Extracto
Mientras MEDOS fue descubierto como un retículo endoplásmico molecular especializada chaperona para el Wnt co-receptores LRP5 y LRP6, proteína MESD recombinante es capaz de unirse a madurar LRP5 y LRP6 en la superficie celular y actúa como un antagonista universal de LRP5 /6 moduladores. En nuestro estudio anterior, se encontró que la región C-terminal de MESD, que está ausente en las secuencias de invertebrados, es necesario y suficiente para la unión a madurar LRP6 en la superficie celular. En los presentes estudios, que caracteriza aún más la interacción entre la región del péptido y LRP5 /6 MESD C-terminal. Se encontró que los péptidos derivados de la región C-terminal MEDOS bloquean la unión a MEDOS LRP5 en la superficie celular también. También puso de manifiesto que hay dos sitios LRP5 /6 de unión dentro de MEDOS región C-terminal que contienen varios residuos cargados positivamente. Por otra parte, hemos demostrado que el péptido región MEDOS C-terminal, al igual que la proteína MEDOS de larga duración, bloqueado Wnt 3A e inducida por Rspodin1 señalización de Wnt /β-catenina en LRP5- y LRP6- células que expresan, suprimida Wnt /β-catenina de señalización en las células humanas Hs578T mama y las células PC-3 de cáncer de próstata, y proliferación de células cancerosas inhibido, aunque la proteína MESD de longitud completa es más potente que su péptido. Finalmente, encontramos que la citotoxicidad del tratamiento de la proteína MESD de longitud completa y su péptido región C-terminal aumentado significativamente agente de quimioterapia inducida por adriamicina en HS578T y células PC-3. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la región MEDOS C-terminal constituye el dominio /6 vinculante LRP5 importante, y que la proteína MEDOS y su péptido C-terminal región tienen un valor terapéutico potencial en el cáncer
Visto:. Lin C , Lu W, Zhang W, Londoño-Joshi AI, Buchsbaum DJ, Bu G, et al. (2013) El C-terminal del péptido Región MEDOS Imitadores de longitud completa MEDOS y actúa como un inhibidor de Wnt /β-catenina en las células cancerosas. PLoS ONE 8 (2): e58102. doi: 10.1371 /journal.pone.0058102
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Mayo, 2012; Aceptó 3 de febrero de 2013; Publicado: 28 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos nacionales de Salud RO1CA124531 (a YL) y el Instituto Nacional del cáncer conceder CA 13148 (para el Centro de cáncer Integral de la UAB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Yonghe Li y Guojun Bu se enumeran como inventores de la patente para el uso de MEDOS en la enfermedad de los huesos y el cáncer, y Guojun Bu sirve como consultor para Raptor farmacéutica, que ha licenciado esta patente de la Universidad de Washington en St. Louis. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La lipoproteína de baja densidad de receptores relacionados con la proteína-5 (LRP5) y LRP6 son dos miembros de la familia en expansión receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR). Los Frizzled (Fzd), los receptores pueden responder a las proteínas Wnt sólo en presencia de la LRP5 co-receptor Wnt o LRP6 para activar la vía de β-catenina canónica. En ausencia de Wnts, β-catenina es secuestrada en un complejo que consiste en el supresor de tumor poliposis adenomatosa coli (APC), Axin, la glucógeno sintasa quinasa-3β (GSK3), y la caseína quinasa 1 (CK1). Esta formación de complejo induce la fosforilación de la β-catenina por CK1 y GSK3, lo que da lugar a la ubiquitinación y la posterior degradación de β-catenina por el proteasoma 26S. La acción de este complejo se inhibe tras la unión de Wnt a sus receptores de la superficie celular y Fzd LRP. Los resultados de la estabilización de citosólico β-catenina, que a continuación, entra en el núcleo para formar un complejo con los factores de transcripción del factor de factor de células T /linfoide mejorar la unión LRP-Wnt-Fzd (TCF /LEF) la familia de activar la transcripción de la meta Wnt genes que regulan el ciclo celular, el crecimiento y la progresión [1] -. [3] |
LRP5 y LRP6 se someten a modulación por varias proteínas secretadas que se unen a los módulos extracelular β-hélice /EGF repetidos de LRP5 /6 [3]. proteínas Wnt y Rspondin (RSPO) son dos grupos de /β-catenina señalización Wnt agonistas. Similar a ligandos Wnt, la acción de las proteínas en la señalización RSPO /β-catenina Wnt requiere la Wnt receptores Fzd y LRP5 /6, aunque la unión directa entre RSPO y LRP5 /6 es controvertida [4] - [8]. Además, las proteínas de la RSPO son capaces de crear sinergia con ligandos Wnt para activar Wnt /β-catenina señalización [5], [8], [9].
