Extracto
Antecedentes
Las células madre cáncer de páncreas (CSC) representan una pequeña subpoblación de células de cáncer pancreático que tienen la capacidad de iniciar y propagar la formación de tumores. Sin embargo, los mecanismos por los que se mantienen células madre cancerosas pancreáticas no son bien entendidos o caracterizan.
Métodos
La expresión de los receptores Notch, ligandos, y Notch genes diana de señalización se cuantificó en el CSC y la no poblaciones CSC de 8 xenoinjertos pancreáticos humanos primarios. Un inhibidor de gamma secretasa (GSI) que inhibe la vía de Notch y un shRNA orientación del gen diana Notch Hes1 se utilizaron para evaluar el papel de la vía de Notch en CSC mantenimiento de la población y el crecimiento del tumor de páncreas.
Resultados
se encontraron
componentes de la vía de Notch que se upregulated en células madre cancerosas pancreáticas. La inhibición de la vía de Notch usando ya sea un inhibidor de gamma secretasa o Hes1 shRNA en células de cáncer pancreático redujo el porcentaje de células madre cancerosas y tumorsphere formación. Por el contrario, la activación de la vía de Notch con un ligando de péptido Notch exógeno aumentó el porcentaje de células madre cancerosas, así como tumorsphere formación. Tratamiento in vivo de tumores de páncreas ortotópico en ratones NOD /SCID con GSI bloqueado el crecimiento tumoral y redujo la población CSC.
Conclusión
La vía de señalización Notch es importante en el mantenimiento de la población CSC de páncreas y es una posible diana terapéutica en el cáncer de páncreas
Visto:. Abel EV, Kim EJ, Wu J, M Hynes, Bednar M, Proctor E, et al. (2014) la vía de Notch es importante para mantener la población de células madre del cáncer en el cáncer pancreático. PLoS ONE 9 (3): e91983. doi: 10.1371 /journal.pone.0091983
Editor: Martín Fernández-Zapico, Centro de Schulze para nuevas terapias, Clínica Mayo, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Enero, 2014; Aceptado: 15 Febrero 2014; Publicado: 19 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Abel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Premio de Randy Pausch Familia AACR-PANCAN Innovación (DMS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en los Estados Unidos a pesar de ser la 10
ª diagnóstico de cáncer más común [1]. La alta tasa de mortalidad se debe en parte al hecho de que la gran mayoría de los cánceres de páncreas son diagnosticados en una etapa avanzada. Pero, al menos, igual de importante es que los cánceres de páncreas son generalmente sólo mínimamente sensible a la quimioterapia y la radioterapia. Hay evidencia creciente de que esta resistencia al tratamiento es al menos en parte debido a la resistencia inherente de una subpoblación de células cancerosas que son tumorigénicos y comparten muchas propiedades con células madre y células madre cancerosas por lo tanto han sido marcados (CSC). Las células madre del cáncer se aislaron por primera vez en la leucemia mieloide [2] y se mostró a compartir propiedades de células madre como potencial de auto-renovación y la capacidad de diferenciarse y proliferar. Posteriormente, los CAC también se han identificado en una amplia gama de tumores sólidos incluyendo cáncer de mama, cerebro, hígado, colon, próstata, melanoma, y tumores pancreáticos [3] - [10] _ENREF_3. Las células madre de cáncer de páncreas (CSC) se aislaron por primera vez de los cánceres pancreáticos humanos utilizando el marcador de ESA perfil
+ /CD44
+ /CD24
+ [10]. Estas células madre cancerosas positivas marcadores fueron capaces de formar tumores en ratones NOD /SCID que parecían histológicamente similar al tumor primario, lo que sugiere multi-potencia con la reconstitución de los diversos tipos de células tumorales. En pruebas in vitro para un fenotipo de células madre tales como la auto-renovación fue demostrado por la capacidad para formar esferas tumorales
in vitro Hoteles en contraste con la ESA
- /CD44
- /CD24
- Las células que no podía.
