Extracto
Fondo
Metástasis asociado en el adenocarcinoma de pulmón transcripción-1 (MALAT-1) se sobreexpresa durante la progresión del cáncer y promueve la migración celular y la invasión en muchos tumores sólidos. Sin embargo, su papel en el cáncer de ovario sigue siendo poco conocida.
Métodos
Las expresiones de MALAT-1 se detectaron en 37 tejidos ováricos normales y 45 tejidos de cáncer de ovario por RT-PCR (RT PCR). La proliferación celular se observó por CCK-8 de ensayo; La citometría de flujo se utilizó para medir el ciclo celular y la apoptosis; La migración celular se detectó por la migración transwell y ensayo de invasión. Con el fin de evaluar la función de MALAT-1, combinado con shRNA de microarrays de ADN y el análisis funcional de enriquecimiento se realizaron para determinar los efectos transcripcionales de MALAT-1 silenciamiento en células OVCAR3. ARN y proteínas expresión se midieron mediante QRT-PCR y Western Blot, respectivamente.
Resultados
Se encontró que la regulación positiva de MALAT 1-mRNA en tejidos de cáncer de ovario y mejorado MALAT-1 de expresión se asoció con el estadio de la FIGO. Desmontables de MALAT-1 en las células OVCAR3 inhibió la proliferación celular, la migración y la invasión, lo que lleva a la detención del ciclo celular G0 /G1 y la apoptosis. Sobreexpresa MALAT-1 en las células SKOV3 promovió la proliferación celular, la migración y la invasión. Regulación a la baja de MALAT-1 resultó en un cambio significativo de la expresión génica (por lo menos 2 veces) en 449 genes, que regulan la proliferación, ciclo celular, y la adhesión. Como consecuencia de MALAT-1 desmontables, MMP13 expresión de la proteína disminuyó, mientras que se incrementó la expresión de MMP19 y ADAMTS1.
Conclusiones
El presente estudio encontró que MALAT-1 es altamente expresado en el ovario tumores. MALAT-1 promueve el crecimiento y la migración de las células de cáncer de ovario, lo que sugiere que MALAT-1 puede ser un importante contribuyente al desarrollo del cáncer de ovario
Visto:. Zhou Y, Xu X, Lv H, Q Wen, Li J , Tan L, et al. (2016) The Long ARN Noncoding MALAT-1 es altamente expresado en el cáncer de ovario y el crecimiento celular y la migración Induce. PLoS ONE 11 (5): e0155250. doi: 10.1371 /journal.pone.0155250
Editor: Zhiqian Zhang, la Universidad de Pekín Hospital del Cáncer & amp; Instituto, CHINA
Recibido: 4 Enero de 2016; Aceptado: 26 Abril de 2016; Publicado: 26 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Agencia de Ciencia y Tecnología de la Información de Guangzhou (núm 2010GNE00221) y el estudio del Mecanismo MALAT1 promover la invasión y la metástasis de El cáncer de ovario por Targeted Regulación de STAT3 vía de señalización (núm 2014A020212517)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de ovario
epitelial ( EOC) es la neoplasia ginecológica más mortal, lo que representa la muerte significativa cáncer cada año [1]. y [2]. Debido a los síntomas no específicos en la etapa temprana de la enfermedad y la falta de técnicas de detección eficaces en la clínica, la mayoría (hasta el 75%) de los pacientes se diagnostican en estadios avanzados, cuando la enfermedad ya se ha extendido más allá de la pelvis, lo que resulta en un mal pronóstico [3,4]. A pesar de los esfuerzos continuos para mejorar el diagnóstico y el tratamiento EOC, recidiva tumoral y la metástasis siguen siendo los principales obstáculos para el éxito del tratamiento de los pacientes con EOC [5]. Por lo tanto, se necesita urgentemente investigación sobre la detección temprana del cáncer de ovario y la mejora de las estrategias actuales de tratamiento.