Mientras MEDOS fue descubierto como un retículo endoplásmico molecular especializado (ER) chaperón para la co-receptores Wnt LRP5 y LRP6 [10], [11], proteína MEDOS recombinante es capaz de unirse a madurar LRP5 y LRP6 en la superficie celular, actúa como un inhibidor universal de diferentes /6 moduladores LRP5, y suprime Wnt /señalización de β-catenina en células de cáncer de Wnt-dependientes [8], [12] - [14]. En nuestro estudio anterior, se encontró que la región C-terminal de MESD, que está ausente en las secuencias de invertebrados, es necesario y suficiente para la unión a madurar LRP6 en la superficie celular [12]. En los presentes estudios, que caracteriza la interacción entre la región del péptido MESD C-terminal y LRP5 /6. También se estudió el papel del péptido MEDOS región C-terminal de Wnt /β-catenina en las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Materiales
El plásmido pcDNA3.1C myc-hLRP5 que contiene el humano de longitud completa de cDNA y LRP5 plásmido PCS-Myc-hLRP6 que contiene el humano de longitud completa LRP6 ADNc eran del Dr. Cindy Bartels (Case Western Reserve University, Cleveland) y el Dr. Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Alemania), respectivamente. Plásmido pGST-E-cadherina fue proporcionada por el Dr. Gail Johnson (Universidad de Rochester, Nueva York). El plásmido pUSEamp-Wnt1-HA que contiene el ratón de longitud completa Wnt1 cDNA se adquirió de Upstate. El plásmido que contiene BA-Wnt10b ratón de longitud completa Wnt10b eran de Addgene. El constructo de luciferasa TOPFLASH fue de Upstate Biotechnology, y el constructo de luciferasa Super8XTOPFlash fue proporcionado por el Dr. Randall T. Luna (Universidad de Washington, Seattle). Un vector de β-galactosidasa que expresan era de Promega. Preparación de la proteína MESD de ratón recombinante y el péptido región ratón MESD C-terminal, mMesd (50 a 195), se ha descrito antes [12]. Todos los otros péptidos ratón MEDOS, MEDOS C-terminal del péptido hMesd región humana (160-197) (KGGGSKEKNKTKQDKGKKKKEGDLKSRSSKEENRAGNK) y su péptido de control (KEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPR) fueron fabricados por EZBiolab. Rspo1 proteína humana recombinante fue proporcionada por el Dr. Kim Kyung-Ah (Nuvelo Inc., California). La adriamicina se adquirió de Sigma. Anti-osteoprotegerina anticuerpo (OPG) se obtuvo de R & amp; D Systems. Monoclonal anti-fosforilada LRP6 y anti-AXIN2 se adquirieron de Cell Signaling Technology. Monoclonal anti-β-catenina fue de BD Biosciences. policlonal de conejo anti-ciclina D1 fue de Chemicon International. Policlonales anti-Wnt10b y monoclonal anti-actina fue de Sigma. El anticuerpo monoclonal anti-HA se generó como se describe anteriormente [15]. Marcado con peroxidasa anticuerpo anti-ratón y el sistema ECL se adquirieron de Amersham Life Science. Los sistemas de ensayo de luciferasa y β-galactosidasa eran de Promega. medios de cultivo de tejidos, suero fetal bovino (FBS), y plástico-ware se obtuvieron de Life Technologies, Inc. cóctel inhibidor de proteinasa Complete ™ se obtuvo de Boehringer Mannheim. Las proteínas se yodados utilizando el método yodo-GEN como se describe anteriormente [8].