se mantiene no se entienden completamente cómo páncreas se mantienen las células madre del cáncer en un tumor heterogéneo. Un contribuyente potencial para el mantenimiento CSC es la vía de señalización Notch. En el páncreas en desarrollo normales, la vía de señalización de Notch se ha demostrado que es un importante regulador del equilibrio entre la auto-renovación y diferenciación [11] - [13]. Hay 4 miembros de la familia del receptor Notch mamíferos (NOTCH 1-4) que se procesan y se activa de manera similar a través de una serie de eventos de escisión. El receptor Notch madura se compone de dos subunidades que se generan como resultado de un evento inicial de escisión por furina convertasa [14]. activación de la vía de señalización Notch se produce cuando un receptor Notch se une a uno de los cinco ligandos Notch conocidas [Jagged1 (JAG1), Jagged2 (JAG2), delta-como 1 (DLL1), delta-como 3 (DLL3), y delta-como 4 (DLL4)]. La unión del ligando provoca un cambio conformacional en el receptor Notch que permite una segunda escisión por factor de necrosis tumoral-alfa-enzima de conversión (TACE) [15]. Un tercer evento de escisión se lleva a cabo por un secretasa gamma (presenilina), que libera el dominio intracelular de Notch lo que le permite trasladar al núcleo para activar la expresión de genes diana [16].
La inhibición de la señalización Notch resultados de la vía en el agotamiento de las células pancreáticas progenitoras multipotentes [11], [13]. Por el contrario, la activación Notch inducida impide la diferenciación epitelial pancreático y resulta en un mayor mantenimiento de las células progenitoras pancreáticas no diferenciadas [12]. Sobre la base de las características fenotípicas similares exhibidas por los CAC, la vía de señalización Notch ha sido evaluada por su papel en CSC auto-renovación. Ambas células madre cancerosas de mama y cerebro se ha demostrado que han aumentado activación de la vía de Notch [17], [18]. Inhibición in vitro de la ruta de señalización Notch en estos dos tipos de resultados tumorales en la disminución de la auto-renovación, que se muestra por la reducción en la formación de tumorsphere. La hipótesis de que la vía de señalización Notch es más regulada al alza en CSC de páncreas y contribuye a la función pancreática CSC y la tumorigénesis cáncer de páncreas.
En este estudio, se evaluó el papel de la vía de Notch en el mantenimiento de la población CSC y sus efectos de la inhibición en el crecimiento del tumor de páncreas. Detectamos la regulación positiva de varios componentes de la vía de Notch en células madre cancerosas pancreáticas y demostramos que la inhibición por un inhibidor de gamma secretasa o shRNA a Hes1, un gen clave de destino Notch, reduce páncreas CSC auto-renovación y tumorigenicidad. Tratamiento in vivo de tumores de páncreas ortotópico establecidos con un inhibidor de gamma secretasa reduce el crecimiento del tumor y la combinación con la quimioterapia citotóxica más aumenta la respuesta anti-tumor. Nuestros resultados sugieren que la señalización Notch es crítica para el mantenimiento CSC pancreático y que la orientación de la vía de señalización de Notch en el cáncer pancreático tiene un potencial terapéutico prometedor.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
muestras de tejido de adenocarcinoma pancreático se obtuvieron de pacientes que se sometieron a procedimientos quirúrgicos dentro de la Universidad de Michigan Health System. se obtuvo antes de la recogida de tejido consentimiento informado por escrito de todos los sujetos de la investigación, y todos los protocolos que involucran muestras de pacientes fueron revisados y aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan Medical School (IRBMED). Original, copias en papel de todos los formularios de consentimiento informado por escrito se mantienen dentro de un archivo seguro de la Universidad de Michigan. Las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan Medical School (IRBMED) determinaron que este estudio se ajusta a las directrices aplicables, las regulaciones estatales y federales, y la Universidad de Michigan Garantía Federal (FWA) con el Departamento de Salud y Servicios Humanos (HHS). El IRBMED también aprobó todos los documentos de consentimiento por escrito, así como los procedimientos de consentimiento, para este estudio. El número Universidad de Michigan Federalwide Assurance para este estudio es FWA00004969, y el número de identificación del estudio Estudio de la Universidad de Michigan es HUM00025339.