Es un hecho ampliamente aceptado que el desarrollo del cáncer es el resultado de la expresión de genes alterados y /o cambios estructurales de los genes codificantes de proteínas. Sin embargo, los datos de secuenciación de todo el genoma revelaron que miles de genes carecen de la capacidad de codificación de proteína, mientras que juega papeles importantes en la regulación del crecimiento celular, la supervivencia y apoptosis, y la tumorigénesis o otras enfermedades [6]. Nuestra investigación se centra en MALAT-1, identificado originalmente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, es una gran ARN no codificante que está estrechamente asociada con la metástasis del tumor y regula la expresión de diversos genes asociados a metástasis [7]. MALAT-1 está situado en 11q13.1 cromosoma, se extiende por una región genómica 8.7kb, y se expresa ampliamente en los tejidos normales, especialmente en el pulmón y el páncreas [8] ,. MALAT-1 se retiene específicamente en las motas nucleares [9] en donde los factores de corte y empalme de pre-ARNm se enriquecen y por lo tanto, puede funcionar como un conjunto, el almacenamiento y /o el compartimento de modificación [10]. MALAT-1 también se ha implicado en la progresión del tumor [11]. Los datos han indicado que MALAT-1 estuvo involucrado en el desarrollo del cáncer a través de la regulación del splicing alternativo de sus genes diana [12] o la expresión de genes [13,14]. MALAT-1 de expresión se ha encontrado para ser de hasta regulado en muchos tumores sólidos, tales como de pulmón [8], el hígado [15], y los cánceres de próstata [16] y tiene una función de promotor de tumores. En este estudio, se midió MALAT-1 los niveles de expresión en los tejidos tumorales de ovario y cáncer de ovarios normales primarias y se investigó el papel biológico de MALAT-1 en la patogénesis del cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
2.1 Tejido muestras
37 muestras epiteliales de ovario normal y 45 muestras de tejidos de cáncer de ovario se obtuvieron del Tercer hospital Afiliado de la Universidad médica de Guangzhou durante 2009-2013. Todos los casos de cáncer de ovario no recibieron tratamiento previo a la cirugía y se diagnosticaron histológicamente según el libro de la OMS de la patología ginecológica (Tabla 1). Estas muestras de tejido fueron-snap congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Este estudio fue aprobado por la revisión institucional de la Universidad de Medicina amplio de Guangzhou y un consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes antes de la participación de este estudio.
2.2 Línea celular y la cultura
línea celular de cáncer de ovario OVCAR3, SKOV3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de estreptomicina /penicilina a 37 ° C en 5% de CO
2. Se recogieron las células en fase logarítmica de crecimiento para todos los experimentos descritos a continuación.
Aislamiento
2,3 ARN y QRT-PCR
ARN celular total fue aislado de los tejidos y la línea celular utilizando el reactivo Trizol (Takara Bio, Inc., Shiga, Japón) y luego en sentido inverso transcrito en cDNA utilizando PrimeScript RT master Mix (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. qPCR se realizó para determinar la expresión de MALAT-1, MMP-13, MMP-19, ADAMTS1, y mRNA β-actina utilizando un kit SYBR GREEN MIX de Promega (Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 2. Los niveles de ARNm de beta-actina se utilizaron como una inferencia interna.
2.4 Diseño y construcción de MALAT-1vectors y transfección génica
Para evaluar el papel de MALAT-1 en el cáncer de ovario, derribaron MALAT-1 de expresión usando shRNAs y sobreexpresa MALAT-1 de expresión usando pcDNA3.1 (+) - MALAT-1 (a-MALAT-1). Hemos diseñado y construido cuatro conjuntos de oligonucleótidos MALAT-1 shRNA (shM1-M4) y los clonaron en el pGPU6 /GFP /Neo vectorial (Jima, Shanghai, China). Las secuencias se MALAT-1-shM1, 5'-GCCGAAATAAATGAGAGAT GA-3 '; shM2, 5'-GG CAGCTGTTAACAGATAAGT-3 '; shM3, 5'-GCTGTGGAGTTCTTA AATATC-3 '; shM4, 5'-GGGCTTCAGTGATGGGATAGT-3 '. El /GFP vector pGPU6 /Neo que contiene una secuencia de ADN al azar fue utilizado como un control de mezcla aleatoria (SHNC). Después de la clonación, amplificación y secuenciación de ADN, transfectadas estos vectores en células OVCAR3. En resumen, las células fueron sembradas en una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche cuando se alcanza el 70-80% de confluencia. OVCAR3 fueron transfectadas con shM1, shM2, shM3, shM4, o SHNC usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. SKOV3 fueron transfectadas con pcDNA3.1 (+) - MALAT-1 y pcDNA3.1 (SKOV3-NC). Las células se examinaron 48 h después de la transfección con un microscopio de fluorescencia invertida para evaluar la eficiencia de la transfección. Las células se recogieron a continuación y se sometieron a análisis de QRT-PCR de MALAT-1 de expresión. Debido MALAT-1 shM3 fue más eficaz en la consecución de desmontables de MALAT-1 de expresión, todos los experimentos posteriores se realizaron utilizando este shRNA.