Cultivo de células y medios condicionados
embrionarias humanas de riñón HEK 293 células, células HT1080 con cáncer de fibrosarcoma humano, basal- humana como las células de cáncer de mama Hs578T, PC-3 células humanas de cáncer de próstata, células C2C12 mesenquimales de ratón no comprometidas, células Wnt3A secretoras de L, y células L de control se obtuvieron de American Type Culture Collection. LDLR- deficiente línea celular de ovario de hámster chino (CHO) ldlA7 fue proporcionado amablemente por el Dr. Monty Krieger (Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge) [16]. LDL 7 células LRP5-trasfected y las células de control se han descrito antes [8], y se cultivaron en medio F-12 de Ham que contiene 10% de FBS y 350 g /ml de G418. células HT1080 LRP6 transducidas y las células de control se han descrito antes [17]. HT1080 LRP6 transducidas y las células secretoras de Wnt3A-L se cultivaron en medio DMEM que contiene 10% de FBS y 350 g /ml de G418. células HEK293, Hs578T y C2C12 fueron cultivadas en el mismo medio anteriormente sin G418. las células PC-3 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS. medio Wnt3A acondicionado (CM) y CM de control de células L se prepararon de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
ligando ensayo de unión
ligando ensayo de unión se llevó a cabo exactamente como se describe anteriormente [8]. Las células (2 × 10
5) se sembraron en placas de 12 pocillos 1 día antes del ensayo. Ligando-tampón de unión (medio mínimo de Eagle que contiene 0,6% de BSA con una concentración diferente de radioligando, 0,6 ml /pocillo) se añadió a las monocapas de células, en la ausencia o la presencia de MESD no marcado o su péptido, seguido de incubación durante 4 h a 4 ° C. A partir de entonces, se eliminó tampón que recubre que contiene el ligando no unido, y las monocapas de células se lavaron y se lisaron en tampón de lisis de baja SDS (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, 0,2% SDS, 10% v /glicerol) y se contaron. La concentración de proteínas de cada lisado celular se midió en placas paralelas que no contenían los ligandos.
ligando análisis de unión
El paquete de simulación AMBER9 [18] se utiliza tanto en el procesamiento de la simulación y los datos. Los péptidos se representan utilizando todos los átomos campo de fuerza de carga puntual (ámbar FF03) [19]. Un Generalizado Born (GB) modelo [20] se utilizó para todas las simulaciones con una concentración de sal de 0,2 M efectiva (modelado basado en la teoría de Debye-Hückel). En el método GB, el disolvente es tratado como un continuo dieléctrica alta interacción con los cargos que se incrustan en las moléculas de soluto de baja entorno dieléctrico. Ningún término área de superficie se utilizó en el modelo GB. Las constantes dieléctricas interiores y de disolvente se fijaron a 1,0 y 78,5, respectivamente. La temperatura se controló a 300 K usando un esquema débil de acoplamiento [21]. SHAKE [22] se aplicó a forzar que los enlaces que conectan los átomos de hidrógeno y un intervalo de tiempo de 2,0
fs
se utilizó para resolver numéricamente las ecuaciones de Newton. Las simulaciones de los dos péptidos cortos mMesd (160-169) y mMesd (183-191) se iniciaron a partir de la conformación totalmente extendida después de la minimización de la energía y una duración de 100
ns
cada uno. La estructura de partida para el péptido mMesd (155-191) se deriva de la estructura MEDOS RMN (AP ID: 2KGL) y la simulación se realizó durante 200
ns
. Las instantáneas simulados se agruparon en base a un método jerárquico [23] en el que se incluyó una instantánea en su grupo más cercano si la distancia de la cadena principal de la raíz cuadrada media (RMSD) es menor que 1,5 Å después de superposición secuencial. Las estructuras representativas fueron comparados, y los grupos cuyas estructuras representativas estaban más cerca de 1,5 Å se fusionaron juntos.
reportero de luciferasa ensayo
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos. Después de cultivo durante la noche, las células fueron transfectadas transitoriamente con el constructo TOPflash o Super8XTOPFlash luciferasa, vector β-galactosidasa que expresan, y pcDNA3.1C-Myc-hLRP5, PCS-Myc-hLRP6 o vector de control. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con MESD, péptido MESD, Rspo1 y Wnt3A CM. Las células se lisaron entonces 24 h más tarde y se determinaron las actividades tanto de β-galactosidasa y luciferasa. La actividad luciferasa se normalizó a la actividad β-galactosidasa.
Western Blot
Las células en placas de 6 pocillos se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis (solución salina tamponada con fosfato que contiene 1% de Triton X -100 y 1 mM PMSF) a 4 ° C durante 10 min. Las cantidades iguales de proteína se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras. Después de la transferencia a Immobilon-P membrana de transferencia, las incubaciones sucesivas con anti-HA, anti-Wnt10b, anti-β-catenina, anti-OPG, anti-fosforilada LRP6, anti-LRP6, anti-AXIN2, anti-ciclina D1 o anti -actina, anticuerpo secundario y peroxidasa de rábano conjugada se lleva a cabo durante 60 a 120 min a temperatura ambiente. Las proteínas inmunorreactivas se detectaron entonces usando el sistema ECL. Programación de películas bandas inmunorreactivas fueron escaneadas por la cámara Kodak Digital Science DC120 zoom digital.