Los anticuerpos y reactivos
Merck gamma secretasa inhibidor (MK-0752) era proporcionada por el Dr. Max Wicha (Universidad de Michigan) y se usó para el
in vitro Opiniones y
ex vivo
estudios. Gamma secretasa RO4929097 inhibidor fue proporcionado amablemente por Roche (Indianápolis, IN) y se utilizó para los
in vivo
estudios. ratón conjugado con PE anti-CD44 humano y de ratón conjugado con FITC anticuerpos anti-CD24 humanos se adquirieron de B.D. (Franklin Lakes, NJ). APC ratón conjugado ESA anti-humano se adquirió de Miltenyi Biotech y el ratón biotinilado anti-ratón de H2K se adquirió de Southern Biotech. anticuerpo Hes1 utilizado para la transferencia de Western se obtuvo del Dr. Xing Fan (Universidad de Michigan) o adquirido de MBL International (Woburn, MA). Notch1 y anticuerpos Notch1 escindidos se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) y el anticuerpo β-actina fue comprado a Sigma (St. Louis, MO). Matrigel se adquirió de B.D. (Franklin Lakes, NJ). Hes1 shRNA V2LHS clon 249784 fue adquirido de Applied abierto (Huntsville, AL). El /Serrate /Lag-2 (DSL) péptido delta (secuencia CDDYYYGFGCNKFCRPR) fue sintetizado por el Fondo de Estructura de Proteínas de la Universidad de Michigan.
aprobación Protocolo
Animal protocolos fueron aprobados por el Comité para la Universidad Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) en la Universidad de Michigan y protocolos de lentivirus fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (CIB) de la Universidad de Michigan.
Preparación de suspensiones de células individuales de células tumorales
Individual suspensión celular de las células tumorales se preparó como se describe [10] con las siguientes modificaciones. adenocarcinoma de páncreas tejido de xenoinjerto humano primario fue picada por completo y después se suspendió en 200 unidades /ml de colagenasa IV ultrapura (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) en Media 199 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de la digestión enzimática a 37 ° C durante 45 a 60 minutos y disociación mecánica pipeteando cada 15 minutos con un ml de la pipeta 10, la digerido y se disociaron las células se filtraron a través de un 40 micras restrictor de células de malla de nylon (BD Franklin Lakes, NJ) y se lavaron con HBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA) dos veces. Las células se resuspendieron en 2% de FBS en HBSS para los experimentos.
citometría de flujo
La citometría de flujo se realizó como se describe anteriormente [10]. Las células disociadas se contaron y se transfirieron a tubos de 5 ml, se lavaron con HBSS /2% de FBS dos veces y se resuspendieron en HBSS /2% de FBS a una concentración de 1 millón de células por 100 mL. Se añadió Sandoglobin (1 mg /mL) a la muestra a una dilución de 1:50 y la muestra se incubó en hielo durante 20 min, después se lavó dos veces con HBSS /2% de FBS. Los anticuerpos de ratón conjugado con PE anti-CD44 humano, CD24 conjugado con FITC anti-humano de ratón, ratón conjugado APC ESA anti-humano y el ratón biotinilado anti-ratón de H2K se añadieron a la dilución como se indica, y la muestra se incubó durante 45 min en hielo y después se lavó dos veces con HBSS /2% de FBS. Estreptavidina conjugada con APC-Cy7 se añadió a la dilución de 1:200 y la muestra se incubó en hielo durante 15 minutos. Después de lavar dos veces con HBSS /2% de FBS, las células se resuspendieron en HBSS /2% de FBS que contiene 3 M 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). La citometría de flujo se realizó utilizando un FACSAria (B., Franklin Lakes, NJ). dispersión lateral y perfiles de dispersión frontal se utilizan para eliminar los dobletes de células
PCR cuantitativa
Los cebadores para componentes de la vía de Notch se seleccionaron a partir de un banco de imprimación. (Wang & amp; Seed, 2003) y sintetizados por Invitrogen (Carlsbad, CA). ARN total fue extraído a partir de células madre del cáncer ordenados y células madre no cancerosas usando un kit RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones. La transcripción inversa de ADNc se realizó a través de alta capacidad de cDNA de transcripción inversa Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones. qPCR se realizó en Rotorgene 6000 (Qiagen, Valencia, CA) usando un SYBR Green PCR Master Mix de alimentación (Applied Biosystem, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante, con todas las reacciones normalizaron a GAPDH. Las condiciones utilizadas para la qPCR fueron 95 asimiento ° C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95 ° C durante 10 segundos, 60ºC durante 15 segundos y 72 ° C durante 20 segundos.
