura 2A) . Para ARNm, la expresión de BMP4, CTSB, NKD2, BAG1, TGFB1, EGFR, Jun y CUL2 mostraron diferencias estadísticamente significativas entre las dos líneas celulares (P & lt; 0,05; Figura 2B). Todos los resultados QRT-PCR anterior fueron consistentes con la micromatriz. Estos resultados indican que un conjunto de lncRNAs y mRNAs se expresan de manera aberrante en líneas celulares de resistencia a cisplatino.
La cantidad relativa de cada ARNm (A) y lncRNA (B) se normalizó a 18S rRNA, y cada uno de los genes miARN (C ) se normalizó a U6 snRNA. Los datos de los histogramas son medias ± SD, * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 en comparación con el A549 (prueba t) guía empresas
5 miRNAs entre los filtrada se validaron a. ser significativamente diferente entre la línea celular resistente al cisplatino A549 /CDDP y la línea celular A549 parental (P & lt; 0,05). Como se muestra en la (Figura 2C), los niveles de miR-17, miR-21 y miR-let-7i se redujeron regulado en el A549 en vez de A549 /CDDP, mientras que el miR-138 y miR-194 fue la expresión arriba regulado. Esta conclusión está de acuerdo con los resultados de la hibridación de microarrays.
Microarray basado en análisis de vías
vías significativas de diferencial de los genes se compararon con la base de datos KEGG para especificar más allá e identificar ARNm diana entre los 1.471 genes identificados. Estos genes se muestran en la Figura 3A y 3B. Las vías de alto enriquecimiento dirigidas por los ARNm sobreexpresados estaban implicados en la biosíntesis de aminoacil-ARNt, la replicación del ADN y la transformación de proteínas en el retículo endoplásmico. En contraste, las vías significativas correspondientes a los ARNm underexpressed parecían ser responsables del metabolismo de drogas, procesamiento de antígenos y la interacción del receptor de presentación y citoquinas citoquinas. Entre estos, los máximos--vías enriquecidos relacionadas con la proliferación y el metabolismo del fármaco sugirieron un papel en la resistencia a cisplatino.
vías de señalización de los ARNm expresados diferencialmente upregulated (A) y mRNAs downregulated (B). El análisis de transferencia Western de la vía MAPK (C) y la vía del ciclo celular (D) los niveles en las células A549 y células /CDDP A549. P-p44 /42 MAPK, fósforo-p44 /42 MAPK; P-SAPK /JNK, fósforo SAPK /JNK; P-cdc2, fósforo-cdc2; P-Rb, Rb-fósforo; P-Chk2, fósforo Chk2; P-p53, fósforo-p53. Vías de señalización en la intersección entre el ARNm expresados de manera diferente y predijo genes diana de ARNm expresado de forma diferente upregulated (E) y ARNm downregulated (F). Pathway análisis se basa predominantemente en la base de datos KEGG. Los valores de p & lt; 0,05 mediante la prueba exacta de Fisher de dos caras se clasificaron como estadísticamente significativo. El eje vertical representa la categoría de vía y el eje horizontal representa el (valor p) -log10 de estas vías importantes.
ciclo celular y la vía de señalización MAPK se eligieron para verificar la exactitud de los resultados del análisis vía . En comparación con las células A549, los factores clave en el ciclo celular de fosfo-cdc2 (Tyr15) y fosfo-Rb (ser807 /811) aumento en el nivel de proteína en A549 /CDDP células representan la regulación positiva de la vía del ciclo celular. La disminución del regulador negativo cdc2 fosfo-Chk2 (Thr68) y fosfo-p53 (Ser15) refuerza este resultado. Además, la fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) y fosfo-p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204), que son los principales factores de la vía de señalización MAPK, disminución en la línea celular A549 /CDDP. Y estos resultados enumeran en la Figura 3C y 3D.
Los ARNm diana para miRNAs expresados diferencialmente se prevé utilizar TargetScan (http://www.targetscan.org/) y se observaron 7.814 relaciones entre ellos (Tabla S3) . Se seleccionó el conjunto de intersección de los ARNm objetivo previsto y mRNAs expresados diferencialmente mencionados anteriormente. 497 relaciones dejaron después de este paso, como se muestra en la Tabla S4. vías importantes para estos genes (P & lt; 0,05) se cree que están regulados por miRNAs de acuerdo a la base de datos KEGG fueron analizados (Figura 3E y 3F). Las vías importantes incluyen la vía de señalización de Wnt, desregulación transcripcional en el cáncer y, vías de señalización de insulina.
Hemos examinado a cabo 21 ARNm expresados diferencialmente en células de la resistencia cisplatino (Tabla S5) que se correlacionaron negativamente y posiblemente regulados por miRNAs. Estos ARNm estaban involucrados en 11 de las vías que se cree que desempeñan papel importante en la resistencia a cisplatino.