Análisis de β-catenina citosólica libre con la unión de GST-E-cadherina ensayo
El ensayo de unión de GST-E-cadherina era llevado a cabo exactamente como se describe anteriormente (
9
). No complejado libre citosólico β-catenina presente en 100 g de lisado celular total se sometió a SDS-PAGE y se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal de ß-catenina.
proliferación de las células de ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 10000 células /pocillo. RPMI-1640 o medio DMEM que contenía FBS al 2% se utilizó como medio de ensayo. Después de 16 h de incubación, las células fueron tratadas con MESD o su péptido durante 10 días. Los medios se cambian cada dos días. Al final del experimento, se recogieron las células y se contaron usando el ensayo de exclusión de azul de tripano.
bromodesoxiuridina (BrdU) Ensayo de proliferación de
incorporación de BrdU en las células en proliferación se analizó por una proliferación de células BrdU ELISA kit (colorimétrico, Roche) según las instrucciones del fabricante.
viabilidad de las células de ensayo
la viabilidad celular se midió en placas de 96 pocillos por el Cell Titer Glo de ensayo (Promega), que es un luminiscente ensayo que es un indicador de las células vivas como una función de la actividad metabólica y contenido de ATP.
Estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student para datos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar.
Resultados
péptidos de la región C-terminal MEDOS bloquear la unión a MEDOS LRP6, así como LRP5 en la superficie celular
En nuestro estudio anterior , hemos demostrado que el péptido región MESD C-terminal mMesd (150-195) bloquea la unión a madurar LRP6 en la superficie celular [12] de la proteína MESD de longitud completa. Sin embargo, si el péptido región MESD C-terminal es capaz de bloquear la unión a madurar LRP5 en la superficie celular de proteínas MESD no está claro. La mayor parte de la región C-terminal de MESD está ausente en las secuencias de invertebrados. Como los primeros 5 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal y los últimos 4 residuos de aminoácidos en el C-terminal de mMesd (150-195) se conservan a través de diferentes especies, hemos preparado un ratón más corto péptido región MESD C-terminal, mMesd (155 a 191), que carece de estos residuos de ácido 9 amino (Figura 1A). A continuación, realiza
ensayo de unión con LRP6- y las células que expresan LRP5 125I-MEDOS. Se encontró que mMesd (155-191), como mMesd (150-195), bloqueó la unión a proteína LRP6 MESD así como LRP5 en la superficie celular (Figura 1B), lo que indica que la región MESD C-terminal también es importante para MESD la unión a LRP5.
(a) representación esquemática de ratón MEDOS y sus péptidos de la región C-terminal y secuencias de aminoácidos de péptidos de la región del ratón MEDOS C-terminales. (B)
125I-MESD (5 nM) unión a células HT1080 LRP6 transducidas y las correspondientes células de control se llevó a cabo durante 4 horas a 4 ° C en ausencia o presencia de 500 nM de ratón MESD o 500 nM ratón MESD C-terminal del péptido región. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error. (C)
125I-MESD (5 nM) unión a células HT1080 LRP6 transducidas o células LRP5-trasfected LDL-7 se llevó a cabo durante 4 horas a 4 ° C en ausencia o presencia de diversas ratón MESD C-terminal péptidos de la región en las concentraciones indicadas. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error.
** P
. & Lt; 0,01 en comparación con las células LRP6 o LRP5 en la ausencia de MEDOS y sus péptidos
Hay dos LRP5 /6 sitios de unión dentro de MEDOS C-terminal región
para caracterizar mejor MEDOS unión a LRP5 /6, preparamos 6 péptidos MEDOS basado en el ratón MEDOS secuencia de la región C-terminal (Figura 1A), y se realizó
ensayo de unión de 125I-MEDOS con LRP6- y LRP5 que expresan células en presencia o ausencia de estos péptidos. Mientras mMesd (155-164) y mMesd (165-182) no fueron capaces de bloquear la unión a LRP5 o LRP6 en la superficie celular de proteínas MEDOS, mMesd (160-169) mostró un nivel similar de inhibición como mMesd (155-173) ( Figura 1C). Además, mMesd (183-191) también muestra un nivel similar de inhibición como mMesd (174-191) y mMesd (160-169) (Figura 1C). En conjunto, estos resultados indican que existen dos sitios de LRP5 /6 de unión dentro de MESD región C-terminal. Además, es interesante observar que mMesd (160-169) y mMesd (183-191) muestran su capacidad inhibidora a la concentración de 50 mM, que es 100 veces de las requeridas para mMesd (155-191), lo que sugiere que la dos LRP5 /6 sitios de unión dentro de la región C-terminal de MEDOS cooperan entre sí para crear un dominio de unión a LRP5 /6.