2.5 ensayo de proliferación celular
Para evaluar los efectos de MALAT-1 en células de cáncer de ovario, que primero las células sembradas en placas de 96 pocillos con 5 x 10
3cells /pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células fueron transfectadas con MALAT-1-shM3, SHNC, aMALAT-1 y SKOV3-NC. La proliferación celular se midió usando el ensayo de CCK-8 (Biyuntian, Shanghai, China) en incrementos 24h para hasta 96 horas. En resumen, se añadió 10 l solución de CCK-8 en cada pocillo de cultivo de células y las placas se incubaron adicionalmente durante otra 2,5 h. Después, la densidad óptica se midió mediante análisis FACS en la absorbancia de 450 nm. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces de forma independiente.
2,6 Transwell migración de células tumorales y la invasión de ensayo
Las cámaras Transwell con 8 micras poros se obtuvieron de Corning (Corning, NY, EE.UU. ). Se recogieron las células transfectadas, se resuspenden en DMEM sin FBS a una concentración de 1 x 10
6 células en 100 l, y luego se sembraron en las cámaras superiores de la placa de 24 pocillos. Las cámaras inferiores se llenaron con 600 l DMEM que contiene 10% de SFB. Las células se incubaron entonces durante 24 h. Al final del experimento, las células que migraron en el reverso de la membrana Transwell se fijaron con metanol, se tiñeron con violeta de cristal, y luego contados bajo un microscopio de luz con un aumento de x100. Se examinó un promedio de cinco campos visuales. Para el ensayo de invasión de células tumorales, la membrana Transwell fue pre-recubierto con 30 l de Matrigel (1: 3 mezclado con PBS; BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y procedió de la misma como se describió anteriormente
2,7 Cell. ciclo y apoptosis citometría de flujo ensayo
Las células se recogieron y se resuspendieron a una densidad de 5 a 10 x 10
6 células /ml y después se fija con 75% de etanol enfriado con hielo y se tiñeron con 400 l de yoduro de propidio solución (PI) (BestBio, Shanghai, china) durante 30 min y después se sometieron a análisis del ciclo con un citómetro de flujo (BD). Para el análisis de apoptosis, las células se tiñeron con 5 l de anexina V-FITC (BD Biosciences) durante 15 min y 5 l PI para otro 5 min antes de que se sometieron a análisis de citometría de flujo.
2.8 Perfiles de diferencial de genes expresión después MALAT-1 desmontables en las células de cáncer de ovario
el ARN total se extrajo con el reactivo de TRIZOL y cuantificar por el NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). La integridad del ARN se evaluó mediante Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). bibliotecas de ADNc se construyeron a partir de muestras con un número de integridad del ARN (RIN) ≥7.0. ARN totales se transcribieron a ADNc de doble cadena y luego ARNc sintetizado. A continuación, ADNc de 2ª ciclo se sintetizaron a partir ARNc. seguido de fragmentación y marcaje con biotina, los ADNc 2º ciclo se hibridó en el microarray. Después del lavado y la tinción, los arreglos fueron digitalizadas por el escáner Affymetrix 3000 (Affymetrix)
2.9 Análisis de la expresión génica
software Genespring (versión 12.5; Agilent Technologies). Se utiliza para completar la expresión génica análisis. los genes expresados diferencialmente (DEG) se identificaron utilizando factor de cambio, así como los cálculos del valor P. El umbral para la selección de genes expresados diferencialmente fue un factor de cambio & gt; 2.0 y un valor de P & lt; 0.05. KEGG y GO análisis se realizaron para determinar las vías y GO términos asociados con los ARNm expresados diferencialmente. La agrupación jerárquica (HCL) se realizó para mostrar el patrón de expresión del gen distinguibles 'entre las muestras.