Establecimiento de genes co-expresión de red
coeficientes de correlación de Pearson se calculó para cada gen y significativa pares de correlación se fusionaron con miRNAs para investigar lncRNA, miARN ARNm y co-expresión. Se realizó un análisis de red para investigar qué gen o genes juega un papel fundamental en la resistencia a cisplatino (Figura 4). redes de genes se construyeron a partir asociaciones funcionales de genes, y se describen en detalle en la Tabla S6. ARNm que interactúan con las dos lncRNAs y miRNAs se destacan por el color amarillo. En los diagramas de red, los nodos representan los genes del ciclo, y los bordes entre dos nodos representan las interacciones entre los genes cuantificados por grado. Grados dentro de la red describen el número de genes individuales que regulan otros genes y representan el tamaño del nodo de ciclo. Cuanto más alto sea el grado, más central del gen está dentro de la red. Los bordes entre dos nodos estaban conectados por diferentes mecanismos. LncRNA-mRNA fue predicho por el análisis de correlación para perder la explicación efectiva en la actualidad. miARN-mRNA fue predicho por TargetScan que es el método más utilizado para la predicción de alto rendimiento destinos de datos de microARN. mRNA-mRNA se determinó sobre la base de KEGG para muchas relaciones de ARNm se habían recogido aquí. LncRNA-lncRNA y miRNA-miARN no se mostraron por que no tienen sentido. LncRNA-miARN no se puede calcular limitado por la base de datos y la técnica.
lncRNA-miARN-mRNA de la red de A549 (A) y A549 /CDDP (B). El azul representa la regulación a la baja y el naranja representa hasta la regulación. los nodos de la caja representan microARN, los nodos representan ARNm círculo, y los nodos representan hexagonales lncRNA. bordes negros describen la posible relación entre lncRNA y el ARNm, bordes verdes describen el efecto inhibidor de microARN en ARNm, y los bordes rojos representan la relación entre el ARNm y el ARNm.
coeficientes de la agrupación fueron utilizados para estimar la complejidad de las interacciones entre los genes vecinos al gen de núcleo, con la excepción de la participación gen núcleo. Cuanto menor sea el coeficiente de agrupamiento, el más independiente de los genes centrales estaban en términos de las interacciones entre los genes en los núcleos vecinos [35]. Los resultados indicaron que muchos genes como FN1, CTSB, EGFR, y TGFB1; lncRNAs incluyendo BX648420, ENST00000366408, ENST00000404247 y; y miRNAs como miR-26a y let-7i potencialmente jugaron un papel clave en la red. En la subred, muchos mRNAs aisladas se asociaron a la vía de señalización Wnt. Fueron candidatos para que puedan tener un papel importante en la resistencia a cisplatino regulada por lncRNAs
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La red de los resultados del análisis sugieren que los ARNm se pueden co-regulados por diferentes lncRNAs junto con diferentes miRNAs. Por ejemplo, BAG1 puede ser regulada por 3 miRNAs y 3 lncRNAs al mismo tiempo. Este fenómeno puede explicar por qué algunos mRNAs predijo miRNAs como potenciales objetivos no cambiaron con la dirección opuesta de sus correspondientes miRNAs.
Konckdown de AK126698 activa canónica vía de señalización Wnt y la resistencia inducida por cisplatino en la línea celular A549
La vía anterior análisis ha mostrado que vía de señalización Wnt y muchos miembros aislados de que listan en la red aislada relativa fueron alterados significativamente en la línea celular A549 /CDDP. Estos resultados nos sugieren que la vía de señalización Wnt estaba involucrado en el CPNM quimio-resistencia. Más allá de eso, el nivel de AK126698 estaba estrechamente correlacionado con muchos miembros de la vía Wnt (como se muestra en la Tabla S7). Por lo tanto, se exploró el papel de lncRNA AK126698 en la regulación de la vía de señalización Wnt. La transfección del ARNsi AK126698-424 y siRNA AK126698-291 en células A549 dio como resultado la disminución de la expresión NKD2 mRNA que es un regulador negativo de la vía de señalización Wnt (Figura. 5 A). Mientras tanto, el factor de transcripción clave en la vía canónica de Wnt β-catenina también se incrementó en el nivel de proteína después de la caída AK126698. El nivel de proteína de fosfo-β-catenina (Ser675), que representa la translocación β-catenina, aumentó después del tratamiento de siRNA AK126698. Estos hallazgos sugieren que el siRNA AK126698 activa canónica vía de señalización /β-catenina (Figura 5B). Al mismo tiempo, el efecto de AK126698-424 desmontables y siRNA AK126698-291 en la apoptosis de las células A549 se observó mediante el uso de ensayo /PI anexina-V.