culturas Tumorsphere
Establecido tumorspheres cáncer de páncreas [10] se mantuvieron en medios esfera como se describe anteriormente [19], [20], con modificaciones [50% NeuralBasal (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% N2 suplemento (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2% de suplemento B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de antibiótico-antimicótico (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ng /mL BMP4 (Sigma), 10 ng /ml de LIF (Sigma), 20 ng /ml bFGF humano 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), todos en 01:01 DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)]. Tumorspheres se pasaron cada 6 días. Para los pases, tumorspheres se disociaron con tripsina al 0,05% durante 2-5 min y después se lavaron inmediatamente dos veces con 40 ml de PBS. Las células se hicieron pasar a través de un filtro de células de malla de nylon de 40 micras, se contaron y se sembraron en medio fresco en la esfera Costar de muy bajo apego placas de 6 pocillos (Corning, Lowell, MA).
GSI tratamiento de células tumorsphere
Tumorspheres se disociaron en células individuales y de re-suspendieron en medio de la esfera que contiene GSI a las concentraciones indicadas para los períodos de tiempo señalados. Las células fueron observadas bajo un microscopio o cosechadas para el análisis.
Western blotting
Las células tratadas con o sin GSI a varias dosis se lisaron en tampón de lisis (20 mM Tris pH 7,5 /NaCl 150 mM /12 mM EDTA /10% de glicerol /1% de Triton X-100) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) y PhosphoStop (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). La concentración de proteínas se midió utilizando un ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Cincuenta g de proteína se mezcló con un volumen igual de tampón de carga 2x SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se hirvió durante 5 min antes de aplicar la muestra a SDS-PAGE. Después de SDS-PAGE, el gel de proteína se transfirió sobre una membrana de nitrocelulosa Hybond C extra (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA) usando un aparato de transferencia Bio-Rad (BioRad, Hercules, CA) durante una hora. La transferencia se bloqueó con leche en polvo al 5% en TBST durante una hora, se lavó dos veces en TBST, y luego incubadas con anticuerpos (1:1000) en 5% de BSA a 4 ° C durante la noche. La transferencia se lavó tres veces en TBST y después se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en la leche en polvo al 5% a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces en TBST, la transferencia se incubó durante 5 minutos con SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Pierce, Rockford, IL) y la película de rayos X (Denville Científica, Metuchen, NJ) y luego fue desarrollado.
shRNA transductioin
Lentivirus construcciones de vectores que contiene pGIPZ Hes1 shRNA o control shRNA se hicieron en el núcleo del vector de la Universidad de Michigan. La transducción se realizó con un kit ViraDuctin Lentivirus transducción (celulares Biolabs, Inc. de San Diego, CA) según las instrucciones.
Apoptosis ensayo
Tumorsphere células transducidas con el control o Hes1 shRNA fueron cultivadas en medios de ámbito que contiene 4 mg /ml de puromicina para 4 días, seguido de tripsinización y lavado PBS. Las células se filtraron a través de una malla de nylon de 40 micras para obtener suspensiones de células individuales. Las células individuales resultantes se fijaron con etanol enfriado con hielo 50% en PBS durante la noche. Las células fueron teñidas con PI y FITC-anexina V usando un Anexina V:. FITC Apoptosis Detección Kit II adquirió de BD Biosciences (San José, California)
tratamiento de DSL tumorspheres
esferas se disocia en células individuales y re-suspendieron en medio de la esfera que contiene péptido DSL a las concentraciones indicadas durante los tiempos indicados. se observaron células tratadas bajo el microscopio o cosechadas para el análisis
.