2.10 Análisis de la expresión del ARNm de DEGs por QRT-PCR
Para verificar los resultados de microarrays, doce expresa de forma diferente genes fueron seleccionados para la validación de QRT-PCR utilizando un kit SYBR GREEN MIX (Promega, EE.UU.) y un sistema 7500 de PCR en tiempo real RÁPIDO siguiendo las instrucciones del fabricante, usingβ-actina como control interno. la cuantificación comparativa se determinó por el método de cálculo 2-ΔΔCt. Genes candidatos de genes andβ-actina se amplificaron en la misma reacción y realizaron por triplicado. secuencias de los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 2.
2.11 extracción de proteínas y Western blot
proteína celular total fue extraído a partir de células transfectadas y concentración de proteínas se determinó utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Beyotime, Pekín , China). Estas muestras de proteína se resolvieron en 10% SDS en gel de poliacrilamida desnaturalizado y se transfirieron a membranas de PVDF con un tamaño de poro de 0,45 micras (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Después de bloquear en 5% de leche desnatada en Tris-base de solución salina-Tween 20 (TBST) durante 60 min a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con el ratón /conejo anticuerpos anti-humanos a la dilución recomendada [ADAMTS1 y MMP19 a una dilución de 1: 1000, MMP13 a escala 1: 500 (todos de Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.)] durante la noche a 4 ° C. Después de lavados en TBST, las membranas se incubaron adicionalmente con un anti-ratón secundario (1: 2.500) o anti-conejo (1: 10.000) de anticuerpos durante 1 h. aumento de quimioluminiscencia se añadió una solución (ECL) sobre las membranas y la expresión de la proteína se cuantificó usando el Trabajo de Laboratorio Adquisición de imágenes y software de análisis (UVP, Upland, CA, EE.UU.). Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como control de carga.
2.12 estadístico El análisis
Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar. Las diferencias entre los dos grupos se evaluaron utilizando la prueba exacta de Fisher o
t de Student
, mientras que la diferencia entre los múltiples grupos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. los genes expresados diferencialmente después de la caída de MALAT-1 de expresión se evaluaron mediante el uso de microarrays de ADNc (Affymetrix HTA 2.0), identificado como cambios veces y se analizaron utilizando
t de Student
. p. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
3.1 Expresión diferencial de MALAT 1-ARNm en muestras de tejido de cáncer de ovario
MALAT-1 mRNA expresión en el control de ovario normal y tejidos de cáncer de ovario primario se evaluó mediante qRT-PCR y normalizado a un control interno (β-actina). Expresión de MALAT-1 en tejidos de cáncer de ovario es significativamente mayor que la de en el ovario normal (Fig 1). Por otra parte, MALAT-1 de expresión se asocia significativamente con el estadio de FIGO, pero no se identificó ninguna asociación entre MALAT-1 de expresión y la edad, tipo histológico, grado, o la presencia de ascitis (Tabla 1). Estos datos sugieren que el alto nivel de MALAT-1 de expresión se asocia con la progresión del cáncer de ovario.
MALAT-1 de expresión es significativamente mayor en los tejidos de cáncer de ovario. *
p Hotel & lt; 0.05.
3.2 MALAT-1 están asociados con la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer de ovario
A continuación, hemos construido cuatro shRNAs orientación MALAT-1. shRNA3 fue el más efectivo en el silenciamiento de MALAT-1 expresión en células OVCAR3 (Fig 2A). Por lo tanto, hemos utilizado este shRNA en todos los siguientes experimentos. MALAT-1 desmontables redujo significativamente la proliferación de células de cáncer de ovario comenzando el día 2 de alcanzar los niveles más altos durante el día 5 (Figura 3A). Además, MALAT-1 desmontables también suprimió significativamente la migración OVCAR3 y la capacidad de invasión (Fig 3C y 3E). SKOV3 fue altamente expresado por transfectadas por pcDNA3.1 (+) -. MALAT-1 y la regulación positiva de MALAT-1 inducida SKOV3 proliferación, la migración y la invasión (Fig 3B y 3D y 3F)
(A) QRT- PCR análisis de MALAT-1 y la expresión siguiente shRNA desmontables. células OVCAR3 se cultivaron y transfectaron con cuatro MALAT-1 vectores diferentes shRNA (shM1 a shM4) y después se sometió a análisis de QRT-PCR. *
p Hotel & lt; . 0,05 frente a los grupos de control (células B) SKOV3 fueron cultivadas y transfectadas con pcDNA3.1 (+) - MALAT-1 y pcDNA3.1 (NC) y se sometió a análisis de QRT-PCR, *
p
& lt; 0,05 frente a los grupos de control.