alta afinidad péptidos C-terminales aislados mantienen las características estructurales de los de larga duración MEDOS
Nuestros resultados de los ensayos de unión son consistentes con la reciente estudio de RMN sobre la longitud completa MESD [24], lo que demuestra que el dominio helicoidal flexible de C-terminal (156 a 195) es estructuralmente distinto del dominio de núcleo (1- 155), y es responsable de la función de escolta de MEDOS mediante la unión a LRP5 /6. Sin embargo, los péptidos pueden tener cambios estructurales significativos cuando se aísla a partir de proteínas. Para explorar más a fondo los puntos de vista estructurales, hemos realizado simulaciones de dinámica molecular en los tres péptidos [mMesd (155-191), mMesd (160-169) y mMesd (183-191)] y los comparó con la estructura de RMN de los de larga duración MEDOS proteína. La agrupación de análisis de los resultados de la simulación indicó que los tres péptidos adoptaron conformación relativamente estable. Las conformaciones más pobladas de los tres péptidos se ilustran en la figura 2C-2E. En lugar de la forma de bucle prolongado de dominio C-terminal en la longitud completa MESD (Figura 2A), mMesd (155-191) se pliega en una estructura más compacta con tanto de su C- y N-terminales de flexión hacia el centro ( Figura 2B). A pesar de las aparentes diferencias estructurales, ambas estructuras mantienen una superficie positivo consistía en residuos cargados positivamente con sus cadenas laterales localizar en el mismo lado y totalmente expuestos al solvente (Figura 2A y 2B). Tal superficial positiva es crucial para la capacidad de enlace de MEDOS madure LRP5 /6. Curiosamente, esta superficie positivo puede ser dividido espacialmente en dos regiones que consisten principalmente en los residuos de carga positiva de mMesd (160-169) y mMesd (183-190), respectivamente (Figura 2A y 2B). Los resultados de simulación muestran que ~ 45% y ~58% de todas las instantáneas de simulación de mMesd (160-169) y MEDOS (182-190), respectivamente, adoptan conformaciones similares a los correspondientes en sus la estructura MEDOS de longitud completa (Figura 2D y 2E). Las características estructurales similares y superficial positiva explican que los dos péptidos más cortos presentan una función similar en la unión a LRP5 /6
.
(A) La estructura de RMN de ratón MESD C-terminal de dominio (155 a 191) sobre la base de el estudio de Chen et al. (24). (B) La instantánea más representativa del péptido mMesd (155-191). Los segmentos de 160-169 y 183-191 se resaltan en colores naranja y verde. Los residuos que forman la superficie positivos se muestran en barras sólidas. Las dos zonas de la superficie que constan de residuos 160 a 169 de segmento o 183-191segment fueron marcados con círculos de trazos azules y rojas. Los residuos que son únicos en la superficie positiva de A) o B) se marcaron con rojo-color. (C-E) Las conformaciones más pobladas basado en el análisis de agrupamiento de las instantáneas de simulación de tres péptidos C-terminales mMesd (155-191) (C), mMesd (160-169) (D) y mMesd (183-191) ( e).