tratamiento ex vivo de GSI tumorspheres y la implantación en ratones NOD /SCID
células individuales disociadas de tumorspheres se cultivaron en medio que contiene DMSO esfera o 8 M GSI durante 48 horas antes de ser disociado con tripsina y se tiñeron con DAPI y un anticuerpo para H2K. Las células fueron ordenados por FACS y se recogieron las células negativas DAPI negativo y H2K para obtener un vivo pura, la población de células de cáncer de páncreas humano. Después de lavar con HBSS, células clasificadas se resuspendieron en un medio de esfera. La viabilidad celular se validó utilizando azul de tripano (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cuarenta mil células en 50 l de medio se mezclaron con un volumen igual de Matrigel y se inyectan por vía subcutánea en la región midflank de ratones NOD /SCID mediante una aguja de calibre 23. Se inyectaron cinco ratones para cada grupo de tratamiento. El tamaño del tumor se midió semanalmente. Los tumores no se les permitió superar los 2 cm de diámetro antes de la eutanasia. Además, los animales fueron controlados diariamente por la Universidad de Michigan personal veterinario y se sacrificaron en cualquier signo de sufrimiento o pérdida de peso. Al final de los animales de estudio fueron sacrificados por asfixia con dióxido de carbono seguido por dislocación cervical para asegurar la muerte.
ortotópico implantación de células de tumor pancreático en ratones NOD /SCID y tratamiento GSI
células tumorales pancreáticas se incubaron con lentivirus luciferasa que expresan durante la noche se lavaron con suero libre de HBSS y se suspendieron en una mezcla de PBS /Matrigel (01:01 volumen) a la concentración de 10 millones de células /ml para la implantación. Los ratones fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de 100 mg /kg de ketamina y 5 mg /kg de xilazina, y se realizó una pequeña incisión subcostal izquierda. 500.000 células tumorales a granel en un volumen de 50 l se inyectaron en la cola del páncreas usando una aguja de calibre 30. La buprenorfina se administró cada 6 horas durante las primeras 24 horas después de la cirugía para aliviar el dolor. El tratamiento con quimioterapia se inició 2 semanas después de los tumores fueron detectables. Tres tumores pancreáticos humanos con pocos pases individuales de xenoinjertos fueron incluidos en el análisis. Había 4 grupos de ratones: control, RO4929097 (GSI), gemcitabina, y GSI y gemcitabina, con 5 ratones por grupo. Los animales fueron evaluados por el crecimiento y formación de imágenes de tumores bioluminiscente se evaluó semanalmente. GSI (30 mg /kg) se administró por sonda oral a la frecuencia de 5 días en 2 días de descanso. Esta programación se utiliza para minimizar la diarrea inducida-GSI secundaria a la hiperplasia de células caliciformes [21]. La gemcitabina (50 mg /kg) fue entregado semanalmente por inyección intraperitoneal, como se describe anteriormente [22]. El tratamiento se administró durante 4 semanas a las que los animales de punto fueron sacrificados por asfixia con dióxido de carbono seguido por dislocación cervical para asegurar la muerte. Antes de sacrificar los animales se controlaron diariamente por la Universidad de Michigan personal veterinario y se sacrificaron en cualquier signo de sufrimiento o pérdida de peso. Se realizó necropsia y los tumores fueron extirpados para su análisis.
bioluminiscente de imágenes
Bioluminiscente de imágenes de tumores ortotópico implantados en ratones se realizó con un sistema IVIS 200 Xenogen Imaging (Xenogen Biosciences, Cranbury, NJ) como descrito anteriormente [23].
La inmunohistoquímica
Las muestras de tejido fueron fijadas en formalina al 10% tamponada con fosfato y se incluyeron en parafina. , secciones incluidas en parafina fijadas en formalina fueron cortadas de 4 m de espesor, se montaron en portaobjetos de poli-L-lisina (Sigma), y se secaron durante la noche a 37 ° C. Las secciones fueron desparafinados en xileno, rehidratada de acuerdo con procedimientos histopatológicos estándar, y se tiñeron con H & amp; E. La inmunodetección se realizó utilizando el Kit de DakoCytomation LSAB + según el protocolo del fabricante (Dako, Dinamarca). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina y se cubren con VectaMount medio de montaje (Vector Labs, Burlingame, CA). Cada sección manchado se evaluó a continuación mediante microscopía.
TUNEL ensayo
análisis TUNEL se realizó utilizando el kit Promega TUNEL ensayo (Promega, San Luis Obispo, CA) según las instrucciones del fabricante. núcleos de las células apoptóticas se visualizaron como una señal fluorescente de color amarillo-verde bajo microscopía de fluorescencia. Los núcleos celulares se counterstained con DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA).