(A) y (B) La proliferación celular CCK-8 ensayo. células de cáncer de ovario fueron cultivadas y transfectadas y después se sometieron a CCK-8 ensayo. *
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con grupos de control. (C) y el ensayo de migración de células (D) Transwell tumor. células de cáncer de ovario fueron cultivadas y transfectadas y después se sometieron a Transwell ensayo de migración de células tumorales. (E) y el ensayo de invasión de células (F) Transwell tumor. Se hicieron crecer y se transfectaron células de cáncer ovárico y después se sometieron a ensayo de invasión de células tumorales Transwell **
p
& lt; 0,0001 frente a los grupos de control.
3.3 Derribo de MALAT-1 induce la expresión del ciclo celular y la apoptosis detenciones en G0 /G1
de fase
Debido a que desmontables de inhibió la proliferación celular MALAT-1 (Figura 3A ), que luego se examina la función MALAT-1 en la regulación de progresión del ciclo celular y la apoptosis cáncer de ovario. Nuestros datos demostraron que las células apoptóticas en células OVCAR3-shM3 se incrementaron marcadamente a 17,8%, en comparación con 0,03% en las células OVCAR3-SHNC y 0,02% en las células parentales OVCAR3 (P & lt; 0,001, Fig 4A y 4C). Por otra parte, el análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo demostró que desmontables de MALAT-1 de expresión detuvieron a los células OVCAR3-shM3 en la fase Go /G1 del ciclo celular y los porcentajes de células en el S y G2 /M fases también se redujo (P & lt ; 0,05, Fig 4B y 4D). Estos datos sugirieron que el efecto inhibidor de MALAT-1 caída en la proliferación y el crecimiento OVCAR3 podría ser causado por la detención del ciclo celular y aumento de la apoptosis.
(A) Desmontables de MALAT-1 condujo a la apoptosis de células tumorales. OVCAR3 células transfectadas con MALAT-1 shM3 se analizaron mediante citometría de flujo para la apoptosis. (B) Derribo de MALAT-1 condujo a la detención del ciclo celular. células transfectadas con OVCAR3 MALAT-1 shRNA3 se analizaron por citometría de flujo análisis de la distribución del ciclo celular. (C) Cuantificación de los datos en A. *** p & lt; 0,0001 frente a los controles. (D) La cuantificación de los datos en B, * p & lt; 0,05 frente a los controles.
3.4 regulación a la baja de MALAT-1 afecta a la expresión de un gran número de genes
Los perfiles de expresión génica de las células OVCAR3-shM3 OVCAR3-SHNC y se analizaron por se identificaron; el análisis de microarrays, y 449 genes expresados diferencialmente significativamente (2 veces & gt). Entre ellos, 206 genes fueron regulados hacia abajo, mientras que 243 genes fueron reguladas en las células de cáncer de ovario con shRNA mediada MALAT -1-silenciamiento comparación con el control OVCAR3 células. Una lista distinta de genes están regulados por MALAT-1 como se ha demostrado por la agrupación jerárquica sin supervisión (Figura 5A). A continuación realizó QRT-PCR para 12 seleccionados al azar genesto confirmar los resultados de microarrays. Los QRT-PCR resultados son muy comparables con los resultados de análisis de microarrays de ADNc, en el que
FRK
,
MUC16
,
MAP2K6
,
FXYD3
,
FDCSP
,
MAOB
,
GBP2
, y
TNFSF10
eran regulados abajo,
NEXN
,
TSPAN2
,
ANKRD1
, y
BHLHE41
fueron hasta reguladas en las células OVCAR3-shM3 en comparación con las células SHNC (figura 6). Por otra parte, GO y KEGG análisis de enriquecimiento de los genes más hacia arriba y hacia abajo regulados, respectivamente, identificado de manera significativa las funciones más representadas destacando un papel de MALAT -1 relativa a la invasión y metástasis de las células de cáncer de ovario. ación Además Regul de la transcripción, la regulación positiva de la proliferación celular, el ciclo celular, el crecimiento celular y la adhesión celular por MAPK señalización o P53 vías de señalización se vieron afectados por MALAT-1 de expresión. (S1-S4 Figs).
jerárquico no supervisado análisis de la agregación de los perfiles de expresión global de los genes que se expresan de forma diferente. Columna representa sampl, y la fila representa gen, el verde representa una expresión génica nivel inferior y el rojo representa un pariente mayor de la expresión génica.