El MEDOS C-terminal del péptido bloques región de la señalización de Wnt /β-catenina inducida por Wnt3A y Rspo1 en LRP5- o células HEK293 que expresan LRP6
Wnt3A es uno de los 19 miembros de vertebrados de la familia Wnt. Hay cuatro miembros de la familia de la RSPO. Tanto Wnt3A y Rspo1 son capaces de activar Wnt /señalización a través de LRP5 o LRP6 β-catenina [5], [8], [9]. Por lo tanto, hemos realizado Wnt /β-catenina señalización reportero de ensayo para probar si el péptido imita región de la proteína MESD MESD C-terminal para actuar como un inhibidor de la señalización /β-catenina Wnt inducida por Wnt3A y Rspo1 en LRP5- o células que expresan LRP6 . células HEK293 se transfectaron transitoriamente con LRP5 o LRP6 junto con Wnt /β-catenina TOPFLASH reportero de señalización, y se trataron con Wnt3A CM o proteína Rspo1 en presencia o ausencia de la proteína MESD ratón o su región del péptido C-terminal mMesd (155-191) . Como era de esperar, la actividad de TOPFLASH se aumentó en gran medida después de células HEK293 se transfectaron transitoriamente con LRP5 o LRP6 y se trataron con Wnt3A o Rspo1 (Figura 3). Es importante destacar que la actividad TOPflash aumento inducido por LRP5, LRP6, LRP5 más Wnt3A, LRP6 más Wnt3A, LRP5 más Rspo1, o LRP6 más Rspo1 fue bloqueado no sólo por la proteína MESD sino también por su péptido mMesd (155-191) en una dosis dependiente manera (Figura 3).
HEK293 células en placas de 24 pocillos se transfectaron transitoriamente con el plásmido LRP5 (A), el plásmido LRP6 (B) o el correspondiente vector de control, junto con el constructo de luciferasa TOPFLASH y la β-galactosidasa-expresión de vector en cada pocillo. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con Wnt3A CM (5%), Rspo1 (40 ng /ml), ratón MESD (mMesd) (2 M), o el ratón MESD C-terminal del péptido región mMesd (155-191) en el concentraciones indicadas. A continuación, la actividad de luciferasa se midió 24 h después con la normalización de la actividad de la β-galactosidasa. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 en comparación con las células control sin MEDOS y su tratamiento péptido
El MEDOS C-terminal del péptido bloquea la fosforilación región LRP6 y OPG expressioninduced por Wnt3A y Rspo1 en C2C12. células
C2C12 células progenitoras mesenquimales son células de ratón no comprometidos que se pueden diferenciar en osteoblastos sobre la activación de la señalización de Wnt /β-catenina [9], [25], [26]. Empleamos C2C12 células para examinar más a fondo el efecto del péptido sobre la señalización MEDOS /β-catenina vía Wnt3A inducida. fosforilación LRP6 es crítica para la señalización de Wnt /β-catenina inducida por las proteínas Wnt [3], y OPG es un gen diana directa de la señalización de Wnt /β-catenina en osteoblastos [27], [28]. Se encontró que el ratón MEDOS péptido C-terminal región mMesd (155-191), como la proteína MEDOS, fue capaz de suprimir la fosforilación inducida endógena Wnt3A LRP6 y la expresión de OPG en células C2C12 (Figura 4A y 4B).
(a) C2C12 células en placas de 6 pocillos se trataron con Wnt3A CM (5%) en ausencia o presencia de ratón MESD (mMesd) (0,5 M) o el ratón MESD C-terminal del péptido región mMesd (155-191) en el indica las concentraciones de 6 h. Se analizó el nivel de LRP6 fosforilada. (B) las células C2C12 en placas de 6 pocillos se incubaron con Wnt3A CM (5%) en presencia o ausencia de mMesd (0,5 M) o mMesd (155-191) a las concentraciones indicadas durante 48 h. Los niveles de OPG celular total se analizaron por transferencia Western. (C) C2C12 células en placas de 6 pocillos se incubaron con Rspo1 (20 ng /ml) y /o Wnt3A CM (2%) en la ausencia o presencia de mMesd (0,5 M) o mMesd (155-191) (2 micras ) durante 48 h. Los niveles de OPG celular total se analizaron por transferencia Western. Todas las muestras también se probaron con el anticuerpo anti-actina para verificar la carga igual.
Rspo1 es capaz de sinergia con Wnt3A en la inducción de la expresión de OPG en células C2C12, aunque sí Rspo1 tiene efectos menores [9] . Se encontró que el ratón MESD C-terminal del péptido región mMesd (155-191), similar a la proteína MESD, reprime la expresión de OPG inducida por Rspo1 más Wnt3A en células C2C12 (Figura 4C).