Reactivos adicionales
RO4929097 para el trabajo in vitro fue adquirido de Selleck Químicos (Houston, TX).
oligonucleótidos para QRT-PCR
se utilizaron las siguientes secuencias: 5'-Hes1 GAGAGGCGGCTAAGGTGTTTG-3 'y 5'-CTGGTGTAGACGGGGATGAC-3', 5'-GLI1 GGCTGGACCAGCTACATCAAC-3 'y 5'-TGGTACCGGTGTGGGACAA-3 ', 5'-GLI2 GCAAATGAAAGCCAGGGAAC-3' y 5'-ATCTCAGGAAGGCGATGAAC-3 ', 5'-PTCH1 TATCCAGCACTTACTTTACGACCT-3' y 5'-ATCCTGAAGTCCCTGAAGCC3 ', y GAPDH 5'-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3' y 5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 '.
el análisis estadístico
los datos se expresan como la media ± sE Diferencias estadísticamente significativas se determinaron por
t de Student
y
Χ
2 análisis o la prueba de Mann-Whitney en su caso, y se define como
P Hotel & lt; 0.05.
resultados
vía de señalización Notch está regulada positivamente en las células madre del cáncer de páncreas
La vía de señalización Notch se ha demostrado ser activado en las células de cáncer de páncreas [24]. La hipótesis de que los componentes de vía de señalización Notch pueden ser regulados por incremento adicional en la subpoblación de células madre del cáncer de páncreas. El uso de xenoinjertos de cáncer de páncreas humanos primarios a partir de 8 tumores diferentes de pacientes se evaluaron los niveles de expresión de componentes de la ruta de señalización Notch en células madre de cáncer en comparación con las células tumorales a granel. Los tumores de xenoinjertos se aislaron y se procesaron en suspensiones de células individuales que fueron luego ordenados en función del perfil triple marcador CD44 + /CD24 + /+ ESA para obtener células madre cancerosas y por separado no células madre cancerosas (Figura 1A). Se realizó análisis cuantitativo de RT-PCR de ARN obtenido de células madre cancerosas y no células madre cancerosas para la expresión de componentes de la vía de señalización de Notch. Los resultados sugieren la regulación positiva de componentes de la vía de Notch en células madre cancerosas por encima de la de la no-células madre cancerosas (Figura 1B). Los CCC en 6 de 8 tumores expresan al menos un receptor Notch en una gt nivel y; 1,5 veces más que la no-CSC. Del mismo modo, al menos un ligando Notch se upregulated & gt; 1,5 veces en la CSC sobre los no CSC en 6 de 8 tumores. Es de destacar, que no detectó la expresión de cualquiera de los receptores de ligando Notch4 DLL3 en cualquiera de los compartimentos no CSC CSC o en cualquiera de los xenoinjertos primarios probados (datos no mostrados). Hubo una media 1,75 veces mayor expresión del gen diana vía Notch Hes1 en las células madre cancerosas en comparación con no CSC. Estos resultados sugieren que las CSC diferencialmente expresar mayores niveles de componentes de la ruta Notch y que la vía se activa correspondientemente como se muestra por una mayor expresión de Hes1.
A. Citometría de flujo análisis. células de xenoinjertos de cáncer disociadas de paso bajo humanos pancreáticas fueron teñidas con DAPI y anticuerpos para H2K, ESA, CD24 y CD44. DAPI células muertas positivas y células de ratón positivo H2K ambos fueron eliminados del análisis. La población CSC (ESA con marcador de superficie
+ /CD44
+ /CD24
+) estaba cerrado por tanto P5 y P7, y la población no CSC de P6. B. Transcripción niveles de componentes de la vía de Notch en CSC en comparación con la no-CSC obtenido por qPCR, normalizado a GAPDH. El cambio medio pliegue entre los tumores está representado por una barra horizontal.