El gráfico mostraba la diferencia media de plegado, FRK, MUC16, MAP2K6, FXYD3 , FDCSP, MAOB, GBP2, se redujeron regulado TNFSF10, NEXN, TSPAN2, NKRD1, BHLHE41 fueron hasta reguladas en las células OVCAR3-shM3. (P & lt; 0,05) guía empresas
3,5 MALAT-1 puede involucrados en el cáncer de ovario mediante la regulación de la expresión de
MMP13
,
MMP19
,
ADAMTS1
Entre estos DEGs, 79 genes fueron significativamente hasta reguladas o hacia abajo-regulada por lo menos de 3 veces. De acuerdo con los últimos estudios,
MMP19
,
ADAMTS1
y
MMP13
genes están estrechamente relacionados con la metástasis y el desarrollo de tumores malignos. A continuación realizó QRT-PCR y Western Blot para confirmar la expresión de
MMP19
,
ADAMTS1
y
MMP13
genes entre células OVCAR3-SHNC OVCAR3-shM3 y. La expresión de mRNA
MMP13
es downregulated en las células shM3, mientras que la expresión de
se aumentó MMP19 y ADAMTS1
(** P & lt; 0,01, figura 7A). La expresión de proteínas fue consistente con los resultados de ARNm (figura 7B). Represión de MALAT-1 resultó en la regulación negativa de la expresión de
MMP13
y hasta la regulación de la expresión de genes
MMP19 y ADAMTS1
, lo que indica que MALAT-1 puede involucrados en el cáncer de ovario mediante la regulación de la expresión de la expresión de ARNm
MMP13
,
MMP19
,
y ADAMTS1
genes.
(A) de ADAMTS1, MMP13, MMP19 y están regulados por MALAT -1. * P & lt; 0,05 en comparación con grupos de control. (B) expresión de la proteína ADAMTS1, MMP13, MMP19 y se alteran como resultado de MALAT-1 desmontables. (C) Cuantificación de B. * p & lt; 0,05 frente al control.
Discusión
En el genoma humano, los datos de secuenciación de ADN ha demostrado que a pesar de miles de genes carecen de la capacidad de codificación de proteínas, que, no obstante, podrían desempeñar un papel importante en la regulación de crecimiento celular, supervivencia, apoptosis, y la tumorigénesis [6]. ARN no codificador puede clasificarse según su tamaño en miRNAs (22 nt), piRNAs (18-30 nt), los ARN de traslación-regulatorio cortos (100-200nt), y mucho más largo ncRNAs (hasta 10.000 nt) [17] . El ARN no codificante largo con una longitud de & gt; 200 nt ganó la atención sustancial recientemente. En el presente estudio, hemos examinado MALAT-1 de expresión en los tejidos de cáncer de ovario epitelial y se investigó el papel de MALAT-1 en la regulación de la migración de células tumorales y la invasión in vitro. Se encontró que MALAT-1 mRNA se sobreexpresa en tumores tissuesand MALAT-1 de expresión se asoció con la progresión del cáncer de ovario. Desmontables de MALAT-1 de expresión suprime la proliferación de células tumorales, la migración y la invasión, las células detenidas en la fase G0 /G1 del ciclo celular y la apoptosis inducida. Se identificaron más de 79 genes cuya expresión se modificó significativamente (& gt; 3 veces) siguientes MALAT-1 desmontables. Curiosamente, tres de estos genes,
MMP19
,
ADAMTS1
, y
MMP13
, han sido previamente implicadas en la regulación de la angiogénesis, la matriz extra-celular, la adhesión celular, y la progresión del cáncer. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la sobreexpresión de MALAT-1 podría promover la progresión del cáncer de ovario mediante la regulación de la expresión de
MMP19
,
ADAMTS1
y
MMP13
genes.