región MESD C-terminal péptido atenúa la señalización de Wnt /β-catenina en el cáncer de próstata PC-3 y las células de cáncer de mama Hs578T
la acumulación de pruebas indica que Wnt LRP6 co-receptor juegan un papel crítico en el /β-catenina Wnt activación en humanos señalización células de la próstata y cáncer de mama y es importante en el desarrollo y progresión de estos dos tipos de cáncer [8], [13], [14], [29] - [33]. Para probar si el péptido región MESD C-terminal es capaz de suprimir la señalización /β-catenina Wnt en la próstata humana y las células de cáncer de mama, preparamos un hMesd humano MESD C-terminal del péptido región (160-197), que se corresponde con ratón MESD mMesd péptido región C-terminal (155 a 191). También preparamos un péptido de control negativo en base a la secuencia de mMesd (155-164). Similar a mMesd (155-191), hMesd (160-197) muestran efectos inhibidores sobre la señalización Wnt /β-catenina inducida por LRP6, Wnt3A, Rspo1, Wnt1 y Wnt10b (Figura S1 y S2). Se encontró que hMesd (160-197), pero no el péptido de control, imitaban proteína MESD y significativamente reprimidos la actividad de la luciferasa informador Wnt en células PC3 de cáncer de próstata y células Hs578T cáncer de mama (Figura 5A). En consecuencia, hMesd (160-197) se redujo en gran medida los niveles de libre citosólico β-catenina, la fosforilación LRP6 y Wnt /β-catenina objetivos AXIN2 y ciclina D1 expresión de señalización en las células PC-3 y Hs578T (Figura 5B).
células PC-3 y HT578T (a) en placas de 24 pocillos se transfectaron transitoriamente con el constructo de luciferasa Super8XTOPFlash y β-galactosidasa que expresan vector en cada pocillo. Después de 24 h de incubación, las células fueron tratadas con el ratón MESD (mMesd), humano MESD péptido hMesd (160-197) o péptido de control a las concentraciones indicadas. A continuación, la actividad de luciferasa se midió 24 h después con la normalización de la actividad de la β-galactosidasa. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error.
** P
& lt; 0,01 en comparación con las células de control sin MESD o tratamiento péptido MESD. las células PC-3 y Hs578T (B) en placas de 6 pocillos se trataron con mMesd, hMesd (160-197) o el péptido de control a las concentraciones indicadas durante 24 h. Los niveles de libre citosólico β-catenina, y celular β-catenina total LRP6, AXIN2, ciclina D1 y LRP6 fosforilados se analizaron entonces mediante transferencia Western. Las muestras también se probaron con el anticuerpo anti-actina para verificar la carga igual.
Wnt1 regula la diferenciación celular y la proliferación del epitelio mamario, y Wnt1 sobre regulación en la glándula mamaria se ha demostrado que induce mamaria hiperplasia y adenocarcinoma [34], [35]. La sobreexpresión de Wnt1 se encontró en la mayoría de los especímenes de carcinoma de próstata [36]. Para caracterizar adicionalmente el efecto inhibitorio del péptido región MESD C-terminal en células de la próstata y cáncer de mama, transfectadas transitoriamente células PC-3 y Hs578T con Wnt1 y Wnt plásmidos informadores y se trataron con proteína MESD o humano MESD péptido hMesd (160-197 ). Encontramos de nuevo que hMesd (160-197), pero no el péptido de control, imitaban proteína MESD para reprimir significativamente la actividad de luciferasa inducida por Wnt Wnt1 en células PC3 y Hs578T (Figura 6A). Por otra parte, hMesd (160-197) se redujo en gran medida los niveles de libre citosólico β-catenina, la fosforilación LRP6 y Wnt /β-catenina señalización objetivos AXIN2 y ciclina D1 en las células que expresan Wnt1-PC-3 y Hs578T (Figura 6B).
células PC-3 y HT578T (a) en placas de 24 pocillos se transfectaron transitoriamente con el plásmido Wnt1 junto con el constructo de luciferasa Super8XTOPFlash y β-galactosidasa que expresan vector en cada pocillo. Después de 24 h de incubación, las células fueron tratadas con el ratón MESD (mMesd), humano MESD péptido hMesd (160-197) o péptido de control a las concentraciones indicadas. A continuación, la actividad de luciferasa se midió 24 h después con la normalización de la actividad de la β-galactosidasa. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error.
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& lt; 0,01 en comparación con las células de control sin MESD o tratamiento péptido MESD. (B) las células PC-3 y Hs578T en placas de 6 pocillos se transfectaron transitoriamente con Wnt1 plásmido o el vector de control correspondiente. Después de incubarse durante 24 h, las células se trataron con mMesd, hMesd (160-197) o péptido de control a las concentraciones indicadas durante 24 h. Los niveles de libre citosólico β-catenina, y el total de Wnt1 celular, β-catenina, LRP6, AXIN2, ciclina D1 y LRP6 fosforilados se analizaron entonces mediante transferencia Western. Las muestras también se probaron con el anticuerpo anti-actina para verificar la carga igual.