inhibición vía Notch
En base a la observación de que la señalización Notch componentes de la vía se upregulated en el cáncer de páncreas y, en particular, CSC de páncreas , se estudió además la contribución de la activación de la vía de Notch para la función pancreática CSC. Gamma secretasa cataliza la tercera etapa de escisión del receptor Notch que libera el dominio intracelular Notch. Este paso permite que el receptor Notch a continuación, trasladar al núcleo y activar la señalización de Notch, lo que resulta en la regulación positiva de la expresión de genes objetivo. La inhibición de la secretasa gamma con un inhibidor de gamma secretasa puede pues bloquear la activación de la vía de señalización de Notch. La incubación de tumorspheres cáncer de páncreas con dosis crecientes de GSI reduce los niveles de expresión del gen diana Notch Hes1 de una manera dependiente de la dosis (Figura 2A, B) (p & lt; 0,001 vs. el control). Después de haber confirmado que GSI puede inhibir la señalización Notch en las células de cáncer de páncreas, el próximo evaluó el efecto de la inhibición de la vía de Notch específicamente en el compartimiento del CSC. células de cáncer pancreático tratados con GSI mostraron una reducción significativa en los CAC con el SEC
+ /CD44
+ /CD24
+ perfil marcador en comparación con las células no tratadas (control de 2,76 ± 0,16% vs. 1,43 ± 0,15% con GSI p = 0,013) (Figura 2 C, D). Este resultado sugiere un papel para la activación de la vía de Notch en el mantenimiento de CSC.
A. tumorspheres celulares de cáncer de páncreas primarios (derivados de paciente 5) se cultivaron en medio esfera que contiene diferentes concentraciones de GSI como se indica durante 48 horas antes del análisis de transferencia de Western con un anticuerpo para Hes1 o β-actina. B. La cuantificación de los niveles de ARNm de Hes1 después del tratamiento GSI durante 48 horas (* P & lt; 0,001 vs. el control). células de cáncer de páncreas en C. medio esfera se trataron con vehículo de control (DMSO) o 8 M GSI durante 48 horas. El análisis FACS de las células tratadas con DMSO de control (
panel superior
) y GSI células tratadas (
panel inferior
). población CSC con el marcador de la superficie de la ESA
+ /CD44
+ /CD24
+ fue identificado por esas células, tanto en puertas P5 y P7. D. La cuantificación de la ESA
+ /CD44
+ /CD24
+ población CSC siguiente DMSO y tratamiento GSI (* p = 0,013 vs DMSO).
Una de las la definición de características de células madre cancerosas es auto-renovación que se puede ensayar in vitro mediante la medición de tumorsphere formación a través de múltiples pasajes. Células madre cancerosas pancreáticas identificados con el SEC marcador perfil
+ /CD44
+ /CD24
+ tienen la capacidad de formar esferas en condiciones no adherentes que las diferencia de las células madre no cancerosas que carecen de esta habilidad [10]. Tener una inhibición dependiente de la dosis observada de la vía de Notch con dosis crecientes de GSI y el consiguiente descenso en el porcentaje de CSC de páncreas, se evaluó el impacto funcional sobre la función CSC probando los efectos de GSI en tumorsphere ensayos. De acuerdo con un efecto dependiente de la dosis en la inhibición de la vía Notch, el tratamiento de células de cáncer pancreático con GSI causó una disminución dependiente de la dosis en la frecuencia de formación tumorsphere primaria (Figura 3A, p & lt; 0,01 vs. control)
A.. células de cáncer pancreático tumorspheres cultivaron durante 5 días en un medio de esfera que contiene concentraciones indicadas de GSI. Imágenes representativas de tumorspheres primarios que se desarrollaron a partir de 1000 células por pocillo se cultivaron con concentraciones crecientes de GSI. La cuantificación del número de tumorspheres primarios (barras negras) formados en cada concentración con 1000 células sembradas por pocillo (* p & lt; 0,01 vs. control). formación tumorsphere Secundaria (barras grises) de tumorspheres tratados con GSI se disociaron en células individuales, se lava, y se cultivaron durante 5 días en medio normal sin esfera GSI (** p & lt; 0,01 vs. control). B. Tumorspheres trató con GSI a concentraciones crecientes teñidas con yoduro de propidio (PI) y FITC-anexina V (ANV) y se analizó por citometría de flujo para evaluar la extensión de la apoptosis (* p & lt;. 0,05 8 M vs. control, ** p & lt; 0,01 16 M vs. control). Análisis del ciclo celular de C. tumorspheres páncreas tratados con control de DMSO o GSI a 0, 24, 48, y 72 hrs. (* P & lt; 0,01 frente al control). células de cáncer de D. pancreáticas cultivadas ya sea con 8 M GSI o vehículo de control (DMSO) durante 48 horas inyectados por vía subcutánea en ratones NOD /SCID. Imágenes representativas de los ratones implantados con células de los grupos de tratamiento indicados tomadas 21 días después de la inyección. Las flechas indican la ubicación de los tumores. tumor de serie el tamaño de las mediciones de los ratones tratados con el control de DMSO o GSI en los puntos de tiempo indicados. N = 5 (* p & lt; 0,01 frente al control).