la metástasis es la causa principal de mortalidad en pacientes con cáncer. El mecanismo subyacente para la metástasis tumoral y la recurrencia es muy complejo, incluyendo la adhesión de células tumorales, invasión, intravasación, la circulación, la extravasación, y el crecimiento en las organizaciones distantes [18]. Los cambios en las vías de señalización intracelulares que controlan la proliferación celular y la apoptosis, así como la secreción extracelular de proteínas que están implicadas en la adhesión celular, la migración, y la proteólisis son de suma importancia para la metástasis del cáncer [19]. Recientemente, la función del ARN no codificante, tal como MALAT-1, durante la metástasis está empezando a ser apreciado [8, 14]. En neoplasias ginecológicas, cáncer de ovario se diagnostica generalmente como una enfermedad metastásica. Nuestro estudio demuestra que la regulación positiva de MALAT-1 se asocia con la progresión del cáncer de ovario. De hecho, estudios previos han demostrado que MALAT-1 fue significativamente hasta reguladas en varios tipos de cáncer como el de pulmón, el hígado, el páncreas y próstata. Por otra parte, MALAT-1 ha servido como metastásico y la recurrencia de biomarcadores para el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer hepatocelular [15]. Sin embargo, se requieren estudios futuros con mayor tamaño de muestra para confirmar nuestros resultados.
Estudios anteriores mostraron que las células tumorales eran capaces de producir factores que inducen la angiogénesis tumoral, así como las metaloproteinasas y moléculas relacionadas para degradar la matriz extracelular [20 ]. Nuestro estudio mostró MALAT-1 desmontables modula la expresión de MMP13 y MMP19, miembros de la familia de metaloproteinasas de matriz (MMP) de las proteínas que están implicadas en la alteración del metabolismo de la matriz extracelular, la progresión tumoral y la metástasis [21, 22]. Algunos estudios anteriores mostraron que MMP13 se expresa anormalmente en algunos tumores sólidos, como el carcinoma papilar de tiroides y el cáncer colorrectal y se asocia con la progresión y la metástasis [23,24]. Por el contrario, MMP19, que muestra características estructurales únicas, cumple una doble función en los tejidos. Por una parte, la deficiencia de MMP19 aumentó la respuesta angiogénica temprana, que actúa como un regulador negativo de la invasión. Sin embargo, MMP-19, que se regula en marcha en varios tejidos de cáncer, facilita la invasión del tumor [25]. En consonancia con la eficacia anti-angiogénico de MMP19, varios informes han demostrado que metalopeptidasa con trombospondina tipo 1 con motivos (ADAMTS1), que fue hasta reguladas en las células MALAT-1-silenciamiento para inhibir la angiogénesis [26-28]
, y la disminución de ADAMTS1 estimuló la migración y la invasión de las células del cáncer de mama [29].
Hasta la fecha, no existe ningún informe que implican a MALAT-1 en la regulación de la expresión MMP o ADAMTS1 en el cáncer de ovario. No obstante, sobre la base de nuestros datos actuales, que postula que la eficacia de MALAT-1 en la promoción de la progresión del cáncer de ovario podría estar mediada por la regulación de MMP13 y baja regulación de MMP19 y ADAMTS1.
Para aclarar aún más la los mecanismos moleculares de la metástasis inducida por MALAT-1, se identificaron genes regulados por MALAT-1 de expresión, mediante la comparación de shRNA-inhibidos frente a las células de cáncer de ovario de control. La exploración adicional de los genes diana y la vía de señalización proporcionarán nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares de MALAT-1 participan en la progresión del cáncer de ovario y ayudará en la construcción de una regla de predicción y prevención más fuerte en el cáncer de ovario.
Información de Apoyo
S1 Fig. GO enriquecimiento de análisis del proceso biológico de genes regulados y reguladas por
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s001 gratis (JPG)
S2 Fig. GO enriquecimiento de análisis de los componentes celulares de las transcripciones hasta reguladas y reguladas por
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s002 gratis (JPG)
S3 Fig. GO enriquecimiento de análisis de las funciones moleculares de hasta reglamentado y regulado transcripciones
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s003 gratis (JPG)
S4 Fig. análisis de enriquecimiento KEGG (análisis de la vía)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s004 gratis (JPG)
Reconocimientos
Agradecemos Jiachun Lv útil para el asesoramiento con los experimentos .