El péptido región MESD C-terminal inhibe la proliferación de células de cáncer de mama PC-3 y el cáncer de próstata HS578T
Tener estableció que el péptido región MESD C-terminal suprime la señalización /β-catenina Wnt en las células Hs578T PC-3 y, a continuación, que examinó el efecto de la región del péptido MESD C-terminal sobre la proliferación de células de cáncer. Como se ve en la Figura 7, hMesd (160-197), pero no el péptido de control, imitado proteína MESD y muestra efecto inhibidor sobre PC-3 y la proliferación celular HS578T de una manera (Figura 7A) dependiente del tiempo. Para confirmar el efecto inhibidor del péptido MESD sobre la proliferación de células de cáncer, se realizó ensayo de incorporación de BrdU después de que las células se trataron con péptidos. Se encontró que el péptido región MESD C-terminal disminuyó incorporación de BrdU en las células Hs578T (Figura 7B) PC-3 y.
células (A) de cáncer en placas de 6 pocillos se trataron con ratón MESD (mMesd, 2 M), humano MESD péptido hMesd (160-197) (4 M) o péptido control (4 M) en medio RPMI-1640 que contenía FBS al 2% para las células PC-3 o medio DMEM que contenía FBS al 2% para HS578T durante 10 días . Los medios se cambian cada dos días, y se recogieron las células y se contaron usando el ensayo de exclusión de azul de tripano. Los valores son promedios de tres determinaciones con las desviaciones estándar indicadas por barras de error. **
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& lt; 0,01 en comparación con las células tratadas con PBS o el péptido control. las células (B) de cáncer en matraces T-25 fueron tratadas con péptido humano MESD hMesd (160-197) (2 M) o péptido de control (2 M) en el medio de cultivo que contiene 2% de FBS durante 7 días. Los medios se cambian cada dos días. Las células se recogieron a continuación y se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad de 5000 células /pocillo con hMesd (160-197) (2 M) o péptido de control (2 M) en el medio de cultivo que contiene 10% de FBS durante 2 días. La proliferación celular se midió mediante la proliferación de BrdU ELISA. Todos los valores son la media de seis determinaciones con el s.d. indicada por barras de error.
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en comparación con las células tratadas con el péptido de control citotoxicidad
MEDOS proteínas y su péptido C-terminal región potenciar agente de quimioterapia inducida por adriamicina en PC-3 y HS578T. células
adriamicina es un agente de quimioterapia común. A continuación, prueba si la proteína MEDOS y su péptido C-terminal región pueden aumentar la citotoxicidad inducida por adriamicina agente de quimioterapia en las células cancerosas. Como se ve en la Figura 8, el tratamiento de combinación causó más citotoxicidad en HS578T y PC-3 células que el tratamiento agente individual. Por ejemplo, el tratamiento de células Hs578T con proteína MESD (2 M) solo y adriamicina (0,5 M) por sí sola resultó en 25% y 69% de inhibición de la viabilidad celular, respectivamente. Sin embargo, cuando se trata con proteínas MESD más adriamicina, la viabilidad celular de las células Hs578T se redujo a 8% (Figura 8).
(A) células de cáncer en matraces T-25 se trataron con ratón MESD (2 M ) en medio RPMI-1640 que contiene 2% de FBS durante 3 PC-células o medio DMEM que contenía FBS al 2% para HS578T durante 4 días. Los medios se cambian cada dos días, y se recogieron las células y se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad de 5000 células /pocillo con MESD (2 M) y /o adriamicina (0,5 M) en medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS durante 3 PC-células o medio DMEM que contiene 10% de FBS para HS578T durante 2 días. a continuación, la viabilidad celular se midió por el Cell Titer Glo sistema de ensayo. las células (B) de cáncer en matraces T-25 fueron tratadas con péptido humano MESD hMesd (160-197) (2 M) o péptido de control (2 M) en el medio de cultivo que contiene 2% de FBS durante 7 días. indicada por barras de error. Chen et al. A continuación, la actividad de luciferasa se midió 24 h después con la normalización de la actividad de la β-galactosidasa. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error. A continuación, la actividad de luciferasa se midió 24 h después con la normalización de la actividad de la β-galactosidasa. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error.