Para determinar si la inhibición observada de la formación tumorsphere se conservó después de la exposición transitoria a Notch inhibición, tumorspheres tratados se disociaron en células individuales y de re -cultured en medios esfera normal sin GSI. En particular, el efecto sobre la formación de tumorsphere se conserva incluso después de la eliminación del inhibidor de gamma secretasa, como se evidencia por la generación disminuida de tumorspheres secundarias (Figura 3A, p & lt; 0,01 vs. control).
Un efecto de GSI en apoptosis podría explicar esta reducción en tumorsphere formación. De hecho, se observó un aumento de la tasa de apoptosis basado en PI y AnnexinV tinción de las células de en tumorspheres tratados con GSI en comparación con tumorspheres tratados con vehículo (Figura 3B, p & lt; 0,05 8 M frente a control, p & lt; 0,01 16 M vs. controlar). Este resultado sugiere que la apoptosis contribuye a la disminución de tumorsphere capacidad de formación de las células tratadas con GSI. También se realizó el análisis del ciclo celular en ausencia y en presencia de GSI que reveló aumento de la acumulación de células en G1 con GSI comparación con el control (p & lt; 0,01). la progresión del ciclo celular alterada puede, por tanto, también contribuyen a la reducción de la formación de tumorsphere con la inhibición de la vía de señalización Notch con GSI (Figura 3C)
.
Con el fin de validar este observó un efecto funcional de la inhibición de la vía de Notch in vitro, estudiamos si el pretratamiento con GSI podría inhibir la formación de tumores in vivo. En este ensayo, se trataron previamente establecidos células del cáncer pancreático como tumorspheres con GSI durante 48 horas y luego se implantaron células viables, tratados por vía subcutánea en ratones NOD /SCID (5 ratones por grupo). Las células que estaban sin tratar tumores formados 5 días antes que los tratados previamente con GSI y crecieron significativamente mayor (p & lt; 0,01) que las que emanan de las células pre-tratadas con GSI (Figura 3D)
inhibición vía de Notch usando Hes1. shRNA
Como se observa en la Figura 1B, el nivel de ARNm de Hes1, un objetivo /efector directa de Notch de señalización, se reguló en células madre cancerosas en comparación con los no-células madre cancerosas en varios xenoinjertos primarios. Upregulation de Hes1 se observó consistentemente en xenoinjertos, en contraste con otros objetivos Notch tales como HEY1 y Heyl (datos no mostrados). Con el fin de evaluar si los efectos observados de GSI fueron específicamente el resultado de la inhibición de la vía de señalización Notch y no fuera de objetivo efectos, se utilizó construcciones lentivirales que expresan control y Hes1 shRNA para dirigirse específicamente a Hes1. Desmontables de Hes1 por shRNA fue confirmada tanto en el mRNA (p & lt; .001 control frente) y los niveles de proteína (Figura 4A, B) y no afectó aguas arriba de escisión de Notch 1 (Figura 4B). Regulación a la baja de Hes1 dio lugar a alteración de la formación tumorsphere (Figura 4 C, D, p & lt; 0,001 frente al control). Dar más pruebas de que la activación vía Notch contribuye a la función pancreática CSC
A. cáncer de páncreas células transducidas con el control o Hes1 shRNA cosechado después de cultivar durante 4 días. los niveles de transcripción Hes1 cuantificó mediante qRT-PCR, normalizado para GAPDH (* p & lt; 0,001 frente al control). B. Los lisados celulares se sometieron a transferencia Western para Hes1, Notch1, se escindió Notch1, o β-actina.